人酪氨酸蛋白激酶Lyn的真核表达、纯化及鉴定

[目的]构建含人酪氨酸蛋白激酶Lyn基因的载体并进行真核表达、纯化和研究其对细胞增殖的影响。[方法]提取人Hela细胞总RNA,用RT-PCR方法获得Lyn基因并克隆至pcDNA3.1(-)载体。经双酶切、PCR和测序方法鉴定后,将重组质粒瞬时转染HEK 293T细胞表达目的蛋白,应用组氨酸标签镍离子螯合磁珠纯化融合蛋白,通过Western Blot检测蛋白的表达及纯化,并用CCK-8法检测过表达Lyn后细胞增殖能力的变化。[结果]成功构建真核表达质粒pcDNA3.1(-)-Lyn并进行瞬时表达和蛋白纯化,CCK-8法检测过表达Lyn的HEK 293T细胞的增殖能力显著性下降(P0.01)。[结论]Lyn在HEK 293T细胞中成功瞬时表达及纯化,并可以使细胞的增殖能力受到明显抑制,为稳定表达和深入研究其生物学功能及作用机制奠定基础。     

IFN-λ1在HEK293T细胞中表达纯化及活性检测

[目的]构建IFN-λ1真核表达质粒,利用人胚胎肾HEK293T细胞表达系统,获得具有良好生物学活性的IFN-λ1重组蛋白。[方法]将IFN-λ1目的基因克隆到pcDNA3.1+载体NheⅠ与XhoⅠ多克隆位点构建pcDNA3.1-IFN-λ1分泌表达质粒,并将其转染到HEK293T细胞中;采用Ni-NTA亲和层析方法分离纯化重组蛋白,SDS-PAGE和蛋白免疫印迹(Western Blotting)检测IFN-λ1的表达与纯度;采用qPCR、WB结合显微镜观察检测IFN-λ1的生物学活性。[结果]IFN-λ1真核表达质粒构建正确,而且能够在HEK293T细胞中分泌表达重组蛋白,分离纯化的IFN-λ1能够有效地诱导ISG15、ISG54、ISG56、OAS1、TNFα、MX1和TRAIL等凋亡相关基因的表达,激活p38促凋亡信号通路,抑制水泡性口炎病毒对BHK-21细胞的感染。[结论]成功构建了pcDNA3.1-IFN-λ1真核表达质粒,能够在HEK293T细胞中分泌表达IFN-λ1重组蛋白;分离纯化的IFN-λ1重组蛋白具有潜在的抗肿瘤和抗病毒生物学活性,为进一步研究IFN-λ1的功能和临床应用奠定了基础。     

人Notch信号通路中Jagged1基因的克隆与真核表达

[目的]克隆人Notch信号通路中配体Jagged1基因并进行真核表达。[方法]采用RT-PCR的方法从Hela细胞总RNA中获取Jagged1基因,并克隆至携带FLAG标签的真核表达载体pCMV-Tag4。经酶切、PCR和测序鉴定后,将重组质粒Jagged1-pCMV-Tag4瞬时转染HEK 293T细胞,通过Q-PCR和Western blot检测目的蛋白的表达。[结果]成功构建了真核表达质粒Jagged1-pCMV-Tag4并在HEK 293T细胞中瞬时表达。[结论]Jagged1在HEK 293T细胞中实现瞬时表达,为稳定表达和进一步研究Jagged1/Notch信号通路奠定基础。     

人Notch配体DLL4基因的克隆及真核表达

[目的]构建真核重组质粒DLL4/pCMV-Tag4并进行瞬时表达,为进一步研究DLL4/Notch信号通路奠定基础。[方法]采用PCR的方法扩增人DLL4基因,并克隆于真核表达载体pCMV-Tag4中,通过酶切和测序鉴定后,瞬时转染HEK293 T细胞,荧光定量PCR和Western blot鉴定人DLL4的表达。[结果]成功构建了DLL4/p CMV-Tag4重组质粒并在HEK293T细胞中表达。[结论]人DLL4在HEK293T细胞中表达,为进一步研究DLL4/Notch信号通路奠定基础。     

PTPN6重组蛋白的真核表达纯化及功能鉴定

[目的]构建真核表达载体pENTER-PTPN6,在HEK293T细胞中表达并纯化,并初步探讨PTPN6对肺癌细胞系A549细胞增殖能力的影响。[方法]构建真核表达载体pENTER-PTPN6,利用jetPRIME分别转染HEK293T和A549细胞,用Western Blot检测PTPN6在细胞中的表达情况,并通过磁珠纯化PTPN6蛋白,最后利用CCK-8法检测PTPN6对A549的增殖影响并绘制细胞生长曲线。[结果]Western Blot结果显示转染细胞内有PTPN6的高表达,磁珠纯化得到高纯度的目标蛋白,而且转染后的肺癌细胞A549增殖能力较对照组显著下降。[结论]成功构建了真核表达质粒pENTER-PTPN6并在真核表达系统中表达和纯化,重组PTPN6具有抑制A549细胞的增殖的作用,为进一步探讨PTPN6基因的功能及寻找治疗肺癌新方向奠定了基础。     

肿瘤内皮标志物8同型物Ⅰ基因真核表达载体的构建及其在HEK293F细胞中的表达

目的:构建肿瘤内皮标志物8(TEM8)基因真核表达载体,实现TEM8在HEK293F细胞中的外源表达。方法:用PCR技术扩增TEM8基因,经限制性酶切、连接、转化,插入pcDNA3.1(+)-EGFP真核表达载体,并通过脂质体将TEM8表达质粒转染至HEK293F细胞中,Western印迹检测TEM8的表达。结果:PCR扩增得到TEM8基因,构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-TEM8-EGFP并转染HEK293F细胞,经G418加压筛选及有限稀释法得到生长性状良好、表达效率高的单克隆细胞系TEM8-EGFP/HEK293F;Western印迹证明过表达细胞系TEM8-EGFP/HEK293F显著表达TEM8蛋白。结论:构建了表达TEM8的重组HEK293F工程细胞系TEM8-EGFP/HEK293F,为进一步研究TEM8的生理功能奠定了基础。     

hTEM8-N-RFP融合蛋白真核表达载体的构建及在HEK293F细胞中表达

目的:构建人肿瘤内皮标志物8(hTEM8)胞外区(N端)与红色荧光蛋白(RFP)融合表达载体并在HEK293F细胞中表达,为进一步研究hTEM8的相互作用蛋白及其在肿瘤血管形成过程中的机制奠定实验基础。方法:以质粒pDsRed-Express-C1和重组质粒pcDNA3.1(+)-hTEM8/Fc为模板,PCR扩增RFP和hTEM8-N基因片段,先后插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达载体pcDNA3.1(+)-hTEM8-N-RFP,转染HEK293F细胞,通过荧光显微镜观察融合蛋白在转染细胞中的的表达,并用G418对转染的细胞进行加压筛选,Western blot检测hTEM8-N-RFP融合蛋白在转染细胞中的表达。结果:DNA测序、酶切鉴定的结果显示,表达载体pcDNA3.1(+)-hTEM8-N-RFP构建成功,且序列正确。转染后经荧光显微镜观察到HEK293F细胞中有红色荧光,经加压筛选单克隆后,在荧光显微镜下观察到稳定表达红色荧光的细胞株,Western blot检测到融合蛋白hTEM8-N-RFP在真核细胞HEK293F中获得表达。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-hTEM8-N-RFP真核表达载体,并在HEK293F细胞中表达,为后期研究hTEM8的相互作用蛋白和其生理功能奠定了良好的基础。     

伪狂犬病毒的gE蛋白胞外区真核表达以及单克隆抗体制备

旨在构建gE基因胞外区真核表达载体,在HEK293F细胞中表达并纯化得到稳定的可溶性蛋白,并通过杂交瘤筛选获得表达gE蛋白的特异性单克隆抗体。生物信息学方法分析gE基因序列,构建gE胞外区真核表达载体pcDNA3.4-gE-6×His和pcDNA3.4-gE-m Fc,通过瞬时转染的方法在HEK293F细胞中进行表达并进一步纯化。通过Western blot和SDS-PAGE鉴定和比较gE-6×His和gE-mFc融合蛋白表达情况。利用伪狂犬灭活全病毒免疫小鼠,电融合获得杂交瘤融合细胞,通过gE-mFc蛋白和IFA筛选出稳定且特异性结合gE蛋白的阳性杂交瘤细胞株。结果表明,成功构建pcDNA3.4-gE-6×His和pcDNA3.4-gE-mFc表达载体,表达纯化得到gE-6×His和gE-mFc可溶性蛋白。比较发现gE-6×His蛋白表达量低,稳定性差。而gE-mFc蛋白表达量高,稳定性好,一次性纯化后纯度可达85%。进一步利用gE-mFc筛选获得9株稳定性和特异性高的阳性杂交瘤细胞株。首次利用哺乳动物细胞表达系统表达并获得稳定的可溶性gE蛋白,并利用其筛选获得g E特异性单克隆杂交瘤细胞株。     

重组人SHH蛋白N端在HEK293T细胞中的分泌表达与鉴定

目的:获得有活性的Sonic Hedgehog(SHH)蛋白N端结构域蛋白纯品,该结构域是SHH蛋白与受体结合结构域,可用作抗原,用于研制抗SHH的中和抗体。方法:应用PCR技术从商业化人Shh基因中分别扩增该基因5'端591和600 bp的片段,并插入真核表达载体pL293,分别在HEK293T细胞中进行瞬时分泌表达,通过His标签纯化后获得SHH-591和SHH-600蛋白纯品,SDS-PAGE和Western印迹对表达产物进行分析,并通过ELISA进行结合活性鉴定。结果:构建了重组表达载体pL293-Shh-N591和pL293-Shh-N600,酶切鉴定和测序证实含有目的基因片段,真核瞬时表达产物均在相对分子质量约20×103处可见与预期相符的条带,该条带可被His标签抗体所识别;纯化获得了SHH-591-His和SHH-600-His蛋白纯品;ELISA结合实验结果显示SHH-591-His和SHH-600-His均能与抗His标签抗体结合,而SHH-591-His与SHH中和抗体的结合能力更强。结论:获得了真核表达的SHH-N蛋白SHH-591-His,可用于下一步中和抗体药物的筛选和后续研究。     

重组人骨桥蛋白在哺乳动物细胞中的表达、纯化和活性研究

旨在运用哺乳动物表达载体的瞬时转染技术,转染人类胚胎肾细胞(Human Embryonic Kidney 293E,HEK293E),分泌性表达和纯化带His标签的重组人骨桥蛋白(Recombinant Human Osteopontin,rhOPN),并研究其促结肠癌以及非小细胞肺癌细胞增殖功能。合成和构建OPN融合6×His标签重组蛋白的表达载体pcDNA3.1-OPN,利用聚醚酰亚胺(Polyetherimide,PEI)瞬时转染法将pcDNA3.1-OPN转染到HEK293E细胞中,并用镍亲和层析柱对rhOPN进行纯化。SDS-PAGE电泳和Western Blot被用来检测纯化后的rhOPN蛋白在凝胶上的迁移率和纯度。此外,ELISA方法被用于测定rhOPN与抗OPN抗体间的结合能力,并用CCK-8(Cell Counting Kit-8)方法初步研究rhOPN蛋白对结肠癌及非小细胞肺癌细胞增殖的影响。结果显示,通过将pcDNA3.1-OPN瞬时转染HEK293E细胞,成功表达和纯化出纯度达95%的rhOPN,且rhOPN可以被抗OPN抗体很好的识别。rhOPN被证实在36μg/ml浓度时即可显著促进体外培养的HT29细胞增殖,在20μg/mL时能够促进体外培养的非小细胞肺癌H1299及HCC827细胞增殖。运用哺乳动物细胞瞬时转染技术,在HEK293E细胞中成功表达并纯化出高纯度的rhOPN蛋白,并发现rhOPN可以显著促进结肠癌及非小细胞肺癌细胞增殖,具有良好的生物学活性。     

非受体型酪氨酸激酶JAK1基因真核表达质粒的构建与真核表达

[目的]构建非受体型酪氨酸激酶JAK1(nonreceptor tyrosine kinase-JAK1)基因真核表达质粒pcDNA4.0-HisJAK1,并转染293T细胞进行真核表达。[方法]从Hela细胞中提取总的RNA,通过RT-PCR获得JAK1基因全长c DNA序列,并将其克隆至真核表达载体pcDNA4.0-His中,构建重组质粒pcDNA4.0-His-JAK1。将真核重组表达质粒转染293T细胞,转染48 h后,在荧光显微镜下观察转染情况。免疫印迹法检测JAK1蛋白转染24 h、36 h与48 h在293T细胞中的表达。[结果]经双酶切与质粒PCR鉴定质粒克隆正确,测序鉴定序列中第2199位碱基A突变为G,为同义突变,不影响氨基酸序列。转染293T细胞48 h后,间接免疫荧光实验显示在293T细胞中检测到绿色荧光。免疫印迹检测可见大小约为133 kDa的目的蛋白。[结论]成功获得JAK1基因全长序列,并成功构建pcDNA4.0-HisJAK1真核重组表达质粒,并在真核细胞293T中获得有效表达,为进一步研究JAK1蛋白质相互作用奠定了基础。     

新型冠状病毒S蛋白表达、纯化及应用

[目的]克隆严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)刺突糖蛋白(Spike,S蛋白),纯化重组蛋白为制备鼠多克隆抗体提供免疫原,并鉴定抗体活性。[方法]依据对S蛋白的氨基酸序列解析,设计并构建了S蛋白重组质粒S713 pcDNA3.1(+)-C-6His,经酶切和测序正确后,转入中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中进行诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达情况。表达产物利用Ni柱和分子筛纯化,目的蛋白混合免疫佐剂AS03免疫ICR小鼠,制备S蛋白多克隆抗体并对通过中和实验进行鉴定。[结果]成功构建重组质粒S713 pcDNA3.1(+)-C-6His,在CHO-K1细胞中S蛋白以可溶性形式表达。可溶性目的蛋白纯化后,蛋白纯度为94.4%,作为免疫原制备鼠多克隆抗体,抗体效价为1∶400,中和实验显示该多抗具有保护作用。[结论]成功诱导表达、纯化重组S蛋白并制备其多克隆抗体,为深入研究新冠病毒感染、发病机制及新型肺炎的防治奠定基础。     

人白细胞介素10受体α基因真核表达及与JAK1蛋白的相互作用的检测

构建含人白介素10受体α(IL-10RA)基因的真核表达质粒p ENTER-IL-10RA-His,并在HEK293中进行真核表达,并用免疫共沉淀检测JAK1与IL10RA在细胞内的相互作用。在He La细胞中提取人总RNA,通过RT-PCR获得人IL10RA的基因全长,并将其克隆至真核表达载体p ENTER-His中。经PCR扩增、双酶切、测序鉴定后,将重组质粒p ENTER-IL-10RA-His转染至HEK293细胞中。免疫印迹法检测IL-10RA蛋白在HEK293细胞中的表达。结果显示,经PCR扩增和双酶切,测序鉴定质粒克隆正确。免疫印迹可见63 k D的目的蛋白。共同转染JAK1和IL-10RA的质粒,免疫印迹可见分别为133 k D和63 k D的目的条带,免疫共沉淀鉴定了JAK1和IL-10RA的相互作用。IL-10RA基因成功构建在p ENTER-His中,并在HEK293细胞中成功表达,并成功共转染JAK1和IL-10RA质粒,免疫共沉淀检测两者的相互作用。这为JAK1和IL-10RA相互作用的机制研究奠定基础。     

猪内源性反转录病毒囊膜基因env真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建猪内源性反转录病毒(PERV)囊膜基因env的真核表达质粒pHCMV-env并加以鉴定,为研究PERV的细胞嗜性和宿主范围奠定基础。方法:用RT-PCR方法扩增五指山猪来源PERV的env基因,将其插入pGEM-T easy载体中,构建重组质粒pGEM-T-env,酶切鉴定正确后,将pGEM-T-env与pHCMV-VSV-G表达质粒同时经EcoRⅠ酶切消化后连接,构建重组表达质粒pHCMV-env,并进行酶切、测序鉴定;将鉴定正确的质粒pHCMV-env转染HEK293T细胞,采用PCR、RT-PCR检测转染后env基因的整合和转录情况。结果:扩增得到五指山猪来源PERV的env基因,并构建了pHCMV-env真核表达质粒,转染HEK293T细胞系后,该细胞系中有目的基因的整合和转录。结论:构建了真核表达质粒pHCMV-env,并且在HEK293T细胞中能够整合并转录,为研究PERV的细胞嗜性和宿主范围奠定了基础。     

人Smurf1基因真核表达质粒的构建和表达

[目的]构建人Smurf1基因的真核表达载体并检测其表达和细胞亚定位。[方法]PCR法从人胚肾细胞HEK-293T中扩增Smurf1基因的ORF序列,将其插入到带Flag标签的p CMV5真核表达载体,插入位点为限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ之间。酶切并测序鉴定该质粒的正确性。将成功构建的质粒Flag-Smurf1转染HEK-293T细胞和Hela细胞,Western Blotting检测Smurf1蛋白的表达情况;转染Mv. 1. Lu细胞,免疫荧光检测Smurf1蛋白在细胞中的亚定位。[结果]成功扩增出Smurf1基因的ORF序列;连入p CMV5中获得了质粒Flag-Smurf1;酶切鉴定得到2. 2 kb大小的片段,测序结果显示连入的是Smurf1基因的c DNA序列正确。Western Blotting结果显示该质粒可在HEK-293T细胞和Hela细胞中表达,表达大小约为80 k Da,符合预期。免疫荧光实验结果显示过表达的Smurf1主要定位在细胞膜上。[结论]成功构建了带Flag标签的人Smurf1基因的真核表达质粒,该质粒可在细胞中顺利表达。     

小鼠白细胞介素IL-35基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

[目的]构建小鼠白细胞介素IL-35基因慢病毒表达载体并鉴定。[方法]通过PCR法扩增出小鼠IL-35基因片段,将其与经XhoⅠ和XbaⅠ双酶切的慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1连接,构建慢病毒重组质粒pLVX-IL-35-IRES-ZsGreen1。用无内毒素试剂盒提取重组质粒后,将其与病毒包装所需的3个辅助质粒共转染到人肾胚(HEK)293T细胞中包装能表达IL-35的慢病毒颗粒。该病毒培养上清经浓缩后,梯度稀释法检测其滴度。用浓缩后的病毒感染HEK293T细胞,然后通过荧光显微镜观察荧光蛋白的表达并结合RT-PCR法检测IL-35基因在该细胞中的表达。[结果]IL-35慢病毒表达载体构建成功,包装的慢病毒滴度为1×109TU/m L,通过荧光显微镜和RTPCR检测发现IL-35在HEK293T细胞中表达。[结论]成功构建IL-35慢病毒表达载体且IL-35蛋白能在HEK293T细胞中过表达。     

类泛素蛋白FAT10对人肾上皮细胞α-烯醇酶共价修饰的初步研究

目的:构建带Flag标签的α-烯醇酶(ENO1)基因以及带Myc标签的人白细胞抗原F相关转录物10(FAT10)基因的真核表达质粒载体,鉴定ENO1和FAT10在人肾上皮细胞株HEK293中的表达,检测类泛素蛋白FAT10是否共价修饰ENO1。方法:以人宫颈癌细胞系He La的c DNA为模板进行PCR,得到eno1目的片段,与分别经EcoRⅤ和SalⅠ酶切的pFlag-CMV载体连接得到重组质粒pFlag-CMV-eno1并进行鉴定测序;以人脑组织c DNA文库为模板进行PCR,得到fat10目的片段,与分别经Eco RⅠ和XhoⅠ酶切的p CMV-Myc载体连接得到重组质粒p CMV-Myc-fat10并进行鉴定并测序。将重组质粒用脂质体法转染HEK293细胞,用Western印迹检测ENO1和FAT10蛋白的表达。将重组质粒共转染HEK293细胞,用免疫共沉淀检测FAT10对ENO1的修饰情况。结果:重组克隆载体内的eno1和fat10序列与Gen Bank报告的序列完全一致;转染HEK293细胞后,ENO1和FAT10蛋白过表达;FAT10能够共价修饰ENO1。结论:类泛素蛋白FAT10共价修饰ENO1,为肿瘤的发生、发展及迁移的研究提供了新的研究思路。     

人GRB2基因真核表达及其在293T细胞中的定位研究

[目的]构建人GRB2蛋白真核表达质粒p Enter-GRB2,并观察其在293T细胞中的定位。[方法]从Hela细胞中提取总RNA,通过RT-PCR获得GRB2全长c DNA序列,并将其克隆到真核表达载体p Enter中,构建重组质粒p Enter-GRB2。转染293T细胞24 h、36 h和48 h后通过Western Blot检测其表达情况,通过免疫荧光观察其在细胞中的定位情况。[结果]经双酶切及测序鉴定,GRB2开放阅读框正确地构建到了真核表达质粒p Enter中,免疫印迹检测可见大小约为25 k Da的特异性条带,免疫荧光实验表明GRB2蛋白在细胞质和细胞核中均存在。[结论]成功构建了真核表达质粒p Enter-GRB2并在293T细胞中表达,证实GRB2在293T细胞中不仅存在于细胞质中,也存在于细胞核中,为更加深入地研究其生物学功能及机制奠定了理论基础。     

人PSCA和PAP融合基因真核表达质粒的构建与表达

[目的]构建人PSCA和PAP融合基因的真核表达质粒,并在体外进行表达和鉴定。[方法]设计并合成人PSCA和PAP融合基因,然后将其定向克隆到真核表达载体p IRES-neo中,双酶切鉴定后,将重组质粒p IRES-neoPSCA-2A-PAP瞬时转染293T细胞,采用流式细胞术和免疫荧光细胞化学技术验证其表达。[结果]构建了p IRES-neo-PSCA-2A-PAP真核表达质粒,流式细胞术和免疫荧光细胞化学技术结果显示融合抗原可以在293T细胞表达,阳性率高达67.85%。[结论]成功构建了融合抗原PSCA与PAP的真核表达质粒p IRES-neo-PSCA-2A-PAP,为建立稳定转染人PSCA和PAP融合基因的细胞系奠定了基础。     

猪骨髓基质抗原2基因的克隆、表达及生物学活性研究

研究目的是克隆猪骨髓基质抗原2(Bone marrow stromal antigen-2,BST-2)基因并进行真核表达,获得具有抗病毒活性的重组BST-2蛋白。研究通过RT-PCR从猪瘟弱毒疫苗和聚肌胞(Poly I:C)刺激的猪肾细胞(PK-15)中扩增出猪BST-2cDNA,克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,构建重组表达质粒pcDNA-BST-2,转染HEK293T细胞,纯化BST-2蛋白并经Bradford法定量,Western blot检测,研究BST-2抗病毒生物学活性。酶切鉴定和核酸序列测定证实pcDNA-BST-2真核表达质粒构建成功,转染HEK293T细胞后,经间接免疫荧光能够检测到绿色荧光。生物学活性测定重组BST-2蛋白具有一定的抗水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)、H9禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)及猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syn-drome virus,PRRSV)的活性。结果表明,重组BST-2具有一定抗病毒生物功能,为进一步研究重组BST-2蛋白的活性以及BST-2抗病毒药物研究奠定了基础。