CRISPR/Cas9技术介导的稳定沉默LDHA表达对肺癌A549细胞增殖的影响

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建稳定沉默乳酸脱氢酶A(LDHA)的A549细胞系,并探讨LDHA沉默对细胞增殖能力的影响。方法:构建特异性靶向LDHA基因的CRISPR/Cas9系统重组载体p X260-LDHA,转染A549细胞后经嘌呤霉素筛选获得LDHA沉默的稳定细胞株,并用定量PCR和免疫印迹实验分别检测LDHA m RNA和蛋白的沉默效率。利用MTT法检测A549细胞的增殖情况。结果:测序结果证实,CRISPR/Cas9系统重组载体p X260-LDHA构建成功;筛选出LDHA沉默A549细胞株,定量PCR和免疫印迹实验证实LDHA m RNA和蛋白的表达量均明显下调。MTT法证实:培养24,48,72h后,LDHA沉默A549细胞与对照细胞相比,其增殖被抑制。结论:转染靶向LDHA基因的CRISPR/Cas9系统重组载体,可明显下调LDHA m RNA和蛋白表达,抑制肺癌细胞A549的增殖。     

长链非编码RNA SNHG7靶向调控miR-9-5p参与舌癌进程

目前发现长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）小核仁RNA宿主基因7 (small nucleolar RNA host gene 7, SNHG7)在多种肿瘤中高表达,发挥原癌基因效应,但是其在舌癌中的功能尚未研究。qRT-PCR结果证实,SNHG7在舌癌组织和细胞中均下调。在舌癌细胞中,过表达SNHG7抑制舌癌细胞增殖,敲低SNHG7促进舌癌细胞增殖。生物信息学分析及双荧光素酶报告基因实验证实,miR-9-5p与SNHG7结合且下调其表达。过表达SNHG7,miR-9-5p表达量降低而自噬/苄氯素1调节因子1（autophagy/Beclin 1 regulator 1, Ambra1）的表达增加。敲低SNHG7,上调miR-9-5p,且降低Ambra1的表达。临床组织标本随访资料统计发现,SNHG7、Ambra1与舌癌患者预后正相关,而miR-9-5p与舌癌患者预后负相关。提示SNHG7/miR-9-5p/Ambra1可作为舌癌预后的潜在标志物。     

下调lincRNA HOTAIR对胃癌细胞迁移及增殖抑制作用的研究

通过下调人胃癌细胞BGC823中linc RNA HOTAIR基因的表达,该文探讨了linc RNA HOTAIR低表达对胃癌细胞迁移、侵袭及增殖能力的影响。该文构建针对人linc RNA HOTAIR基因的干扰质粒sh HOTAIR,稳定转染入胃癌细胞BGC823、筛选稳转株,q PCR检测linc RNA HOTAIR在胃癌细胞中表达水平。采用划痕试验、侵袭试验、MTT法分别检测转染胃癌细胞迁移、侵袭及增殖能力。结果表明,稳定转染干扰质粒sh HOTAIR后下调linc RNA HOTAIR表达的胃癌细胞株细胞迁移、侵袭及增殖能力较阴性对照组明显减弱。下调胃癌细胞中linc RNA HOTAIR的表达,可降低胃癌细胞的迁移力、侵袭性、抑制其增殖能力,提示linc RNA HOTAIR可作为分子靶点用于胃癌的分子靶向治疗。     

长非编码RNA HOTAIR调控胃癌细胞SGC-7901来源肿瘤干细胞样细胞

肿瘤干细胞样细胞具有自我更新、无限增殖和多向分化能力,且受到长非编码RNA（long non-coding RNAs, lncRNAs）的调控。长非编码RNA HOTAIR在人胃癌细胞中表达升高,且具有调控功能。但目前对其在胃癌干细胞样细胞中的功能尚无研究。本研究的目的是探讨胃癌肿瘤干细胞中HOTAIR对肿瘤恶性行为的调控作用。本研究采用无血清培养基在补充细胞因子条件下培养SGC-7901细胞,获得悬浮生长的肿瘤干细胞样细胞微球,检测微球细胞的表面特征因子CD44、CD24及HOTAIR的表达量变化;并通过CCK-8、流式细胞分析及ELISA等技术探讨了HOTAIR对肿瘤干细胞样细胞功能调控作用。结果表明,无血清培养基中获得的肿瘤干细胞样细胞具有自我更新能力,其可连续传代细胞微球的比率为4.75%±0.76%;RT-qPCR检测显示,相对于SGC-7901细胞,肿瘤干细胞样细胞中的HOTAIR表达量明显升高;通过慢病毒干扰技术发现,HOTAIR干扰抑制了HLA-G蛋白分泌、促进肿瘤干细胞样细胞的细胞周期推进、细胞增殖和自我更新能力维持。本研究提示,胃癌细胞系SGC-7901中的肿瘤干细胞样细胞中HOTAIR表达量升高,并可能通过促进肿瘤干细胞样细胞干性调控肿瘤恶性行为。     

利用CRISPR/Cas9系统和TALEN技术干预XIST基因的表达

XIST是维持雌性哺乳动物X染色体稳定失活的重要长链非编码基因。X染色体失活异常导致X连锁基因的过量表达从而参与了癌症等疾病的发生。干预XIST的表达在XIST的生物学功能和相关疾病发生的研究中是必不可少的。该研究利用CRISPR/Cas9系统和TALEN技术在293T细胞中对已知的XIST核心启动子进行编辑,建立了通过酶切、测序等鉴定突变效率的方法,并且结合极限稀释法、片段分析和TA克隆测序得到基因型确定的XIST低表达的单克隆细胞系。结果显示,CRISPR/Cas9和TALEN对XIST核心启动子的突变可以有效地抑制XIST的表达。该研究表明,针对XIST核心启动子的基因组编辑可以干预XIST的表达,这为长链非编码RNA基因的敲低提供了新的思路。     

基于CRISPR/Cas9技术构建CELF6基因敲除细胞系并探讨CELF6与p53基因的关系

目的:构建CELF6基因敲除细胞系并探讨CELF6与p53基因之间的关系。方法:CRISPR/Cas9双载体慢病毒系统通过两个慢病毒载体分别向细胞中导入Cas9蛋白和sg RNA序列表达框,从而实现对CELF6基因的敲除。通过Surveyor(错配酶法)检测sg RNA活性并利用Western blot(蛋白质免疫印迹)检测CELF6的敲除效率。进一步利用CCK-8试剂盒检测敲除CELF6和过表达CELF6对细胞增殖的影响。利用公开可用的癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析CELF6在多种肿瘤组织中的表达情况。结果:CELF6基因敲除的HCT116细胞系成功构建。Western blot检测发现CELF6基因敲除的细胞系中p53、p-RB蛋白的表达水平显著下调,而CELF6过表达的细胞中p53、p-RB蛋白的表达水平明显上调。CCK-8实验结果显示敲除CELF6基因后,细胞增殖活性显著增强;而过表达CELF6后,细胞的增殖活性受到明显抑制。生物信息学分析发现CELF6在结肠癌、胶质母细胞瘤、子宫内膜癌、肾嫌色细胞癌、乳腺癌、甲状腺癌等肿瘤组织中显著低表达。结论:推测CELF6是一种新的潜在肿瘤抑制基因,其可能在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用。     

宫颈癌组织LncRNA HOTAIR、miR-17-5p表达与增殖基因、临床病理特征和预后的关系分析

目的：探讨宫颈癌组织长链非编码核糖核酸（LncRNA）HOX转录反义RNA(HOTAIR)、微小核糖核酸（mi R）-17-5p表达与增殖基因、临床病理特征和预后的关系。方法：选择2014年1月-2018年1月新疆医科大学第一附属医院收治的157例宫颈癌患者,取手术切除的宫颈癌组织和癌旁组织,实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）法检测LncRNA HOTAIR、mi R-17-5p及宫颈癌相关增殖基因PRDX4、NEK2、FHIT、BLCAP转录水平表达。Pearson分析宫颈癌组织LncRNA HOTAIR、mi R-17-5p表达与增殖基因表达的相关性,Kaplan-Meier法分析不同LncRNA HOTAIR、mi R-17-5p表达宫颈癌患者的5年生存率差异。结果：宫颈癌组织LncRNA HOTAIR、mi R-17-5p、PRDX4、NEK2、FHIT、BLCAP转录水平表达均高于癌旁组织（P<0.05）。宫颈癌组织LncRNA HOTAIR、mi R-17-5p表达与PRDX4、NEK2、FHIT、BLCAP转录水平表达均呈正相关（P<0.05）,LncR...     

舌鳞状细胞癌相关长链非编码RNA的筛选与分析

[目的]获得舌鳞状细胞癌组织与正常舌组织中差异表达的长链非编码RNA,并进行功能注释和参与的生理过程进行初步分析。[方法]利用GEO数据库中GES13601的原始芯片数据,采用affymatrix软件套件对芯片数据进行重新均一化和标准化,并筛选差异表达的长链非编码RNA,查找其参与的生理过程。[结果]舌鳞状细胞癌组织与正常舌组织差异表达的基因个数为5 613个。其中在癌组织中上调的为2 951个,下调的共2 662个。从中筛选到长链非编码RNA 38个,上调19个,下调19个。其中的某些参与涉及肌肉、淋巴生长和癌细胞发送等生理过程,但是大部分的功能未知,尚需进一步研究。[结论]筛选到舌鳞状细胞癌相关的38个长链非编码RNA,为寻找早期舌鳞状细胞癌标志物提供了新的参考。     

CRISPR/Cas9系统敲除TET2基因对HepG2细胞增殖和凋亡的影响

为了进一步探讨TET2蛋白在肝癌的发生发展过程中发挥的生物学功能,本研究使用CRISPR在线设计工具(http://crispr.mit.edu/),针对TET2的外显子设计g RNA,构建靶向TET2基因的CRISPR/Cas9基因敲除质粒,转染HepG2细胞。T7E1酶切检测TET2基因的编辑效率,Western blotting检测TET2蛋白表达水平;MTT法、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒分别检测HepG2细胞的增殖活性及凋亡水平的改变。T7EI酶切分析显示敲除效率为31.4%;TET2基因表达量的降低抑制了HepG2细胞的增殖,促进了细胞的凋亡。CRISPR/Cas9质粒系统能够在细胞水平对TET2基因进行编辑,靶向TET2基因的CRISPR/Cas9质粒系统降低了TET2的表达、抑制HepG2细胞的增殖、促进HepG2细胞的凋亡。本研究表明CRISPR/Cas9技术为研究TET2的功能和作用机制提供了有效工具,为研究TET2蛋白在肝癌的发生发展过程中发挥的生物学功能提供实验依据。     

LncRNA AC006449.2抑制卵巢癌细胞增殖

长链非编码RNAs(long non-coding RNAs, lncRNAs)是一类无蛋白质编码功能的RNAs。多项研究表明,lncRNAs在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。GEPIA数据库结合qRT-PCR结果提示,lncRNA AC006449.2在卵巢癌组织中的表达量显著低于正常组织,且其在卵巢癌细胞中的水平也低于正常卵巢上皮细胞。进一步分析发现,lncRNA AC006449.2的表达量与卵巢癌患者较差的预后负相关,与瘤体大小和远端转移密切相关,而与卵巢癌患者年龄、淋巴结转移及TNM分期无关。细胞功能研究发现,上调AC006449.2,卵巢癌细胞的增殖和平板克隆能力降低;而下调AC006449.2之后,该细胞的增殖和平板克隆能力显著增加。深入的机制研究发现,AC006449.2可上调细胞周期相关蛋白p21和p27的表达量,上调促凋亡蛋白Bax的表达,而下调抗凋亡蛋白Bcl2的表达量,最终抑制卵巢癌细胞的增殖。上述研究结果推测,lncRNA AC006449.2在卵巢癌细胞中可能发挥抑癌因子的作用。     

长链非编码RNA PVT1促进胃癌细胞增殖和迁移

该文主要探讨了长链非编码RNA PVT1(long non-coding PVT1,Lnc RNA PVT1)对胃癌细胞增殖和迁移能力的影响。荧光定量PCR检测人胃癌细胞HGC-27、MGC-803和胃黏膜细胞GES-1中长链非编码RNA PVT1的表达水平;采用过表达技术和RNAi干扰技术分别上调和下调胃癌细胞MGC-803和HGC-27中PVT1的水平,CCK-8实验检测胃癌细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期;细胞划痕和Transwell实验检测胃癌细胞的迁移能力;Western blot和荧光定量PCR检测p21和E-cadherin蛋白的表达。结果显示,胃癌细胞中Lnc RNA PVT1的表达显著高于胃黏膜细胞(P0.01),过表达PVT1后,胃癌细胞MGC-803的增殖和迁移能力明显增强(P0.01),p21和Ecadherin蛋白的表达明显降低(P0.01);而下调胃癌细胞中PVT1的表达后,胃癌细胞HGC-27的增殖和迁移能力明显下降(P0.01);p21和E-cadherin蛋白的表达明显增加(P0.01)。以上结果表明,胃癌细胞中Lnc RNA PVT1的水平显著高于胃黏膜细胞,Lnc RNA PVT1可以促进胃癌细胞增殖和迁移,有可能是通过调控p21和E-cadherin的表达发挥上述功能。     

CRISPR/Cas9全基因组筛选在生命科学中的应用

全基因组筛选是系统性分析基因组的有力工具,可在全基因组范围内发现具有特定生物学功能的基因或DNA元件。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的全基因组筛选具有高通量和高效率的特点,已被广泛应用于疾病机理和药物开发等研究,为临床治疗提供科学用药依据。同时,CRISPR/Cas9筛选可靶向启动子、增强子和长链非编码RNA等序列,解析其调控基因表达的功能。此外,将全基因组筛选与单细胞测序技术结合,可揭示细胞转录组差异,剖析基因功能关系。     

利用CRISPR/Cas9技术敲除长非编码RNA SNHG16基因促进K562细胞CD235a的表达上调

为了探究敲除长非编码RNA SNHG16对人慢性髓系白血病K562细胞的影响,我们利用CRISPR/Cas9技术在K562细胞中敲除SNHG16基因,通过流式分选获得单细胞,经扩增培养、基因组PCR鉴定、测序鉴定后,获得SNHG16杂合和纯合敲除株;通过Wright-Giemsa染色、MTS检测、流式分析和qRT-PCR分别检测了SNHG16敲除后对K562细胞形态、增殖、细胞表面标志蛋白及红系分化调控因子的影响。实验结果显示,敲除SNHG16后不影响K562细胞的形态和增殖,显著促进了K562细胞表面标志蛋白CD235a和红系分化调控因子的表达水平。该研究表明,长非编码RNA SNHG16不影响K562细胞的增殖,但SNHG16对K562细胞表面标志蛋白CD235a的表达水平有一定的调控作用。     

卵巢癌相关长链非编码RNA的生物信息学挖掘

探讨卵巢癌中差异表达的长链非编码RNA,从NCBI基因芯片数据库GEO下载卵巢癌基因芯片数据GSE14407,用SAM软件输出差异表达的基因,对其进行重注释并筛选出其中的长链非编码RNA,用Gene Cluster和Tree View软件验证SAM软件分析结果。针对该芯片数据,筛出133个在卵巢癌中表达有差异的长链非编码RNA,其中112个上调,21个下调,且这些长链非编码RNA的表达倍数均2或0.5,差异有统计学意义(q值0.05)。用生物信息学方法挖掘普通基因芯片中卵巢癌相关长链非编码RNA是十分有效的方法,可为卵巢癌相关长链非编码RNA的探索提供新途径。     

利用CRISPR/Cas9n系统敲除人源SNF5基因

目的:建立敲除人源基因组中SNF5基因的CRISPR/Cas9n系统。方法:设计一对靶向人源SNF5基因第1个外显子的sg RNA,分别克隆至p X461、p X462表达载体后,转入人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测细胞株中SNF5基因的敲除效果。结果:测序证明构建的靶向SNF5基因CRISPR/Cas9n重组质粒与设计吻合。Western印迹结果显示,重组质粒p X461-h SNF5sg RNA转染293T细胞后24 h,细胞内SNF5表达水平明显降低;重组质粒p X462-h SNF5sg RNA转染293T细胞后48 h,细胞内SNF5表达水平显著降低。结论:通过CRISPR/Cas9n系统获得了靶向SNF5基因的重组质粒,构建的重组质粒能有效敲除SNF5基因的表达。     

miR-20b-5p在肿瘤及其他疾病中的生物学功能

miRNAs是一类非编码的小RNA分子,在多种疾病的发病和治疗中发挥重要作用,可调控细胞增殖、细胞周期、凋亡和迁移等过程中关键基因的表达。miR-20b-5p属于miR-17家族,在多种肿瘤中和非肿瘤性疾病中存在异常表达。在肿瘤中,miR-20b-5p扮演着癌基因或抑癌基因的角色,可通过调控相应靶分子的表达影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭与迁移等生物学行为,进而促进或抑制肿瘤的发生发展。该文对miR-20b-5p在肿瘤和非肿瘤性疾病中的生物学功能和机制进行简要综述。相信随着对miR-20b-5p的功能和机制的深入阐明,miR-20b-5p有望作为多种疾病的诊治靶点。     

长链非编码RNA SNHG1促进肺癌细胞增殖

近年来,大量证据表明长链非编码RNA (long non-coding RNAs, lncRNAs) 在肿瘤发生发展中发挥重要的作用。本研究通过生物信息学预测发现,核仁小分子RNA宿主基因1(small nucleolar RNA host gene 1,SNHG1)无蛋白质编码功能,且主要定位于细胞质。qRT-PCR结果显示,SNHG1在肺癌细胞中的表达量显著高于正常肺上皮细胞。在肺癌细胞NCI-H1299中,敲低SNHG1发现,该细胞增殖能力明显下降;在正常肺上皮细胞BEAS-2B中,过表达SNHG1可显著促进该细胞的增殖能力。深入研究发现,SNHG1可上调CDK4和下调p27kip1在蛋白质水平的表达,而对其mRNA水平表达量无影响。此外,在肺癌临床组织中也发现SNHG1高表达,且高表达的SNHG1与肺癌瘤体大小、TNM分期和远端转移正相关,而与患者年龄及吸烟史无关。综上所述,SNHG1在肺癌中高表达,通过上调CDK4和下调p27kip1推进肺癌进程。