2株具抗菌活性的稀有放线菌的筛选和鉴定

从药用植物根际土壤样品中分离得到了一批放线菌菌株,通过对其进行了抗茵活性筛选,发现菌株45725具有较好的抗耻垢分枝杆菌活性,菌株06-2230具有较强的抗绿脓杆菌活性。菌株45725和06-2230在酵母-麦芽膏琼脂（ISP2）、燕麦琼脂（ISP3）、无机盐淀粉琼脂培养基（ISP4）、葡萄糖天冬素琼脂培养基（ISP5）和马铃薯培养基（PDA）上生长良好,基生菌丝丰富,无气生菌丝。2株菌的最适生长温度为28℃,最适生长pH值7．0～7．5。综合2株菌的形态学、生理生化、细胞化学分类特征和基于16SrRNA基因序列的系统发育分析和DNA—DNA杂交结果,菌株45725和06—2230分别是多形态放线菌属的2个不同种。     

结核杆菌活动期高表达基因Rv1776c的克隆及其在耻垢分枝杆菌中的表达

目的构建表达结核分枝杆菌Rv1776c基因的重组耻垢分支杆菌,并鉴定该基因在重组耻垢分支杆菌中的活性。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌Rv1776c基因,构建大肠埃希菌-分支杆菌穿梭表达质粒pMV-Rv1776c,通过酶切和测序鉴定其正确性,用电穿孔法将重组质粒转染到耻垢分支杆菌mc^2155中。以SDS-PAGE及Western blot检测证实Rv1776c蛋白在重组耻垢分支杆菌内的表达。结果重组耻垢分支杆菌构建成功,生长曲线说明重组质粒不会影响耻垢分支杆菌的体外生长;SDSPAGE及Western blot检测证实Rv1776c在耻垢分枝杆菌内表达出相对分子量约56kD的Rv1776c蛋白。结论成功构建了Rv1776c基因的穿梭质粒pMV-Rv1776c,且该质粒在耻垢分枝杆菌内具有生物活性,为进一步研究其表达产物的功能提供基础。     

一株有抑菌活性海洋放线菌的筛选及鉴定

目的:筛选具有抑菌活性的海洋放线菌.方法:以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白假丝酵母、黑曲霉、苏云金芽孢杆菌、副溶血弧菌、胶质芽孢杆菌作为指示菌,采用滤纸片法进行筛选,将筛选到的菌株进行培养特征研究、生理生化试验及16S rDNA序列分析,并将测序结果提交至NCBI进行相似性检索,进而绘制出系统进化树,得到鉴定结果.结果:从舟山海域分离到1株具有较好抑菌活性的放线菌菌株a10,鉴定结果显示a10是一株浅玫瑰色链霉菌突变株.     

耻垢分枝杆菌EF-G敲低菌株的构建和耐药分析北大核心CSCD

GTPase延伸因子G(elongation factor G,EF-G)是蛋白质翻译过程中重要的翻译因子。作为唯一在翻译延伸和核糖体再生2个翻译环节发挥重要功能的翻译因子,EF-G成为潜在的抗菌药物作用靶点。耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmetics,Msm)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)基因组中均存在2个EF-G同源编码基因,分别为Msm EFG1(MSMEG_1400)和Msm EFG2(MSMEG_6535),fusA1(Rv0684)和fusA2(Rv0120c)。基因突变库和生物信息学推测Msm EFG1(MSMEG_1400)和fusA1(Rv0684)是生长必需基因。为探究分枝杆菌中EF-G的生物学功能及特点,利用成簇的规律间隔的短回文重复序列干扰(clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference,CRISPRi)技术构建了耻垢分枝杆菌中2个EF-G诱导型敲低菌株(Msm-ΔEFG1(KD)和Msm-ΔEFG2(KD)),研究发现EF-G2的敲低对细菌生长无影响,而EF-G1的敲低显著影响分枝杆菌的生长,成膜能力显著减弱、菌落形态显著变化、菌体长度显著增长,推测EF-G可能与细菌的分裂相关。最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)实验结果表明,抑制EF-G1的表达可增强分枝杆菌对利福平、异烟肼、红霉素、夫西地酸、卷曲霉素等抗菌药物的敏感性,提示EF-G1可能成为未来抗结核药物筛选的潜在靶标,为探究EF-G在分枝杆菌中的生理功能及作为潜在药物靶标提供基础。     

结核分枝杆菌核糖体蛋白丙氨酸乙酰转移酶过表达菌株的构建及分析

rimI基因编码的核糖体蛋白丙氨酸乙酰转移酶(ribosomal-protein-alanine acetyltransferase,RimI)为结核分枝杆菌GCN5相关N-乙酰转移酶家族成员,其在结核分枝杆菌中的生物学功能尚不十分清楚。为探索RimI的生物学特性及其对结核分枝杆菌致病性的影响,本研究以耻垢分枝杆菌为模式菌,构建过表达结核分枝杆菌rimI基因的重组菌株Msm∷pMV261-rimI。分别培养 Msm∷pMV261-rimI菌株和对照Msm∷pMV261菌株,分析两者生长速率、菌落形态和生物膜形成的差异,以及耐受低氧、低pH值、H₂O₂、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)和0.05%～1%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)等逆环境的能力;并将两种菌株分别接种于鼠巨噬细胞RAW264.7,观察两者在巨噬细胞内的存活能力。结果表明,相较于对照菌株,过表达rimI的菌株在生长前中期速率降低,生物膜早期成膜变缓,但不影响生物膜的后期成熟。同时,过表达rimI的菌株抵抗低氧、低pH值、H₂O₂等逆环境的能力增强,在巨噬细胞内的存活能力增强。结果提示,rimI基因对分枝杆菌的生物膜形成、抗逆性及细胞内生存具有重要作用,可能与结核分枝杆菌的毒力密切相关。     

结核杆菌DnaA蛋白在耻垢分枝杆菌中的同源表达

目的：在耻垢分枝杆菌中表达重组结核杆菌DnaA蛋白并对表达产物进行鉴定。方法：用PCR的方法扩增结核杆菌dnaA基因并克隆至表达载体pMF406中,构建重组大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pMF-dnaA。经双酶切及测序鉴定后,用电转化的方法将重组质粒转至耻垢分枝杆菌mc2155中。用0.02%乙酰胺诱导重组耻垢分枝杆菌,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting检测和鉴定。结果：重组耻垢分枝杆菌构建成功,SDS-PAGE及Western blotting结果显示该重组耻垢杆菌可以实现结核杆菌DnaA蛋白的同源高效表达。结论：结核杆菌DnaA蛋白的同源表达为结核杆菌DNA复制机制的研究奠定了基础。     

乙酰化修饰降低Ku蛋白的DNA结合活性

【目的】研究乙酰化修饰对Ku蛋白活性的影响。【方法】利用耻垢分枝杆菌为表达菌株,转入Ku蛋白表达质粒,纯化具有乙酰化修饰的Ku蛋白和无乙酰化的Ku蛋白突变体,比较两类蛋白的生化活性;分析氧化压力和酸性环境下耻垢分枝杆菌细胞内Ku蛋白乙酰化水平的变化。【结果】Ku蛋白过量表达的耻垢分枝杆菌比转入空质粒的对照菌株生长缓慢;乙酰化Ku蛋白比未发生乙酰化Ku蛋白修复断裂DNA的活性降低、DNA结合活性降低;氧化压力和酸性压力环境下,耻垢分枝杆菌细胞内Ku蛋白数量降低,乙酰化Ku蛋白数量变化不大。【结论】乙酰化修饰能够调节Ku蛋白的DNA结合活性,从而调节非同源末端连接修复系统的活性;Ku蛋白乙酰化程度升高是耻垢分枝杆菌对不良生长环境的反应。     

大蓟提取物联合抗生素对分枝杆菌的协同抗菌作用

本文探索了大蓟提取物联合抗生素对分枝杆菌属模式菌株耻垢分枝杆菌的协同抗菌作用,以期从药用植物中鉴定新型抗分枝杆菌活性天然产物或新型抗菌增效剂。通过水煮法、索氏提取法、超声波法获取大蓟粗提物,采用管碟法、96微孔板二倍稀释法对三种粗提物进行体外分枝杆菌药敏试验,观察大蓟粗提物的抗分枝杆菌活性及与抗生素的协同抗菌活性。结果显示大蓟粗提物单独作用时,饱和浓度的大蓟水提物未表现出抗菌活性;索氏提取物和超声波提取物表现出一定的抗菌活性(MIC值均为8 mg/mL)。大蓟超声波提取物与抗生素联合作用时,与氯霉素、卡那霉素、庆大霉素和红霉素均表现出协同作用,其中与氯霉素、红霉素表现为明显协同。本文首次发现大蓟中存在与抗生素有协同作用的抗菌增效剂,为从药用植物中鉴定天然抗菌产物及抗菌增效剂奠定了一定基础。     

桐花树活性内生真菌筛选及其抗菌化学成分的研究

为了探究桐花树内生真菌在抑菌方面的价值,该文以内生真菌发酵产物的抑菌作用为评价指标筛选活性菌株,采用生物活性跟踪方法结合多种色谱技术分离活性菌株的化学成分,通过波谱与文献数据比对鉴定单体化合物结构,并利用微孔板法测定单体化合物的抑菌活性。结果表明:(1)从桐花树分离得到的16株内生真菌分属2纲7目10科10属,镰刀菌属(Fusarium)为优势菌属。内生真菌GXIMD02029和GXIMD02039的发酵产物对枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、粘性放线菌和金黄色葡萄球菌有不同程度的抑制作用,GXIMD02038发酵产物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用。(2)7个化合物从内生真菌Phomopsis sp. GXIMD02029中被分离并鉴定为(15R)-acetoxydothiorelone A(1)、cytosporone B(2)、pestalotiopsone H(3)、pestalotiopsone B(4)、4-Hydroxybenzaldehyde(5)、p-Hydroxybenzoic acid(6)、N-(2-phenylethyl)acetamide(7)。(3)化合物1和2有不同程度的抑菌作用,化合物1对枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的MIC值为16.25 SymbolmA@ g·mL^-1,对藤黄微球菌和粘性放线菌的MIC值为7.812 5 SymbolmA@ g·mL^-1,对金黄色葡萄球菌的MIC值为31.25 SymbolmA@ g·mL^-1。化合物2对藤黄微球菌的MIC值为62.5 SymbolmA@ g·mL^-1,对枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、粘性放线菌的MIC值为125 SymbolmA@ g·mL^-1,对金黄色葡萄球菌的MIC值为250 SymbolmA@ g·mL^-1。该文筛选了3株活性菌株,首次报道化合物1具有抗菌活性,为桐花树内生真菌在抗菌价值方面提供了依据。     

中药源芽孢杆菌抗病原真菌菌株的筛选与鉴定

从20种中药中分离纯化得到48株芽孢杆菌,其中25株对10种植物病原菌中至少一种具有拮抗作用,7株抗菌谱较广,其中1株广谱抗菌能力极强。25株有抗性菌株经纯化培养对其进行菌体菌落形态观察和生理生化特征鉴定,其中8株芽孢杆菌被初步鉴定为枯草芽孢杆菌,3株被初步鉴定为蜡样芽孢杆菌,1株被初步鉴定为纳豆芽孢杆菌,1株被初步鉴定为地衣芽孢杆菌,发现两种可能对芽孢杆菌有抑制作用的中药。     

木榄根际土壤来源的曲霉属真菌F5及其抗菌活性代谢产物

将一株分离自木榄根际土壤的菌株F5鉴定为曲霉属环绕组真菌成员,其在形态学特征和ITS序列上与Aspergillus ochraceopetaliformis极为相似。该菌株在改良葡萄糖蛋白胨酵母培养基(GPYM)中28℃下160r/min发酵7d后的产物具有明显的抑菌活性。利用色谱方法从菌株F5的发酵产物中分离鉴定到2种化合物:(R)-(-)-mellein(Ⅰ)和flavacol(Ⅱ),其中,flavacol对枯草芽孢杆菌的生长具有明显的抑制作用,最低抑菌浓度(MIC)为32mg/L,而mellein对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的生长均无明显的抑制活性。     

黄海海域沉积物和庐山土壤样品中放线菌的分离、活性及生物多样性研究

本研究采用均匀实验设计优化预处理条件来分离黄海海泥和庐山土壤样品中的放线菌。通过均匀实验得到最优的预处理条件为湿热50℃处理20 min,不进行超声处理以及添加苯酚。经过形态排重后,从海泥和庐山样品中分离得到86株和11株不同表型的放线菌。通过进一步的分子生物学鉴定,海泥中的86株放线菌分别属于3个不同的属,而庐山样品的11株分别属于4个不同的属。对这97株放线菌进行抗菌实验发现,18.5%的菌株对大肠杆菌有抑菌活性,7.2%的菌株对枯草芽孢杆菌有抑菌活性,但对酿酒酵母都无抑菌活性。     

喜树种子内生放线菌的分离鉴定及抗菌活性物质初分离

【目的】探究含有抗肿瘤活性喜树碱的喜树(Camptotheca acuminata Decne.)种子中内生放线菌的多样性,以及从内生放线菌中寻找新型活性化合物产生菌。【方法】利用放线菌富集培养基分离喜树种子内生放线菌,并根据菌落形态及16S rRNA基因序列同源性分析进行菌种鉴定;以及利用与病原微生物共培养方法检测分离菌株的抗菌活性。【结果】从上海交通大学校园的喜树种子中共分离到33株内生疑似放线菌,经基于16S rRNA基因序列分析的分子鉴定,确定其中21株属于链霉菌,1株属于拟诺卡氏菌,另有3株由于序列相似性低于95%而无法分类;8株因未能克隆16S rRNA基因序列而未确定分类。这11株疑似内生放线菌是否是新放线菌(种)类群,有待后续深入研究。初步的抗细菌、真菌活性检测发现,分离到的内生放线菌中42.42%以上对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)有很强的抑制菌核形成的作用,54.54%内生菌有较强抑制芽孢杆菌生长的作用。并且挑选其中具有代表性的菌株Streptomyces sp.CXSZ1进行代谢产物的分析,初步发现其代谢产物中含有抗细菌活性成分。【结论】喜树种子内生放线菌的分离、鉴定及生物活性物质分离鉴定的研究工作,一方面可以为揭示喜树等高等植物种子内生菌的起源、演化等提供有价值的信息,同时也为新结构、新活性化合物发掘提供实验材料。     

蜚蠊肠道抗真菌活性放线菌的筛选与鉴定

对美洲大蠊肠道具有抗真菌活性的内生放线菌进行筛选和分类鉴定。以白色念珠菌、红色毛癣菌、黑曲霉和烟曲霉4种人体致病真菌为研究对象,采用牛津杯法和菌株对峙共培养法对159株蜚蠊肠道内生放线菌进行体外抗真菌活性筛选,采用16S rDNA PCR、Blast同源性比对和构建系统发育树等方法对菌株进行分子生物学鉴定。研究结果表明,45株内生放线菌具有抗真菌活性,诸多菌株抗真菌谱较广,有10株内生放线菌对4种受试真菌均有拮抗作用。其中,链霉菌属为优势菌属有32株,占71.11%;戈登氏菌属有6株,微杆菌属有2株,分枝杆菌属、无色杆菌属、小单孢菌属、纤维微菌属和壤霉菌属各有1株。说明蜚蠊肠道含有丰富的抗真菌活性放线菌资源。     

耻垢分枝杆菌MSMEG_6281 过表达对菌株生长和形态的影响

【目的】耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis mc2155,mc2155)MSMEG_6281为结核分枝杆菌自溶素Rv3717的同源蛋白,通过建立过表达MSMEG_6281的耻垢分枝杆菌菌株,推测该蛋白对耻垢分枝杆菌肽聚糖代谢的影响。【方法】利用RT-PCR方法检测乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)作用后MSMEG_6281基因的表达变化;以耻垢分枝杆菌基因组DNA为模板,采用PCR技术克隆MSMEG_6281基因,构建分枝杆菌表达质粒p VV16-MSMEG_6281,进一步建立MSMEG_6281过表达的耻垢分枝杆菌菌株;利用生长曲线检测MSMEG_6281过表达对耻垢分枝杆菌生长的影响;利用扫描电子显微镜分析MSMEG_6281过表达引起的耻垢分枝杆菌形态变化。【结果】EMB处理引起MSMEG_6281基因表达上调;构建了过表达MSMGE_6281的耻垢分枝杆菌菌株(mc2155/p VV16-MSMEG_6281);过表达MSMGE_6281的耻垢分枝杆菌生长缓慢,菌体形态由短杆状转变为长杆状。【结论】MSMGE_6281的过表达可改变耻垢分枝杆菌形态。MSMGE_6281的功能与细胞壁肽聚糖水解相关,在mc2155细胞壁形态维持方面发挥重要作用。     

耻垢分枝杆菌转录因子Ms6174广泛调控功能的鉴定及其调控生物被膜形成的机理研究

在前期研究中,利用耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)转座插入突变体文库筛选并鉴定到的转录因子的编码基因ms6174突变后影响了其细菌菌落表面形态。利用凝胶阻滞迁移实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)和β-半乳糖苷酶活性实验证实了Ms6174直接负调控其自身所在基因簇的表达。同时,利用EMSA实验、DNaseⅠ酶切实验以及蛋白质与染色质DNA荧光共定位等实验发现Ms6174具有拟核结合蛋白的特性,即Ms6174是耻垢分枝杆菌中新的拟核结合蛋白。进一步通过转录组测序分析发现,相较于耻垢分枝杆菌野生型菌株,ms6174敲除菌株中有682个基因的表达水平发生了显著变化,其中有387个基因上调表达,295个基因下调表达,142个脂质代谢相关基因的表达水平发生变化。最后,检测并比较了耻垢分枝杆菌ms6174敲除突变体菌株与野生型菌株的菌落形态与生物被膜形成的差异,发现敲除ms6174后耻垢分枝杆菌的菌落表面褶皱与气液表面生物被膜增多,因此,转录因子Ms6174负调控耻垢分枝杆菌生物被膜的形成。综上,本研究鉴定了分枝...     

五株乳酸菌和三株芽孢杆菌的生物学特性和功能

【背景】乳酸菌和芽孢杆菌是应用于生产最多的益生菌,但不同菌株间的生长特性均不相同,因此了解菌株的生物学特性具有重要意义。【目的】研究菌株的生物学特性,能合理地开发和利用菌株,以保证菌株生产应用的安全性。【方法】活化后鉴定5株乳酸菌和3株芽孢杆菌并对其形态进行观察,探究菌株的生长曲线、产酸能力及最适生长条件,测定菌株的抑菌活性和产酶性能,同时探究菌株的益生性和安全性。【结果】五株乳酸菌分别编号鉴定为干酪乳杆菌R1、副干酪乳杆菌R2、香肠乳杆菌R3、福莱乳杆菌R4和唾液乳杆菌R5;3株芽孢杆菌分别编号命名为贝莱斯芽孢杆菌Y1、枯草芽孢杆菌Y2和地衣芽孢杆菌Y3。八株菌形态结构均不相同但都为杆状,均在2–10 h为对数生长期,18–24 h为稳定期,培养24 h时乳酸菌和芽孢杆菌的活菌数均保持在10⁹和10⁸ CFU/mL,最适生长温度为37.0℃。乳酸菌具有较强的产酸能力和抑菌活性,芽孢杆菌有较强的产酶性,在人工胃液中都有较强的耐受性。八株菌都无溶血活性、无毒力基因、对抗生素都保持中度敏感以上;其中唾液乳杆菌有四环素耐药基因,但对四环素抗性为中度敏感。【结论】八株菌生长繁殖速度快,乳酸菌产酸能力和抑菌活性较强,芽孢杆菌具有较强的产酶性能,在体外具有较好的益生性和安全性,可应用于生产实践。     

硝尔库勒湖可培养放线菌多样性及其功能酶和抗细菌活性

【目的】认识和了解硝尔库勒湖可培养放线菌的多样性、功能酶和抗细菌活性特点,为今后的开发和利用奠定基础。【方法】应用可培养技术和基于16S r RNA基因序列的系统发育分析硝尔库勒盐湖沉积物中放线菌的多样性。常规方法检测样品成分因子,并筛选了嗜盐放线菌的蛋白酶、淀粉酶和酯酶活性;抑菌圈法检测放线菌新种的抗细菌活性。【结果】分离获得了51个OTUs,分属于24个不同的属,其中15个OTUs代表了放线菌新种;链霉菌属是优势菌属,占全部分离菌株数量的16.25%。硝尔库勒湖放线菌类群数量一定程度上受样品成分因子的协同影响。代表新种的菌株展示了良好的功能酶活性和抗细菌活性,其中代表链霉菌新种的菌株XHU5011不仅具有多种酶活性,而且具有强大的抗金黄葡萄球菌、耻垢分枝杆菌和荧光假单胞菌的能力,具有很好的开发潜能。【结论】硝尔库勒盐湖中存在丰富的可培养放线菌多样性,潜藏着大量的放线菌新资源,并且具有很好的功能酶和天然产物挖掘潜力。     

结核分枝杆菌Rv2629基因产物的亚细胞定位和穿梭质粒转化耻垢分枝杆菌

目的 研究结核分枝杆菌利福平耐药相关蛋白Rv2629在细胞内的亚定位及其与药敏的相关性。 方法 采用差速离心进行细胞组分分离及Western-blot检测初步判定蛋白亚细胞定位;采用pMV261转化耻垢分枝杆菌,BACT MGIT960测定转化菌株的利福平耐受性。结果 Rv2629蛋白主要定位于结核分枝杆菌的细胞壁和细胞膜,重组有Rv2629 突变位点191C质粒的耻垢分枝杆菌对利福平的MIC为160mg/L,相应的携带有野生型基因191A的宿主菌MIC为20mg/L。结论 Rv2629基因191A/C突变同利福平耐药相关。     

一株皱叶南蛇藤内生放线菌的分离、鉴定及活性研究

目的:分离具有抗肿瘤作用与抗菌作用的内生放线菌,并对其进行分子鉴定和系统发育分析.方法:从皱叶南蛇藤中分离内生放线菌,通过滤纸片法和SRB法对其进行抗菌活性和抗肿瘤活性筛选,然后利用菌株形态特征、培养特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析对活性菌株进行鉴定结果:从皱叶南蛇藤中分离到10株内生放线菌,其中内生放线菌LCB369具有较好的抗菌活性和抗肿瘤活性,该菌对5种致病菌和肝癌细胞株HepG2均有抑制作用.经分子分类学分析鉴定,该菌与Streptomyces microflavus 在同一个分支上,同源性为99%.结论:皱叶南蛇藤内生菌LCB369具有明显抗菌和抗肿瘤作用,经鉴定为链霉菌Streptomyces microflavus.