嗜热菌Caldicellulosiruptor bescii Athe_0597基因克隆与表达

嗜热菌Caldicellulosiruptor bescii能够高效水解木质纤维素,C.bescii分泌的纤维素降解体系中含有多种糖苷水解酶和未知功能的非催化蛋白.未知功能非催化蛋白Athe_0597能与多种纤维素底物结合且在纤维素降解体系中高丰度存在.本研究对Athe_0597进行了生物信息学分析;以C.bescii...     

高效木聚糖降解酶系定制的新进展与挑战

木聚糖是植物细胞壁中含量最丰富的非纤维素多糖,大约占陆地生物质资源的20%-35%。不同物种来源的木聚糖结构因取代方式不同而具有广泛的异质性,这对生物质资源向生物燃料和其他高值产品高效转化提出了重大挑战。因此,需要开发由不同类型酶组成的最佳混合物以有效糖化木聚糖类底物。但是针对特定类型的底物设计高效降解酶系十分困难,应考虑底物的类型、底物的组成和物理性质、多糖的聚合度以及不同降解酶组分的生化性质等。本文从不同植物木聚糖的结构异质性与合成复杂性方面展示了其抗降解屏障,同时介绍了木聚糖主链降解酶系及侧链降解酶系的多样性以及协同降解作用,综述了复杂生境中微生物种群产生的混合酶系、降解菌株产生的高效酶系,以及基于特定木聚糖底物改造并定制简化高效的酶系统。随着不同种类木聚糖精细结构和木聚糖降解酶底物特异性的深入研究,针对特定底物类型进行绿色高效木聚糖酶系定制,加速木聚糖类底物的降解,从而实现木质纤维素资源的绿色高值化利用。     

微生物木聚糖降解酶系统

木聚糖类半纤维素是产量仅次于纤维素的植物多糖 ,其结构要比纤维素复杂得多 ,完全降解木聚糖 ,实现植物残体的生物转化需要多种水解酶 (即木聚糖降解酶系统 )的协同作用。木聚糖酶在食品、饲料、纺织、能源工业 ,特别是在纸浆和造纸工业中有着广阔的应用前景 ,如人们将极端嗜热和嗜碱菌的木聚糖酶基因克隆到现有工程菌中生产工业用酶 ,用于纸浆的生物漂白和饲料加工。但是木聚糖资源的开发利用要求完整的酶系统。人们通过对具有木聚糖降解酶系统微生物的研究 ,运用基因工程技术将其构建成发酵工程菌 ,直接利用半纤维素生产单细胞蛋白 ;或者…     

里氏木霉GH61家族糖苷酶的高效表达及酶学特性研究

【目的】GH61家族糖苷水解酶具有葡聚糖氧化酶活性,通过对葡聚糖链的随机氧化而破坏木质纤维素的结晶结构,从而使木质纤维素容易被纤维素酶降解。重组表达、纯化获得里氏木霉的GH61家族糖苷水解酶(TrGH61,原名为EGⅣ),并研究其在纤维素酶水解木质纤维素中的作用。【方法】通过Overlap PCR将里氏木霉丙酮酸脱羧酶的启动子、纤维二糖水解酶cbh1的信号肽、EGⅣ基因和PDC终止子依次连接构建了里氏木霉的表达盒,通过该表达盒使TrGH61蛋白基因整合到里氏木霉的基因组DNA上进行同源表达。研究表达产物TrGH61的水解活性、与纤维素酶水解协同效应,以及TrGH61作为金属氧化酶的特性研究。【结果】在PDC启动子的作用下,TrGH61得到高效表达,摇瓶培养的表达量达到2.33 g/L。TrGH61有微弱的内切葡萄糖苷酶活性,比活力为0.02 IU/mg,但能显著提高纤维素酶水解稻草粉的活性,协同度最高可达1.998。低浓度的金属离子Cu2+、Co2+和还原性电子供体还原型谷胱甘肽、L-抗坏血酸、焦性没食子酸均能显著促进其水解效应。TrGH61能够降低稻草粉纤维素聚合度和结晶度。【结论】通过PDC启动子可以实现TrGH61蛋白高效组成型表达,TrGH61作为纤维素酶活性促进因子,通过破坏纤维素结晶结构作用机制协同增强纤维素酶水解木质纤维素。     

溶解性多糖单加氧酶的研究进展

木质纤维素是地球上储藏量最为丰富的可再生生物资源。将木质纤维素酶解成寡糖或单糖是生物质利用的关键。然而,传统的糖苷水解酶很难对其进行有效降解。溶解性多糖单加氧酶是一种全新的生物质降解酶,丰富了生物质降解的模式。它以氧化方式作用于糖链,产生更多的还原端以便糖苷水解酶能进一步进行催化。本文综述了LPMO的发现历史、分类、作用机制与活性测定方法,并讨论了LPMO在饲料添加剂、功能性食品与生物能源等领域的应用前景。     

白蚁及共生微生物木质纤维素水解酶的种类

白蚁是热带生态系统重要的木质纤维素降解者。白蚁种类丰富,可分成高等白蚁和低等白蚁,食性也具有各自特点。白蚁自身可以产生纤维素酶,主要是GHF9的内切葡聚糖酶(EG),也有β-葡萄糖苷酶(GB)。低等白蚁共生的原虫中已发现丰富的纤维素酶基因,属于GHF5,7和45。同时还有其他相关功能基因,如木聚糖酶和果胶类物质水解酶。高等白蚁肠道中没有共生原虫。高等培菌白蚁可以利用共生蚁巢伞属真菌促进木质纤维素降解,真菌可以产生纤维素酶,果胶质水解酶类、木聚糖酶,同时还产生可能与木质素分解相关的一种漆酶,但是从分子水平,关于共生真菌纤维素水解酶的研究还较少。白蚁肠道已分离出许多具有木质纤维素降解能力的菌株,最近的研究也发现了大量细菌纤维素酶基因。白蚁-共生系统丰富的木质纤维素水解酶类为发展生物方法开发纤维素乙醇这一思路提供有价值的资源。     

CBM在多糖底物降解中的应用进展

碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding module, CBM)是碳水化合物活性酶的重要组成部分，其功能是识别并结合到特定的多糖底物上以提高催化结构域在底物附近的浓度及催化效率，帮助其更好地降解如纤维素、木聚糖、几丁质和黄原胶等大分子化合物。不同家族的CBM因其来源或结构不同往往会具有不同的底物结合特性。本文从CBM的家族、结构和功能等方面对CBM近年来的研究进行了综述，特别是对其作为融合单元运用到多糖底物的降解和糖苷水解酶改造方面的应用进行了总结。     

微紫青霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶（CBHI）的纤维素结合结构域及其链结区非水解性破坏纤维素结晶区结构

天然纤维素的结晶区必需在内、外切纤维素酶的协同作用下,始可被降解,这是纤维素降解的限速步骤。内、外切纤维素酶均为β－1,4－糖苷键的水解酶,但单一的内、外切纤维素酶却都不能水解天然纤维素的结晶区。内、外切纤维素酶怎样协同降解纤维素的机理一直未得阐明,是天然纤维素降解机制研究中的难点。纤维素酶分子是由具有催化功能的催化结构域（catalytic domain,CD）和具有结合纤维素功能的纤维素结合（吸附）结构域（cellulse biding domain,CBD）及涟结它们的链结区（linker）序列组成。已知一细菌的CBD在吸附纤维素后,纤维素聚合物断裂形成短小纤维,但这一现象还未在真菌中有类似发现,通过对插入质粒pUC-18上的微紫青霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶CBHI的 cDNA基因,进行系列序列定向缺失等体外操作,得到了催化结构域序列缺失的重组质粒,转化大肠杆菌JM109后,利用纤维素结合结构域CBD可吸附纤维素的特性,筛选到含CBD编码区的转化子PUC18G,生产出了LacZ－CBD融合蛋白,经木瓜蛋白酶有限酶切后,分离纯化得到了CBD结构域及其链结区称为：CBDCBHI。经X光衍射、红外光谱分析、热活力测定和扫描电镜观察表明,CBDCBHI吸附纤维素后,能够导致纤维素聚合物氢键断裂,结晶度减低和形成短纤维,从而在底物可及性上为内切葡聚糖酶的水解糖化作用提供了条件,为真菌内、外切纤维素酶协同降解天然纤维素的作用机制提供了实验支持,并提出了内切纤维素酶的水解作用可为外切纤维素酶吸附纤维素提供能量的推论。     

白蚁及其共生菌来源的4种木质纤维素酶的共表达

天然的木质纤维素材料含有纤维素、半纤维素和木质素等成分。降解天然木质纤维素底物时,需要木质纤维素酶共同作用。近年在木质纤维素酶的相互协同作用方面的研究引起人们的关注,成为一个新的研究热点,文中使用两个不同的共表达载体pETDuet-1和pRSFDuet-1,在大肠杆菌中共表达了白蚁及其肠道微生物来源的β-葡萄糖苷酶、内切β-1,4-葡聚糖酶、漆酶和木聚糖酶这4种木质纤维素酶,经过SDS-PAGE分析得到了与理论值一致的蛋白条带,同时经过酶活验证,这4种蛋白都具有酶活性。以磷酸处理的微晶纤维素(PASC)为底物,测定了共表达酶粗酶液与单独表达酶混合液的协同作用因子,从还原糖的产量上经计算共表达的粗酶液比单独表达酶的混合液对PASC的降解协同作用提高44%;以滤纸和磷酸处理的玉米芯为底物,测定降解协同作用,分别提高了34%和20%。结果表明,共表达酶的降解效率要高于混合的单组分酶液降解效率的总和。     

具有辅助降解纤维素功能的大斑刚毛座腔菌糖苷水解酶GH61的鉴定、异源表达及功能分析

糖苷水解酶61家族（GH61）属于一类同时具有氧化作用和水解作用的纤维素降解酶类,既具有微弱的纤维素内切酶活性,也可通过氧化作用破坏纤维素晶体结构促进纤维素酶对木质纤维素的降解,在生物质资源的利用方面具有潜在的应用价值。对大斑刚毛座腔菌Setosphaeria turcica的GH61家族基因进行鉴定及生物信息学分析,通过转录组数据分析及荧光定量PCR验证,筛选出受玉米秸秆木质纤维素底物诱导表达的GH61家族基因StGH61-11。将StGH61-11进行重组表达,使用2,6-二甲氧基苯酚氧化反应测定其酶活力并优化诱导条件,表征其酶学性质并检测其对纤维素酶水解木质纤维素的促进作用。结果表明,在S. turcica基因组中存在21个GH61家族基因,且S. turcica在玉米秸秆的诱导下滤纸酶活明显增加,对其进行转录组分析发现,在以玉米秸秆为碳源时GH61家族基因中有11个基因的表达量增加。将其中StGH61-11基因在大肠杆菌中诱导表达,最佳诱导条件为25℃、1 mmol/L IPTG诱导9 h,此时获得的蛋白比活力可达到（54.08±1.67）U/g。重组蛋白StGH61-11的最...     

芒草木质素含量对里氏木霉产木质纤维素酶的影响

[目的]研究芒草木质素含量对里氏木霉产木质纤维素酶的影响。[方法]选择了2组木质素含量差异显著(p0.01,n=3)、纤维素和半纤维素含量相近的芒草材料作底物来培养3株里氏木霉(野生型QM6a、突变型QM9414和Rut C30),对诱导产生的木质纤维素酶的酶活和降解木质纤维素的效率进行分析。[结果]在第Ⅰ组中,Mfl40木质素含量比Msa02低36%(p0.01,n=3),其诱导3株菌生产的木质纤维素酶体积比酶活高于Msa02组1.2~1.8倍(p0.05或者p0.01,n=3);在第Ⅱ组中,Mfl37木质素含量比Mlu13低48%(p0.01,n=3),其生产的木质纤维素酶体积比酶活高于Mlu13材料1.2~3.3倍(p0.05或者p0.01,n=3)。[结论]芒草细胞壁中木质素含量对里氏木霉产木质纤维素酶量有显著负影响。     

培菌白蚁菌圃微生物降解木质纤维素的研究进展

白蚁及其共生微生物协同降解植物细胞壁的机理一直被世界各国科学家所关注。培菌白蚁作为高等白蚁,相比低等食木白蚁具有更多样化的食性,其利用外共生系统“菌圃”,对多种植物材料进行处理。本文综述了菌圃微生物降解木质纤维素的研究进展,以期为深入研究菌圃中木质纤维素降解过程及其机制,并挖掘利用菌圃降解木质纤维素的能力及仿生模拟菌圃开发新的生物质利用系统提供参考。培 菌白蚁在其巢内利用由植物材料修建的多孔海绵状结构——“菌圃”来培养共生真菌鸡枞菌Termitomyces spp.,形成了独特的木质纤维素食物降解和消化策略,使木质纤维素在培菌白蚁及其共生微生物协同作用下被逐步降解。幼年工蚁取食菌圃上的共生真菌菌丝组成的小白球和老年工蚁觅得食物并排出粪便堆积到菌圃上成为上层菌圃。这一过程中,被幼年工蚁取食的共生真菌释放木质素降解酶对包裹在植物多糖外部的木质素屏障进行解聚。菌圃微生物(包括共生真菌)对解聚的木质素基团进一步降解,将多糖长链或主链剪切成短链,使菌圃基质自下而上被逐步降解。最后下层的老熟菌圃被老年工蚁取食,其中肠的内源酶系及后肠微生物将这些短链进一步剪切和利用。因此,蚁巢菌圃及其微生物是培菌白蚁高效转化利用木质纤维素的基础。化学层面的研究表明,菌圃能够实现对植物次生物质解毒和植 物纤维化学结构解构。对共生真菌相关酶系的研究显示可能其在菌圃的植物纤维化学结构和植物次生物质的降解中发挥了作用,但不同属共生真菌间其效率和具体功能不尽相同。而菌圃中的细菌是否发挥了作用和哪些细菌类群发挥了作用等仍有待进一步的研究。相比于低等食木白蚁利用其后肠共生微生物降解木质纤维素,培菌白蚁利用菌圃降解木质纤维素具有非厌氧和能处理多种类型食物两大优势,仿生模拟菌圃降解木质纤维素的机制对林地表面枯枝落叶的资源化利用具有重要意义。     

同步分泌高效纤维素酶和木聚糖酶菌株YB的鉴定及其酶学性质研究

筛选和鉴定可降解木质纤维素的真菌,并研究其产酶特征。采用刚果红平板涂布法,从荔枝腐叶中筛选具有木质纤维素降解能力的真菌,结合ITS-rDNA序列分析进行鉴定,初步测定其产酶条件,然后采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析与Sephadex G-100凝胶层析对硫酸铵沉淀的粗酶液进行分离纯化,对其开展酶学性质研究。结果显示,筛选出一株可降解木质纤维素降解的菌株YB,鉴定为绿木霉(Trichoderma virens)。在发酵过程中,纤维素酶和木聚糖酶的最大活力分别为313.53±26.78 U/mL和18 120.87±500.37 U/mL。分离纯化得到纤维素酶(CMC酶)Ⅰb、Ⅳ和木聚糖酶Ⅰa;通过SDS-PAGE检测,其分子量分别为58.5 kD、22.8 kD和44.5 kD。3种酶的最适酶促反应条件均为:50℃,pH 5.0。其中,木聚糖酶能有效降解玉米芯木聚糖为木糖和多种木寡糖。菌株Trichoderma virens YB可分泌高效木质纤维素降解酶,具有应用于木聚糖酶和木寡糖生产的潜力。     

不同碳源条件下广叶绣球菌转录组分析

【背景】广叶绣球菌(Sparassis latifolia)是一种名贵的食用菌,其木质纤维素降解的分子机制尚不明确。【目的】了解广叶绣球菌在不同碳源条件下木质纤维素降解相关基因表达动态。【方法】通过转录组测序技术对分别以葡萄糖、纤维素+木质素、纤维素及松木屑为碳源的广叶绣球菌基因表达谱进行分析。以葡萄糖为碳源的样本为对照,分别对不同碳源下广叶绣球菌显著差异表达的基因进行功能分析。【结果】Geneontology(Go)富集分析表明,以葡萄糖为碳源的样本为对照,差异表达基因主要富集在碳水化合物利用的过程,如多糖催化过程、碳水化合物催化过程、碳水化合物代谢过程及多糖代谢过程等。碳水化合物活性酶(Carbohydrate-activeenzymes,CAZymes)功能注释表明,碳源种类主要影响了半纤维素和纤维素降解相关糖苷水解酶家族基因的表达,其中涉及半纤维素降解的相关酶基因上调幅度最大。同时,在纤维素+木质素、松木屑为碳源的处理组中一些转录因子基因上调表达显著。【结论】不同碳源显著影响了广叶绣球菌基因表达谱,这种对碳源的适应也可能反映了广叶绣球菌攻击植物细胞壁的机制,研究结果为深入了解广叶绣球菌木质纤维素降解的分子机理和相关功能基因提供了一些参考。     

福寿螺（Ampullaria crossean）内源性多功能纤维素酶基因的克隆

迄今为止已克隆的动物纤维素酶基因都是编码内切—β—1,4—葡聚糖酶或β—葡萄糖苷酶的,还没有有关动物外切—β—1,4—葡聚糖酶基因的报道。并且,动物是否对植物细胞壁的另一主要成分木聚糖具有水解能力也依然是个疑问。已经由草食性软体动物福寿螺的胃液中纯化得到一种纤维素酶,该酶同时具有外切β—1,4—葡聚糖酶、内切β—1,4—葡聚糖酶和内切β—1,4—木聚糖酶等三种活性,是一种多功能纤维素酶(命名为EGX)。在此基础上,从福寿螺胃组织中克隆得到的EGX cDNA开放阅读框全长为1185bp,共编码395个氨基酸。由氨基酸顺序同源和活性部位的保守顺序的比较分析,EGX可归属于糖苷水解酶第10家族。该多功能纤维素酶cDNA在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达的产物具有水解外切β—1,4—葡聚糖酶底物(pNPC),羧甲基纤维素(内切β—1,4—葡聚糖酶的底物)和木聚糖(木聚糖酶的底物)的活力。另外也从福寿螺卵巢组织中获得编码福寿螺多功能纤维素酶．EGX基因,长度为4892bp,含有9个外显子和8个内含子。8个内含子分别位于开放阅读框的74bp、122bp、280bp、336bp、473bp、646bp、753bp和972bp处。以上结果证明了多功能纤维素酶EGX是福寿螺自身产生的,同时也证明了福寿螺具有与微生物相似的纤维素酶系,即也含有内源性的外切β—1,4—葡聚糖酶活力组分。     

毛木耳降解木质纤维素的研究

测定了毛木耳“沪毛一号”菌株瓶栽0—60天期间,其木屑基质中木素纤维素的降解和木质纤维分解酶活性的变化。结果表明,该菌能够同时降解木素、半纤维素和纤维素,尤以分解木素的能力为强(以各自相对百分含量减少计算),故毛木耳为白腐真菌。该菌的多酚氧化酶、羧甲基纤维素酶、滤纸纤维素酶和木聚糖酶的活性高峰均出现于菌丝体发育阶段,在子实体原基发生时(22天),羧甲基纤维素酶、滤纸纤维素酶、木聚糖酶的活性明显下降,在子实体发生后,该三种酶活性又复上升,直到头批耳成熟酶活仍处于较高水平。     

内切-1,4-β-葡聚糖酶在植物细胞生长发育中的作用

内切-1,4-β-葡聚糖酶(EGases)可以催化水解具有1,4-β-葡聚糖主链的多聚糖,如纤维素和木葡聚糖分子,从而参与对细胞壁的修饰.植物细胞中存在一个EGase蛋白家族,且多为分泌蛋白;在植物细胞中还存在另一类跨膜EGase,是细胞壁纤维素生物合成所必需的,但植物EGases在体外具有降解纤维素人造底物羧甲基纤维素(CMC)的能力,而绝大多数植物EGases在活体细胞中并不能有效地降解结晶态纤维素分子和木葡聚糖分子.本文就EGases在细胞伸长、果实成熟和组织器官脱落等发育过程中的作用,以及EGases在植物纤维素合成与降解中的作用进行综述.     

降解木质纤维素放线菌的功能组学分析及工业应用前景

放线菌是一种高GC含量的革兰氏阳性细菌,在陆生、高温的木质纤维素降解生境中占据十分重要的地位.降解木质纤维素菌株的功能基因组分析发现降解纤维素的酶种类和数目相对较多,而降解半纤维素以及果胶成分的酶相对真菌较少.其中,降解纤维素的酶类主要以GH6家族外切酶为主,部分含有GH9和GH48家族的纤维素酶,基因组中还含有AA10家族的多糖裂解氧化酶,因此放线菌可通过持续性水解与氧化双重机制高效降解结晶纤维素.放线菌可通过双精氨酸转运系统快速将已正确折叠的降解酶类分泌至胞外,这些酶分子常具有多个功能结构域,具有耐高温、耐碱性以及高活力等特征.放线菌在木质纤维素降解及次级代谢产物等方面的特点与优势使得其具有巨大的工业应用前景.     

木聚糖酶碳水化合物结合结构域研究进展

木聚糖酶含有催化活性结构域,有时还含有非催化活性结构域,促进酶与底物结合,特别是与不溶性底物的结合及降解,称为碳水化合物结合结构域(CBM),它们在木聚糖降解过程中有重要作用。以下从CBM来源,所属家族类型、对不溶性底物结合特性、与底物结合的特定氨基酸、与催化结构域间的连接肽、特别是对影响木聚糖酶稳定性的5个方面进行了综述,说明CBM对木聚糖酶性质有很大影响。自然界中碳水化合物结构复杂、难以降解,所以认识CBM相关性质对研究其与木聚糖酶的协同作用、提高木聚糖酶活性有重要意义,并根据CBM属性用于改造木聚糖酶相关性质进行了展望。     

猪苓糖苷水解酶家族基因及其差异表达

猪苓与蜜环菌建立共生关系时,猪苓菌丝会反侵染并消解蜜环菌菌索,以获取营养物质,糖苷水解酶是参与这一过程的主要酶类之一。本研究从猪苓转录数据库中获得糖苷水解酶家族基因42类、309个;其编码的糖苷水解酶蛋白含各类结构域344个,以糖苷水解酶结构域glyco＿hydro为主,共计35类173个。对猪苓糖苷水解酶进行的gene ontology (GO)功能注释结果表明,这些蛋白参与的生物学过程以物质代谢及分解过程为主,特别是多糖等大分子物质代谢;181个猪苓糖苷水解酶具有水解酶活性,这些水解酶活性呈多样性分布。与未被蜜环菌侵染的猪苓部位相比,43个糖苷水解酶基因在蜜环菌侵染的菌核部位中差异表达,编码包括glyco＿hydro＿48、cellulase和polysacc＿deac＿1等功能结构域,可能发挥水解几丁质、纤维素酶活性及免疫调节等活性,这为猪苓与蜜环菌互作关系的研究提供了候选基因及蛋白。