罗汉果SgHMGR基因的克隆、分析及原核表达

罗汉果甜苷V是一种葫芦烷型四环三萜类物质,作为主要的活性成分和甜味成分存在于成熟果实中,3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)作为萜类化合物生物合成途径中的第一个限速酶,位于甲羟戊酸(MVA)途径中,是罗汉果甜苷V生物合成途径中的重要调控位点。为了深入了解罗汉果甜苷Ⅴ的生物合成途径,该研究从罗汉果转录组数据中获得一条编码HMGR的unigene,以授粉后3 d的幼果作为实验材料,通过RACE技术获得了1 926 bp的全长序列,经过生物信息学软件分析,发现该基因含有1 749 bp的开放阅读框,编码582氨基酸残基,含2段跨膜区,分别位于50~72 aa和93~115 aa,亚细胞定位预测位于质膜或内质网上,预测该蛋白没有信号肽,系统进化树分析显示与同科植物黄瓜和甜瓜中HMGR基因的同源性最高。该研究采取去掉N端跨膜区的方法,构建原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导在上清和沉淀中均有融合蛋白出现,尤其在25℃诱导过夜后上清中表达最明显。该文是首次对SgHMGR基因全长序列的克隆及原核表达的功能验证,为进一步深化SgHMGR基因在罗汉果甜苷V生物合成途径中的功能及分子调控研究打下基础。     

布鲁氏菌VirB5基因的原核表达及生物信息学分析

[目的]获得高效表达并且抗原性较好的VirB5蛋白,并分析其生物信息学功能。[方法]以羊种布鲁氏菌16M基因组为模板扩增VirB5基因,连接表达载体p ET-32a,并转化至大肠杆菌(DE3)中表达,用SDS-PAGE和Western Blot检测其免疫学特性,采用信息生物学方法对VirB5基因编码蛋白的理化性质、结构、保守结构域进行分析。[结果]成功克隆出VirB5基因,并在大肠杆菌中成功表达,SDS-PAGE和Western Blot证实表达重组蛋白对布鲁氏菌阳性血清具有反应原性,生物信息学方法推测VirB5基因可能在胞内运输功能方面发挥重要作用。[结论]成功克隆出717bp大小的VirB5基因,并在大肠杆菌中成功表达45 k Da大小的蛋白,具有良好的抗原性,且证明VirB5蛋白与布鲁氏菌的胞内运输相关。     

砂梨CONSTANS基因的克隆及原核表达分析

为了探索梨树植物的开花调控机制,本研究以砂梨(Pyrus pyrifolia Nakai)叶片为材料,采用同源序列克隆法,进行了开花调控相关基因CONSTANS的克隆,命名为PyCO,GenBank登录号为KF246572。序列分析表明,该基因包含一个1023 bp的开放阅读框,编码340个氨基酸,推测蛋白质分子量为37.81 kD,等电点为5.95。PyCO蛋白具有典型的植物CO家族的结构特征,含有2个高度保守的B-box及CCT结构域。进化树分析表明,该氨基酸序列与苹果的同源性接近93%,与碧桃、可可树、草莓等其他高等植物的CO类蛋白同源性也在70%以上。原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白,分子量约为58.5 kD,为进一步探索梨树开花调控机理奠定了基础。     

高粱SbGABA-Ts基因的克隆、原核表达及纯化

植物中GABA(γ-氨基丁酸)代谢与植物生长发育、信号传递及逆境响应等过程密切相关,而参与GABA代谢的关键酶GABA-T(γ-氨基丁酸转氨酶)在重要农艺作物中的研究相对滞后。利用同源性分析在高粱基因组数据库中获得两个γ-氨基丁酸转氨酶(SbGABA-T)基因,RT-PCR方法进行基因克隆,并连入原核表达载体pET28a(+),转化E.coli BL21(DE3)进行基因异源表达分析。结果表明,包含SbGABA-T编码区全长的融合蛋白主要在包涵体中表达,而去除了SbGABA-T N端信号肽的融合蛋白以部分可溶的形式存在。进一步优化表达条件,IPTG浓度为1 mmol/L时,16℃低温诱导18h,即可获得大量可溶性融合蛋白。用带His标签的镍柱对融合蛋白进行了纯化。     

人Aurora B基因的克隆、原核表达及生物信息学分析

目的:克隆出人AuroraB基因,并将其于大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中表达,获得重组蛋白.方法:利用TRIzol Reagent 法提取食管癌ECa 109细胞总RNA,RT-PCR后以其cDNA为模板PCR扩增Aurora B基因,构建pET 28a(+)-Aurora B重组质粒,将其转化Rosetta(DE3)菌株,IPTG体外诱导表达重组蛋白.利用生物信息学工具对Aurora B的核酸序列和蛋白功能结构进行分析.结果:成功构建了pET 28a(+)-AuroraB重组质粒,经序列比对,与GenBank上公布的人Aurora B基因序列同源性达到了99％;获得AuroraB蛋白,大小约39kDa,蛋白表达量约占菌体总蛋白的28％.结论:对人AuroraB基因进行克隆、原核表达及生物信息学分析,为深入研究Aurora B在细胞周期调控中的作用机制及后续Aurora B抑制剂的体外筛选奠定基础.     

飞蝗发育相关基因Omb的克隆、原核表达及时空表达分析

【目的】本研究克隆飞蝗Locusta migratoria发育相关的optomotor-blind(Omb)基因,并对其进行序列和表达分析,旨在更好地了解Omb基因在飞蝗翅发育中的作用及为进一步蝗灾的治理和防治提供新的理论依据。【方法】利用RT-RCR扩增飞蝗Omb基因cDNA序列,采用生物信息学软件分析该基因的核苷酸和氨基酸序列,利用MEGA 6. 0构建昆虫纲分子系统进化树;构建重组表达载体pET-30a/LmOmb,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中,SDS-PAGE及Western blot鉴定重组表达蛋白;基于qPCR技术分析Omb基因在飞蝗不同发育时期及成虫不同组织中的表达谱。【结果】克隆获得飞蝗Omb基因部分cDNA序列,命名为LmOmb(GenBank登录号:MG867658),其长792 bp,编码264个氨基酸,在第37-219位氨基酸之间存在一个T-box superfamily保守结构域。同源序列比对分析表明Lm Omb与褐飞虱Nilaparvata lugens Nl Omb氨基酸序列一致性为93%。在IPTG诱导下目标蛋白以6×His标签融合蛋白的形式在宿主菌中得到稳定表达。荧光定量PCR结果显示LmOmb基因在飞蝗不同发育时期均有表达,其中胚胎期的表达量最高,进入若虫期后表达量下降,且各龄若虫之间表达量相对平稳。Lm Omb基因在雌性和雄性成虫的胸部、足、腹部和翅中都有表达,且雌性和雄性之间表达量明显不同。【结论】LmOmb基因可能参与了飞蝗的胚胎发育。研究结果为进一步研究飞蝗LmOmb的功能提供了依据。     

牦牛OB基因的克隆及原核表达

肥胖基因(obese gene,OB gene)表达产物瘦蛋白(leption)具有调节体重、影响动物生长和繁殖率等一系列生物学功能。通过牦牛脂肪组织总RNA的提取,利用RT-PCR克隆出牦牛OB基因的成熟肽cDNA,构建OB基因的原核表达载体OB-pET32a(+),在大肠杆菌表达系统使融合蛋白表达,通过SDS-PAGE检测所表达的融合蛋白。结果表明,克隆的OB基因成熟肽片段为456 bp包含EcoR I和BamH I两个酶切位点,与普通牛、瘤牛该基因的相似性达98.6%。原核表达产物为包涵体形态,大小为31 kD,符合预期结果,为OB基因的高效表达系统的构建奠定基础。     

水貂IGF-Ⅰ基因的克隆、序列分析及原核表达分析

获得水貂IGF-Ⅰ基因的cDNA序列,实现IGF-Ⅰ基因在大肠杆菌中的融合表达。利用RT-PCR技术从水貂肝脏组织扩增出水貂胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）的编码区序列。此序列编码153个氨基酸的前体蛋白质。同源性分析表明IGF-Ⅰ的核苷酸和氨基酸序列与已报道的金丝猴、小熊猫、大熊猫、东北虎、马等哺乳动物的序列高度同源（＞90%）。对位比较发现水貂的信号肽序列具有氨基酸特异性,这些氨基酸是否影响水貂IGF-Ⅰ分子的构型、进而影响功能则需要进一步的研究。将构建的重组表达载体pGEX-6P-1-IGF-Ⅰ转入大肠杆菌BL21进行原核表达,得到高效融合表达,融合蛋白分子量约为34 KD。Western-blotting杂交证实了表达蛋白的抗原活性。本研究成功克隆、表达了水貂IGF-Ⅰ基因,分析和预测了其结构和功能,为进一步的生物活性研究打下基础。     

大肠杆菌glgC基因的克隆及原核表达

以大肠杆菌BL21染色体DNA为模板,根据glgC基因的全序列设计了1对引物,在优化的PCR反应条件下扩增出了glgC基因片段,测序结果显示该片段大小为1296 bp,编码432个氨基酸残基。将该基因克隆到原核表达载体pET-28a-c( )中,重组载体pET-glgC转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳鉴定,得到了与理论推算的glgC基因表达产物分子质量(约53 kD)相符的特异蛋白条带。     

罗非鱼无乳链球菌Sip基因的克隆、表达及免疫原性分析

表面免疫原性蛋白(Surface Immunogenic Protein,Sip)是B群链球菌(Group B Streptococcus,GBS)的一种表面蛋白,在GBS多种血清型的菌株中均有表达。研究从实验室分离到的罗非鱼无乳链球菌广东株的基因组DNA中扩增出Sip基因,构建原核表达载体pColdII-Sip,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)菌株。经诱导表达、SDS-PAGE电泳检测显示重组蛋白主要以可溶形式表达。重组蛋白用亲和层析的方法纯化,蛋白纯度达98%。纯化后的重组蛋白免疫罗非鱼(Oreochromis niloticus,GIFT strain)以分析其免疫原性。受免鱼免疫14d后进行人工攻毒试验,免疫组的相对保护率为70%—87%。酶联免疫吸附试验(Elisa)显示受免鱼对重组蛋白产生了较好的免疫应答,免疫剂量为3μg/g和5μg/g时受免鱼血清抗体滴度可达1:128000。研究结果显示重组蛋白Sip具有较强的免疫原性和保护作用,Sip基因可作为罗非鱼链球菌基因工程亚单位疫苗候选基因。     

小鼠Klf4基因的克隆及原核表达分析

目的克隆Klf4基因并对其重组蛋白进行原核表达及分析。方法提取胎鼠皮肤mRNA后反转录为cDNA序列,用一对两端引入特定酶切位点引物,从该cDNA中扩增出Klf4基因编码区序列,将其克隆到pEasy-T3载体上。对质粒双酶切并回收其中Klf4基因片段后,克隆入pET-52b（＋）载体后转化Origmai B（DE3）型大肠杆菌,用IPTG诱导表达,最后采用SDS-PAGE对重组蛋白进行鉴定及分析。结果对所克隆的Klf4mRNA蛋白编码区的DNA序列分析表明,klf4CDS区包括终止密码子在内为1452 bp,与参照序列对比仅有四处存在差异,不仅其同源性达到99.72%,且其氨基酸序列同源性为100%;在IPTG诱导下pET-52b（＋）-Klf4重组质粒可表达与预期相符的约为57×103的蛋白质;经IPTG刺激后重组蛋白表达明显上调,其中IPTG为0.4 mol/L时效果最佳。结论从胎鼠皮肤中克隆的Klf4基因可在原核中表达。     

仙台病毒F基因的克隆及原核表达

目的利用原核表达系统表达仙台病毒(Sendai Virus)F蛋白主要抗原片段FP(S),并对表达产物进行免疫学初步研究。方法根据GenBank公布的仙台病毒F蛋白(gi:9627219)的基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR扩增出F基因的主要抗原片段FP(S),插入pMD-18-T载体中,鉴定正确后克隆入pQE31原核表达载体中,将鉴定正确的pQE31-FP(S)转化大肠埃希菌M15,IPTG诱导表达,对大肠埃希菌裂解物进行SDS-PAGE和Western-blot验证。结果大肠埃希菌表达的FP(S)相对分子质量约26×103,与预期相符;能与SeV阳性血清发生特异性反应,出现单一条带。结论原核表达的FP(S)蛋白有良好的抗原性,为检测仙台病毒抗体的ELISA检测方法的研究奠定了基础。     

新基因PRR11的克隆、原核表达及鉴定

克隆新基因PRR11的开放阅读框区,构建其原核表达载体,并进行表达检测及鉴定.以Hela细胞cDNA为模板,RT-PCR扩增PRR11基因,克隆入原核表达载体PET-28a中,酶切、测序鉴定确认获得PRR11基因的重组原核表达载体PET-28a-PRR11.然后把PET-28a-PRR11重组载体转化到BL21中,经IPTG诱导蛋白表达,提取细胞蛋白并采用SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况.结果表明成功扩增了PRR11基因,双酶切、测序鉴定证实目的基因成功克隆到原核表达载体PET-28a中,目的蛋白成功表达.成功构建的PRR11基因的原核表达载体,及PRR11的重组蛋白表达产物,为进一步研究PRR11的基因功能奠定了基础.     

中华蜜蜂SRP9基因的克隆、序列分析及原核表达

【目的】探究中华蜜蜂Apis cerana cerana信号识别颗粒9(signal recognition particle 9,SRP9)基因的序列,获得纯化的重组蛋白,为探究其蛋白功能奠定基础。【方法】利用RT-PCR方法,以中华蜜蜂的c DNA为模板扩增中华蜜蜂SRP9基因编码区,并通过软件MEGA5.1构建系统发育树,运用Predice Protein和SWISS-MODEL等软件预测分析蛋白结构;用大肠杆菌Escherichia coli表达系统进行原核表达;采用尿素洗脱法进行重组蛋白纯化。【结果】扩增得到的中华蜜蜂SRP9基因编码区长为237 bp,命名为Acc SRP9。该基因编码78个氨基酸,编码蛋白的相对分子量为9.36 k D,等电点为9.17。系统进化树分析表明,Acc SRP9与西方蜜蜂Apis mellifera的SRP9和小蜜蜂Apis florea的SRP9聚成一支。蛋白质二级结构预测发现其含有2个α-螺旋区和3个β-折叠区。利用同源建模获得蛋白质的三维结构。将Acc SRP9连入表达载体p GEX-6P-1并在BL21(DE3)中进行原核表达,发现该重组蛋白表达在包涵体中,经蛋白纯化,最终获得了N端带GST标签的重组蛋白p GEX-6P-1-SRP9。【结论】本研究成功克隆了中华蜜蜂SRP9基因Acc SRP9,对其序列进行了分析,并获得了带有标签的重组蛋白,为进一步研究该基因的功能提供参考和材料。     

家蝇溶菌酶MDLZM2基因的克隆、序列分析及原核表达

对家蝇溶菌酶(Musca domestica lysozyme,MDLZM2)基因进行克隆、序列分析,构建原核表达载体并在大肠杆菌中表达。从Gen Bank家蝇基因组中筛选获得MDLZM2基因。以该基因的序列设计引物,进行PCR扩增,测序分析获得该基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽、二级结构、三级结构和保守结构域等方面进行预测和分析。构建p EASY-E1-MDLZM2重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S Chemically Competent Cell中进行诱导表达及纯化。结果表明MDLZM2基因ORF全长552 bp,编码183个氨基酸,理论分子量21.2 k Da;等电点为6.13,具有Lysozyme家族的蛋白保守结构域。成功构建重组原核表达p EASY-E1-MDLZM2并诱导表达、纯化重组蛋白,为进一步研究该蛋白的生物学及免疫学活性奠定了基础。     

人TRAP1基因的克隆、原核表达及表达条件优化

应用RT-PCR技术,从人白血病多药耐药细胞株K562/ADR中扩增出肿瘤坏死因子受体相关蛋白l(tumor necrosis factor receptor-associated protein1,TRAP1)基因的cDNA.选择Nde I和Xho I分别作为上下游引物的酶切位点,将TRAP1基因克隆到带有6×His标签的pET-28a(+)的载体上.重组质粒转化大肠杆菌DH5α中,涂布于含卡那霉素的LB琼脂培养基上,经双酶切鉴定后的阳性克隆送去测序.测序成功的重组质粒pET28a(+)-TRAP1转化大肠杆茵BL21 (DE3)中,在IPTG的诱导下,成功表达重组蛋白TRAP1.通过改变诱导温度、诱导时机、IPTG浓度及诱导时间,找出最佳表达条件,使重组蛋白TRAP1表达量最高.结果表明,在39℃条件下,0D600达到0.8时,经终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导6h,目的蛋白的表达量最高.该研究为纯化出TRAP1蛋白,进一步研究该蛋白的结构和功能奠定了基础.     

菘蓝CYP83A1基因的克隆、表达特性及原核表达分析

本研究对菘蓝CYP83A1基因进行了克隆、表达特性及原核表达研究。结果表明,IiCYP83A1基因组DNA全长为1 622 bp,包含2个外显子和1个内含子;cDNA全长为1 512 bp,编码503个氨基酸。IiCYP83A1编码的蛋白包含2个跨膜结构域,无信号肽,主要定位于内质网膜,属于亲水性蛋白,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,与萝卜、欧洲油菜、西兰花和芜菁等植物的CYP83A1蛋白具有较高的同源性。qRT-PCR结果表明,IiCYP83A1在不同组织中的表达具有显著性差异,表现为茎叶果花和根;在幼苗期、生长期和花期的表达量显著高于萌芽期;茉莉酸甲酯(MeJA)和伤害处理能够显著促进该基因的表达,而低温(4℃)和水杨酸(SA)处理则对其表达具有一定的抑制作用。将克隆到的IiCYP83A1基因连接到表达载体pET-28a上,构建原核表达载体pET-28a-IiCYP83A1并对其进行原核表达。SDS-PAGE结果显示,在E.coli BL21中成功诱导表达了CYP83A1蛋白,与预期蛋白分子量大小一致。本研究结果可为进一步研究IiCYP83A1的功能提供实验依据。     

花生防御素基因的克隆及原核表达

定基础.     

蜜蜂残翼病毒VP2基因密码子优化、原核表达及免疫原性分析

蜜蜂残翼病毒(Deformed wing virus,DWV)是引发世界各地大范围蜂群损失的主要嫌疑对象,间接给农业生产带来了巨大的经济损失。为了探究DWV结构蛋白VP2的免疫原性,深入研究该蛋白的功能和为制备DWV单克隆抗体提供可靠的免疫原,本研究从DWV分离株(GenBank登录号:MF770715)扩增得到VP2基因,同时根据大肠杆菌密码子的偏嗜性对VP2基因进行优化并合成,分别将优化前和优化后的VP2基因克隆到pET-28a载体上,获得重组质粒pET-28a-VP2和pET-28a-opti-VP2,分别转化至宿主菌BL21(DE3)中诱导表达,经SDS-PAGE和Western Blot检测,显示仅优化后的opti-VP2基因高效表达,然后对最佳表达条件进行摸索。在此基础上,对重组蛋白纯化后分3次免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠,同时设置纯化病毒组和空白对照组,对免疫小鼠的抗体水平和淋巴细胞增殖指数(SI)以及干扰素(IFN-γ)、白介素IL-2和IL-4水平进行检测。结果表明,重组VP2蛋白能够诱导产生特异性抗体,促进淋巴细胞增殖,提高IFN-γ、IL-2和IL-4水平,具有良好的免疫原性,为深入研究DWV VP2蛋白功能和开发防治DWV的生物制剂提供了帮助。     

金针菇谷氨酸脱氢酶基因的克隆及原核表达

利用简并引物和RT-PCR方法从金针菇(Flammulina velutipes)幼嫩子实体中克隆获得FvGDH全长cDNA序列.构建入门载体pGWC-FvGDH,利用Gateway克隆技术的LR反应构建原核重组表达载体pDESTl7-FvGDH,转化大肠杆菌BL21(DE3).通过IPTG法诱导表达融合蛋白并进行表达条件优化.SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,融合蛋白相对分子质量约为53 kD,与预测的一致.最佳表达条件为温度30℃、IPTG浓度0.4mmol/L、诱导4 h.融合蛋白表达量较高,实现了FvGDH的高效表达,并利用Western blotting对其特异性进行鉴定.FvGDH基因高效原核表达体系的成功建立,为进一步研究FvGDH的酶促动力学奠定了基础.