重组枯草芽孢杆菌全细胞催化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷

2-O-α-D-甘油葡糖苷是一种在食品、化妆品、保健品及医药领域有着重大应用前景的高附加值产品,但国内仍未实现2-O-α-D-甘油葡糖苷的工业化生产,且鲜有关于2-O-α-D-甘油葡糖苷合成的相关报道。文中旨在开发一种利用食品安全级重组枯草芽孢杆菌全细胞催化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的方法,通过构建一株异源表达肠膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶(Sucrose phosphorylase,SPase)的重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168/pMA5-gtfA,并将其用作全细胞催化剂合成2-O-α-D-甘油葡糖苷,通过优化培养温度、时间及全细胞转化条件,提高其转化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的产量。结果表明,重组枯草芽孢杆菌B. subtilis 168/pMA5-gtfA在30℃下培养20 h,菌体裂解物酶活力最大达1.43 U/mL,并且在1 mol/L蔗糖、2.5 mol/L甘油、pH 7.0、菌体OD600为40、30℃下全细胞转化反应48h,共生成2-O-α-D-甘油葡糖苷189.3g/L,平均转化速率为15.6mmol/(L·h),蔗糖转化率约为75.1%,...     

蔗糖磷酸化酶的研究进展

蔗糖磷酸化酶属于糖苷水解酶13家族,能够催化蔗糖的可逆磷酸解。利用其广泛的底物混杂性,蔗糖磷酸化酶可以将葡萄糖基转移至不同的受体合成熊果苷、甘油葡萄糖苷、低聚糖及多酚化合物的衍生物等产物,这些催化产物可广泛应用于食品、药品、化妆品等行业。随着酶催化技术和蛋白质工程的发展,蔗糖磷酸化酶受到了越来越多的关注,该酶的应用范围也得到了扩大。本文综述了近年来蔗糖磷酸化酶在酶的来源、结构、功能及应用领域等的研究进展,同时讨论了该酶的蛋白质工程改造方法与局限性,并展望了该酶可能的研究方向。     

全细胞催化生产N-乙酰神经氨酸的条件优化

【目的】N-乙酰神经氨酸有多种生物学功能,其在治疗流感、神经性疾病、炎症和肿瘤等方面具有重要的医药价值。N-乙酰神经氨酸现有的生产方法产量低、成本高,难以满足医药工业大规模的需求,因而急需建立一种经济高效的生产方法。【方法】在前期研究中,构建了一株产N-乙酰神经氨酸的代谢工程菌(Escherichia coliΔnanTEK/pNA),本研究通过单因素试验对工程菌生物转化生产N-乙酰神经氨酸的过程进行优化,包括工程菌细胞培养条件(培养温度和时间)和全细胞生物转化的各种条件(转化温度、时间、表面活性剂等)。【结果】经过条件优化后,建立了全细胞催化法生产N-乙酰神经氨酸的工艺流程,使N-乙酰神经氨酸的产量提高到294.39 mmol/L。【结论】该方法具有操作简便、高效和经济的优势,为N-乙酰神经氨酸的规模化生产奠定了基础。     

蔗糖磷酸化酶的分离纯化及其催化合成α-熊果苷的研究

考察了肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)G123厌氧发酵产蔗糖磷酸化酶下游的分离纯化工艺.收集的菌体经超声破碎得到粗酶液,通过硫酸铵沉淀、透析、阴离子交换层析分离后获得了电泳纯的蔗糖磷酸化酶,酶活回收率为31.7%,酶的分子量约为55.7 kD,纯化后的蔗糖磷酸化酶比活为115.3 U/mg.该酶在中性及偏酸性(pH5.5-8.0)情况下,酶稳定性较好,较报道的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)B-1149的pH稳定范围宽.同时该酶在37℃保存2 h,酶活几乎没有下降.利用获得的纯酶以氢醌和蔗糖为底物催化合成α-熊果苷,在23 U/mL的酶反应体系中,60%蔗糖、5%氢醌、pH7.5,37℃,反应12 h,氢醌转化率达到16.3%,α-熊果苷的产量为20g/L.     

重组大肠杆菌产蔗糖磷酸化酶的酶学性质及其催化合成α-熊果苷

利用重组大肠杆菌Escherichia coli Rosetta(DE3)/pET-SPase发酵生产蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7,Sucrose phosphorylase,SPase)。收集的菌体经高压破碎后离心得到粗酶液,通过镍NTA亲和层析、超滤除盐后得到电泳纯的SPase,纯化后的SPase的比酶活是原来的2.1倍,酶活回收率达到82.7%。经SDS-PAGE电泳测定,重组SPase的分子量约为59 kDa。该酶在不高于37℃,pH 6.0~6.7的条件下比较稳定,最适催化温度与最适催化pH分别为37℃,pH 6.7,该酶对蔗糖的米氏常数(Km)为7.3 mmol/L,最大反应速率(Vmax)为0.2μmol/(min.mg)。此外文中还以蔗糖和氢醌为底物,利用重组SPase催化合成α-熊果苷。其最佳反应条件为:20%蔗糖,200 U/mL的酶液,1.6%氢醌,pH 6.0~6.5,25℃,反应21 h。α-熊果苷的摩尔产率为78.3%,α-熊果苷的产量为31 g/L。     

蔗糖富集环境中蔗糖磷酸化酶的酶学性质研究与改造

【背景】蔗糖富集土壤是蔗糖磷酸化酶的重要来源之一。此酶能以较廉价的蔗糖为底物进行转葡萄糖基反应,改善受体底物的理化性质,因而具有重要的应用价值。【目的】研究蔗糖富集土壤中蔗糖磷酸化酶的酶学性质和转糖苷活性,为其更优质的改造提供材料和理论基础。【方法】将宏基因组中获得的蔗糖磷酸化酶基因克隆到表达载体上构建重组大肠杆菌,诱导表达并进行镍亲和层析纯化蛋白。以蔗糖为底物测量重组酶的基本酶学性质,研究其对糖类底物的转糖苷活性。通过底物通道分析,利用反向PCR技术对其第155位点进行饱和突变,并测定突变体基本酶学性质和转糖苷活性。【结果】纯化的酶蛋白分子量大小约为56 kD,活性状态时以三聚体形式存在。在以蔗糖为底物时,最适温度和最适pH值分别为55°C和6.5;Km和Vmax值分别为23.1±2.4 mmol/L和407.9±8.5μmol/(mg·min),对第155位点进行了定点饱和突变,获得了部分酶学性质或转糖苷活性改善的突变体。【结论】宏基因组中蔗糖磷酸化酶的研究丰富了酶学数据,并通过分子改造获得了部分性质更优的突变体,为转糖苷活性关键氨基酸的研究和该酶的工业应用奠定了基础。     

两种耐热磷酸化酶的构建及高效催化合成红景天苷

目的:使用表达耐热蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌重组工程菌E. coli BL21/pET-Spase和耐热纤维二糖磷酸化酶的大肠杆菌重组工程菌E. coli BL21/pET-Cpase,发酵培养后粗酶液作为催化剂,以价格低廉的蔗糖为原料合成红景天苷。方法:分别构建耐热蔗糖磷酸化酶和耐热纤维二糖磷酸化酶大肠杆菌重组菌,然后将重组菌、蔗糖、酪醇和磷酸混合,得到反应混合物,使反应混合物在45℃下转化,而产生红景天苷。结果:在耐热蔗糖磷酸化酶酶液1200 U/L、耐热纤维二糖磷酸化酶酶液500 U/L、蔗糖110 g/L、酪醇30 g/L和磷酸50 m M的浓度下,反应条件为pH 7.0、温度45℃、转速50转/分、反应时间32小时后,红景天苷浓度达到23.7 g/L。结论:本研究使用蔗糖磷酸化酶和纤维二糖磷酸化酶联合催化的工艺,成功地高收率合成了红景天苷。同时,本研究构建的耐热磷酸化酶酶活高,处理简单,为拓展糖苷类似物的合成提供了一种新的方法。     

生物转化-从全细胞催化到代谢工程

与传统的化学合成方法相比,利用生物的手段转化生产活性化合物及其衍生物无疑具有更大的吸引力。随着用于生物转化微生物种类的增多,生物转化的应用领域不断得到扩大。生物转化的发展经历了野生型全细胞催化,基因工程微生物全细胞反应,以及利用系统分析和代谢工程进行全局性调控等几个阶段。以下对这一发展趋势及相关研究的最新进展作一简要综述。     

全细胞催化合成阿糖胞苷工艺的研究

以阿糖尿苷和胞嘧啶为原料,采用枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis A302作为全细胞催化剂进行阿糖胞苷的生物合成,通过单因素与正交试验的考察,得到了全细胞催化合成阿糖胞苷的最佳反应条件:反应初始pH为7.0,反应温度为36℃,催化剂添加量为250 mg,摇床转速为190 rpm,该条件得到的阿糖胞苷收率达到65.3％.该方法操作简单,反应体系杂质较少,是合成阿糖胞苷的一种有效可行的方法.     

百合鳞茎淀粉磷酸化酶提取条件的优化

为深入研究百合鳞茎淀粉磷酸化酶（SP）的性质及其在鳞茎淀粉代谢中的生理作用,本试验确定了兰州百合鳞茎内SP的最佳提取和测定条件,并对部分酶学性质进行了初步探索。结果表明：SP的最适提取缓冲液为pH5.8的琥珀酸缓冲液;最佳反应体系为以25 mmol·L^-1的Glc-1-P为底物,在30℃条件下反应10 min。在pH5~6范围内,SP活性最高;百合鳞茎的SP不易保存且不耐热,4℃条件下保存12 h,酶活力最高残留50%;40℃条件下保存30 min后,SP活力几乎完全丧失。     

响应面法优化酶法转化合成维生素C糖苷（AA-2G）条件的研究

采用Design—Expert软件的Central Composite Design（CCD）响应面设计对环糊精葡萄糖苷转移酶转化合成糖基抗坏血酸（AA-2G）的五个主要因素（转化时间、转化温度、pH、Vc浓度、β-环糊精浓度）进行了研究。采用降维分析方法对pH与转化时间、转化温度、Vc浓度、β-环糊精浓度以及反应温度与反应时间的交互作用对酶法转化合成AA-2G的影响进行了分析。建立了影响因素与响应值之间的回归方程,根据回归方程优化得到最佳转化条件为：转化时间25h,温度36．5℃,pH5．4,Vc72dL,β-环糊精55g／L。在此条件下,AA-2G的理论产量为10．06g／L,在验证实验中AA-2G的产量为9．76g／L,与预测的理论产量接近,比优化前提高了33％。     

鸡减蛋综合征病毒(EDSV)基因组右末端结构的分析

从中国发病鸡中分离的鸡减蛋综合征病毒（ＥｇｇＤｒｏｐＳｙｎｄｒｏｍＶｉｒｕｓ,ＥＤＳＶ）弱毒株（ＡＡ－２）,其基因组全长约为３３ｋｂ。用限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ水解ＥＤＳＶ全基因组,构建了以ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡ（ＫＳ＋）为载体的右末端片段的克隆（约４．２ｋｂ）,对其进行了序列测定和结构分析。该片段全长４１８３个碱基对（ｂｐ）,位于基因组右末端８７．３ｍ．ｕ．－１００ｍ．ｕ．。结果显示,该片段与哺乳动物腺病毒右末端Ｅ４区结构不同,与禽Ⅰ型腺病毒代表株ＣＥＬＯ右末端片段亦无同源性。本文为深入了解ＥＤＳＶ基因组结构特点,ＥＤＳＶ与其他腺病毒基因结构与功能的进化关系和ＥＤＳＶ载体的构建奠定了分子生物学基础     

酶法合成2-氧-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)条件的研究

采用单因素优化法对环糊精葡萄糖苷转移酶(CGTase)合成糖基抗坏血酸(AA-2G)条件进行优化,AA-2G的产量为2.76 g/L,比未优化前0.46g/L提高了500%。再采用响应面法对AA-2G合成条件进行优化。由Plackett-Burman法筛选出三个主要因素为:pH、V_C和麦芽糊精浓度;由最陡爬坡实验得出最佳响应面区域;最后由Box-Behnken实验,得到最优条件为:pH 5.51,V_C36.16g/L,麦芽糊精28.54 g/L,转化时间24 h,温度37℃。在此条件下,AA-2G的理论产量为3.15 g/L,通过验证实验,得出AA-2G的产量为3.13 g/L,与预测的理论值接近,比单因素优化的结果(2.76g/L)提高了14%。     

正交试验优化青防肿痛外敷散纯化工艺

目的:优选青防肿痛外敷散最佳纯化工艺。方法:以干膏率、青藤碱及粉防己碱转移率为指标,设置综合评分。单因素考察筛选直接沉淀法和水沉淀法,正交试验法优选水沉淀法中最佳相对密度、放置时间和加水倍量,将水沉淀法和直接沉淀法及纯化前试验数据对比,并将最佳纯化工艺做三批重复性验证试验。结果:水沉淀法最佳工艺为将滤液减压浓缩至相对密度为1.10~1.15(70℃)的稠膏,稠膏加7倍量的水搅匀,放置48 h。单因素试验结果证明水沉淀法优于直接沉淀法。重复性试验验证结果证明工艺稳定可靠。结论:此纯化工艺可在保留活性成分的同时,有效的去除杂质,最大程度减少使用剂量,为后期制剂成型和中试放大生产研究奠定了良好基础。     

AFP蛋白芯片技术的检测流程优化

目的:通过优化现有的蛋白芯片检测过程,在保证检测准确性的同时缩短甲胎蛋白(Alpha Fetal protein,AFP)的检测时间,提高检测效率,为原发性肝癌的筛查提供经济、便捷、省时、有效的检测方法。方法:本研究在传统蛋白芯片检测流程(1-1.5小时)的基础上,通过优化检测流程将检测时间缩短至18分钟,并且通过和传统方法进行比较,评价该优化方法的检测效能。结果:与传统蛋白芯片检测方法相比,本优化方法的检测时间缩短至18分钟。重复检测同一样本,传统方法 AFP水平为16.50±1.172ng/m L,优化方法 AFP水平为18.33±1.029 ng/m L,结果无明显统计学差异(P=0.251)。结论:本研究成功地优化了AFP的蛋白芯片检测流程,在缩短检测时间的同时,保证了检测的准确率,是一种经济省时易操作的AFP检测方法。     

Sucrose transport by Streptococcus mutans. Evidence for multiple transport systems

The transport of sucrose by selected mutant and wild-type cells of Streptococcus mutans was studied using washed cocci harvested at appropriate phases of growth, incubated in the presence of fluoride and appropriately labelled substrates. The rapid sucrose uptake observed cannot be ascribed to possible extracellular formation of hexoses from sucrose and their subsequent transport, formation of intracellular glycogen-like polysaccharide, or binding of sucrose or extracellular glucans to the cocci. Rather, there are at least three discrete transport systems for sucrose, two of which are $\text{phospho}\text{enol}\text{pyruvate-dependent}$ phosphotransferases with relatively low apparent $\text{K}{}_{\mathrm{<mtext>m</mtext>}}$ values and the other a non-phosphotransferase (non-PTS) third transport system (termed TTS) with a relatively high apparent $\text{K}{}_{\mathrm{<mtext>m</mtext>}}$. For strain 6715-13 mutant 33, the $\text{K}{}_{\mathrm{<mtext>m</mtext>}}$ values are 6.25·10^?5 M, 2.4·10^?4 M, and 3.0·10^?3 M, respectively; for strain NCTC-10449, the $\text{K}{}_{\mathrm{<mtext>m</mtext>}}$ values are 7.1·10^?5 M, 2.5·10^?4 M and 3.3·10^?3 M, respectively. The two lower $\text{K}{}_{\mathrm{<mtext>m</mtext>}}$ systems could not be demonstrated in mid-log phase glucose-adapted cocci, a condition known to repress sucrose-specific phosphotransferase activity, but under these conditions the highest $\text{K}{}_{\mathrm{<mtext>m</mtext>}}$ system persists. Also, a mutant devoid of sucrose-specific phosphotransferase activity fails to evidence the two high affinity (low apparent $\text{K}{}_{\mathrm{<mtext>m</mtext>}}$) systems, but still has the lowest affinity (highest $\text{K}{}_{\mathrm{<mtext>m</mtext>}}$) system. There was essentially no uptake at 4°C indicating these processes are energy dependent. The third transport system, whose nature is unknown, appears to function under conditions of sucrose abundance and rapid growth which are known to repress $\text{phospho}\text{enol}\text{pyruvate-dependent}$ sucrose-specific phosphotransferase activity in S. mutans. These multiple transport systems seem well-adapted to S. mutans which is faced with fluctuating supplies of sucrose in its natural habitat on the surfaces of teeth.     

核苷类药物酶法合成研究进展

由于核苷类似物具有很高的抗病毒活性,因为而已成为医药工作者研究的重点。运用酶法合成核苷类似物．已经显示了巨大的优势。本文综述了酶法合成核苷类似物的产生菌种和酶系,以及它们的催化机理,并罗列了已经用于生产或较有使用价值的菌种。     

Small-molecule glucosylation by sucrose phosphorylase: structure-activity relationships for acceptor substrates revisited

Sucrose phosphorylase catalyzes the O-glucosylation of a wide range of acceptor substrates. Acceptors presenting a suitable 1,2-diol moiety are glucosylated exclusively at the secondary hydroxyl. Production of the naturally occurring compatible solute, 2-O-α-d-glucopyranosyl-sn-glycerol, from sucrose and glycerol is a notable industrial realization of the regio- and stereoselective biotransformation promoted by sucrose phosphorylase. The acceptor substrate specificity of sucrose phosphorylase was analyzed on the basis of recent high-resolution crystal structures of the enzyme. Interactions at the acceptor binding site, observed in the crystal (d-fructosyl) and suggested by results of docking experiments (glycerol), are used to rationalize experimentally determined efficiencies and regioselectivities of enzymatic glucosyl transfer.     

多酶级联反应合成能够促进肠道益生菌生长的纤维寡糖

聚合度2–6的可溶性纤维寡糖是一种具有多种生物功能的低聚糖,它能够促进双歧杆菌(Bifidobacteria)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracei)等肠道益生菌的增殖,因此对人体肠道微生态具有调节作用。本研究通过在大肠杆菌中表达纤维寡糖磷酸化酶(cellodextrin phosphorylase,CDP),构建Cc 01菌株,并与之前构建的COS 01菌株联合使用,建立了基于COS 01、Cc 01的三酶级联反应催化底物葡萄糖和蔗糖合成纤维寡糖反应体系。经过优化后,最终可溶性纤维寡糖的产量达到97g/L,纯度约为97%,其中含有纤维二糖(16.8wt%)、纤维三糖(49.8wt%)、纤维四糖(16.4 wt%)、纤维五糖(11.5 wt%)和纤维六糖(5.5 wt%)。在纤维寡糖对益生菌株生长促进作用的测试中,以菊粉、低聚木糖、低聚果糖为基准,干酪乳杆菌(WSH004)、副干酪乳杆菌(WSH005)以及嗜酸乳杆菌(WSH 006)利用纤维寡糖(聚合度2–6)为碳源进行生长后,益生菌的生物量(OD600)相比对照增加约2倍。该研究证明了三酶级联反应能够高效合成纤维寡糖,并表明聚合度2–6的纤维寡糖是一类具有促进肠道微生物增殖的功能性碳水化合物。