中国家蚕抗菌肽ABP-CM4在E.coli中的融合表达及活性分析

参照天然抗菌肽CM4(ABP-CM4)氨基酸序列和大肠杆菌偏爱密码子,采用rPCR法获得CM4基因后重组到表达载体pET32a上,在E.coli中融合表达。表达产物以可溶性存在,经Ni2 -NTA琼脂糖亲和层析获得融合蛋白,再经甲酸切割、亲和层析和阳离子交换层析,得到纯化的重组抗菌肽。琼脂糖扩散法和液相测定法证明了纯化的抗菌肽具有抗菌活性。     

新型rhNDPK-A工程菌的构建及表达产物纯化研究

目的 :为简化纯化过程 ,获得有临床研究价值的rhNDPK -A蛋白 ,构建新型rhNDPK -A基因的表达质粒 ,利用 6×His标签以Ni+ -NTA亲和层析柱纯化蛋白。方法 :将抑癌基因nm2 3-H1从质粒PBVNMH1中亚克隆于带有纯化标签的表达载体pQE4 0中。IPTG诱导表达目的蛋白。通过镍离子螯合层析柱一步纯化法纯化目的蛋白。结果 :pQE - 4 0中亚克隆的nm2 3-H1序列完全正确 ;目的蛋白在大肠杆菌M15中的表达量可达 4 9.6 % ;Ni+ -NTA亲和层析柱一步纯化后蛋白纯度为 93%。结论 :构建了带有 6×His纯化标签的新型rhNDPK -A基因表达质粒pQE -nm2 3H1,所构建质粒能高效表达目的蛋白 ,利用Ni+ -NTA亲和层析柱简便高效地纯化了表达产物。     

PTD-hEGF融合蛋白在大肠杆菌中的表达及活性分析

为获得hEGF在大肠杆菌中的高效表达,构建了pPTD-hEGF原核表达载体。将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.3mmol/LIPTG诱导,PTD-hEGF融合蛋白进行了有效表达,表达产物主要形成了包涵体。经Ni2 -NTA亲和层析纯化,融合蛋白的纯度达99.5%。MALDI-TOF-MS分析证明表达的融合蛋白氨基酸序列完全正确。PTD-hEGF融合蛋白能明显促进HEK-293细胞的分裂和生长。     

含蛋白转导域的SARA/SBD融合蛋白的原核表达、纯化及生物学活性鉴定

目的:SARA/SBD是纤维化形成过程中的负性调节因子。原核表达、纯化含反式激活蛋白(TAT)蛋白转导域(PTD)的TAT PTD-SARA/SBD融合蛋白,并鉴定其生物学活性。方法:将TAT PTD-SARA/SBD基因克隆入带His标签的原核表达载体pET-44a(+)中,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,表达产物经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化后,SDS-PAGE和Western印迹鉴定目的蛋白;用人腹膜间皮细胞系(HPMC),通过免疫细胞化学方法检测其穿膜能力,及与TGF-β1信号通路中Smad2因子的共定位情况。结果:用基因工程方法表达和纯化了TAT PTD-SARA/SBD融合蛋白,目的蛋白约占菌体总蛋白的20%左右,且以可溶形式表达,经Ni2+-NTA纯化后,所获蛋白纯度高于95%(HPLC归一法);功能学实验结果显示该蛋白能穿过胞膜,主要定位于胞核,且与Smad2因子具有核内共定位。结论:表达了TAT PTD-SARA/SBD融合蛋白,该蛋白具有生物学活性。     

抗菌肽PekⅡ基因在大肠杆菌中的融合表达及初步纯化

目的：研究抗菌肽PekⅡ基因在大肠杆菌中的融合表达并初步纯化。方法：根据大肠杆菌密码子的偏好性,人工设计并合成2段核苷酸序列,退火获得PekⅡ基因;将此基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2中,构建成抗菌肽基因PekⅡ融合表达载体pGEX-PekⅡ,转化至大肠杆菌BL21中,用IPTG进行诱导。取超声破碎后的上清经Glutathione SepharoseTM4亲和层析得到纯化融合蛋白。结果：PCR和测序表明已获得正确PekⅡ编码基因,SDS-PAGE显示29kD处有特异性的蛋白条带出现,纯化得到的GST-PekⅡ经MALDI-TOFMS分析得出其相对分子质量为29553．03。结论：抗菌肽PekⅡ基因在大肠杆菌中的融合表达获得成功,初步纯化得到纯品。     

迟眼蕈蚊抗菌肽BhSGAMP-1-S在大肠杆菌中的优化表达及其活性分析(英文)

【目的】BhSGAMP-1 是迟眼蕈蚊唾液腺抗菌肽,为了能够更好的了解其分子特性,我们将其表达、纯化并进行了活性测定。【方法】依据大肠杆菌稀有密码子设计并合成了抗菌肽基因 BhSGAMP-1-S,以 pMAL-c2X 作为表达载体在大肠杆菌 TB1 中进行融合表达,融合蛋白通过麦芽糖亲和层析柱进行纯化,获得的融合蛋白经肠激酶切割后,混合物通过分子筛凝胶层析和反相高效液相色谱来获得单体重组抗菌肽 BhSGAMP-1-S,对获得的抗菌肽进行活性测定。【结果】在最优的表达条件下融合蛋白以可溶的形式表达,100 mL 诱导菌液经多步纯化后可得 0. 38 mg 的重组抗菌肽 BhSGAMP-1-S,抑菌活性测定表明所获得的抗菌肽对部分测试革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌有较强的抑菌活性。【结论】本研究第一次成功的在大肠杆菌中诱导表达了修饰合成的抗菌肽 BhSGAMP-1-S,纯化后的抗菌肽具有很好的抑菌活性,这为进一步研究和应用奠定了基础。     

黄鳍金枪鱼抗菌肽YFGAP在大肠杆菌中融合表达及其活性检测

【目的】抗菌肽YFGAP由32个氨基酸组成,分子量为3.4 kD,对革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G?)表现出强效的抑制作用,不具有溶血活性。在大肠杆菌中表达抗菌肽YFGAP,分离纯化抗菌肽并鉴定其生物学活性。【方法】化学合成EK-YFGAP和L-EK-YFGAP基因序列,构建表达载体pET22b-ELP20-EK-YFGAP、pET22b-ELP40-EK-YFGAP和pET22b-ELP40-L-EK- YFGAP,分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,可逆相变循环纯化融合蛋白。肠激酶酶切,经Vivaspin Turbo纯化柱纯化,测定重组抗菌肽的抑菌活性和溶血活性。【结果】纯化出两种融合蛋白ELP40-EK-YFGAP和ELP40-L-EK-YFGAP,肠激酶酶切纯化后获得重组抗菌肽YFGAP,对4种病原菌均有抑制效果,溶血活性较低。【结论】以ELPs作为非色谱纯化标签,实现了抗菌肽YFGAP的融合表达,具有操作简单、成本低、易于扩大的优势,为重组抗菌肽的量化制备及应用提供了理论基础和技术支持。     

融合表达载体pET32a/Trx-EK-MrVIB的构建及在大肠杆菌中表达

人工设计合成芋螺毒素基因Mr VIB来构建表达载体p ET32a/Trx-EK-Mr VIB,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)plys S进行诱导表达。菌体经超声破碎后利用Ni-NTA琼脂糖柱进行亲和层析纯化融合蛋白,SDS-PAGE电泳分析融合蛋白表达。结果表明融合表达载体p ET32a/Trx-EK-Mr VIB经PCR扩增和测序鉴定具有正确的开放阅读框。SDS-PAGE电泳显示融合蛋白在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,经一步亲和层析获得纯度大于90%的融合芋螺毒素达73.6 mg/L。本文成功构建了融合表达载体p ET32a/Trx-EK-Mr VIB,融合芋螺毒素Trx-EK-Mr VIB在大肠杆菌中获得高效可溶性表达。     

突触小体相关蛋白SNAP25的原核表达、纯化及鉴定

目的:克隆突触小体相关蛋白(SNAP25)基因,原核表达、纯化并鉴定SNAP25蛋白。方法:PCR扩增SNAP25基因,克隆至表达质粒pTIG-Trx,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni2+-NTA亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE及Western印迹分析肉毒神经毒素BoNT/A轻链对该蛋白的裂解情况。结果:构建了pTIG-SNAP25表达质粒,经IPTG诱导表达,目的蛋白占全菌蛋白的26.2%,表达形式为可溶性表达,表达量达115.4mg/L,纯化后蛋白纯度达95%以上;经SDS-PAGE及Western印迹分析,SNAP25蛋白可被BoNT/A轻链特异降解。结论:克隆了SNAP25基因,在原核系统中表达、纯化并鉴定了重组SNAP25蛋白。     

人结合珠蛋白cDNA 克隆及其在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的：克隆人结合珠蛋白（haptoglobin,Hp）cDNA ,并在大肠杆菌中表达和鉴定。方法：从Hela 细胞中分离总RNA,采用RT-PCR 方法获得人Hp cDNA,分别克隆至原核表达载体pET-32a和PGEX-4T-1,转化至大肠杆菌BL21,IPTG 诱导表达,并进行SDS-PAGE 及Western blot 鉴定。结果: 成功构建了高效原核表达质粒PET-32a-Hp 和PGEX-4T1-Hp;Western 印迹结果表明,经IPTG 诱导,在大肠杆菌中表达了分子量约30 kD和37 kD 的目的蛋白;表达产物经Ni2+-NTA 离子交换树脂纯化, 纯度>90%。结 论：在E.coli成功表达和纯化了人Hp 融合蛋白,为进一步开发人Hp 诊断试剂打下基础。     

人铜锌超氧化物歧化酶在大肠杆菌中的融合表达与纯化

目的:在大肠杆菌中表达并纯化人铜锌超氧化物歧化酶(HuSOD1)。方法:合成HuSOD1编码基因,PCR扩增后连入pMAL-p5x质粒构建融合表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,IPTG诱导表达,NBT法测定HuSOD1酶活,利用麦芽糖结合蛋白亲和层析柱纯化MBP-HuSOD1融合蛋白,经因子Ⅹa酶切及分子筛柱层析纯化HuSOD1蛋白。结果:构建了pMAL-p5x-HuSOD1表达载体,在大肠杆菌中实现了高表达,目的蛋白占全菌蛋白的30%,其中可溶性表达占63%,具有超氧化物歧化酶活性;通过亲和层析纯化得到纯度大于95%的融合蛋白MBP-HuSOD1,经因子Ⅹa酶切后纯化得到纯度约90%的HuSOD1蛋白。结论:在大肠杆菌中表达并纯化获得有活性的MBP-HuSOD1,经进一步酶切、纯化后得到HuSOD1。     

人白介素-4与大肠杆菌二硫键异构酶DsbC在大肠杆菌中的融合表达及羟胺切割后共复性

目的:通过融合表达、羟胺切割、与二硫键异构酶共复性,获得高表达、高纯度、高生物活性的重组人白细胞介素-4(rhIL-4)。方法:将5端引入了羟胺切割位点的hIL-4基因克隆到大肠杆菌二硫键异构酶DsbC的原核表达载体pET-DsbC中,IPTG诱导表达,对包涵体进行纯化,然后在变性条件下经羟胺切割,利用DsbC的分子伴侣功能与hIL-4进行共复性,最后利用阳离子交换层析纯化获得rhIL-4蛋白。结果:融合蛋白DsbC-hIL-4的表达量占细菌总蛋白的40%以上,以包涵体形式存在;纯化后得到的rhIL-4的相对分子量为15×103,与预期一致,电泳纯度达95%;细胞学实验测定其具有良好的生物学活性。结论:通过融合表达的方法可以提高hIL-4的原核表达量;利用共复性的方式极大地提高了hIL-4的复性率和生物活性。     

人类mTOR信号通路Ragulator复合物的各亚基的原核表达与纯化

Ragulator是mTOR信号通路中的一个关键蛋白复合物,分别由p18、p14、MP1、Lamtor4、Lamtor5五个蛋白通过相互作用复合而成。Ragulator在mTOR通路中起到结合Rag GTPases并锚定到溶酶体表面的作用,而后者招募并激活mTORC1。本研究通过生物信息学和分子克隆相结合的手段,构建各组分蛋白全长的质粒以及截短p18(41~161)和Lamtor(83~173)片段,相应转化到大肠杆菌中进行蛋白的表达。使用Ni~(2+)柱亲和层析,阴离子交换层析和快速蛋白液相色谱相结合的蛋白纯化手段得到纯度较高的稳定的Ragulator复合物,为后续的晶体制备和生物学结构奠定了基础。同时也为进一步深入了解该信号通路的机制以及相关药物的开发与研究作出了贡献。     

重组幽门螺杆菌ureA,ureB低温表达、纯化及抗原鉴定

目的：建立经济有效的方法,从大肠杆菌表达,纯化重组幽门螺杆菌尿素酶A、B亚单位。方法：含重组表达质粒pGEX-2T/ureA,pGEX-2T/ureB大肠杆菌分别在不同浓度IPTG、不同温度条件下作诱导培养,以SDS-PAGE分析表达产物,采用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和层分离纯化表达产物,以Western-blotting和ELISA对纯化产物作抗原性分析鉴定。结果：IPTG诱导浓度为0.1mmol/L;诱导温度为28℃,含重组质粒大肠杆菌表达可溶性融合蛋白GST-ureA、GST-ureB各约占总表达产物的78%和87%,经亲和层析,得纯度90%以上的GST-ureA约为14mg/L。GST-ureB约为18mg/L;融合蛋白呈ureA、ureB抗原性反应。结论：建立了低温诱导及纯化高纯度ureA、ureB基因表达产物的方法,所得纯化产物具有ureA、ureB抗原活性,为进一步的应用研究打下基础。     

Ad5-knob蛋白在大肠杆菌中可溶性表达及其活性检测

采用PCR技术, 从AdEasy-1质粒DNA中获得knob全长序列, 克隆入pGEM-T vector中.DNA测序鉴定后, 构建pQE-30/knob重组表达载体, 转化大肠杆菌M15 pREP4),IPTG诱导表达腺病毒5型纤维蛋白的knob功能域(Ad5-knob), SDS-PAGE分析,表达产物主要以可溶性蛋白的形式存在于细菌裂解液上清之中.经Ni2+-NTA亲和层析一步分离纯化后,洗脱产物中Ad5-knob蛋白纯度超过95%.N-端氨基酸测序证实了纯化产物为Ad5-knob蛋白,细胞受体结合实验检测到所得蛋白能够与Hela细胞上的相应受体特异性结合.上述结果表明在大肠杆菌中已经高效表达了可溶性Ad5-knob蛋白,一步即纯化该蛋白,并具有良好的生物活性,为其下阶段的深入研究提供了重要的实验材料.     

重组人可溶性BAFF蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:在大肠杆菌中表达人B细胞活化因子可溶性胞外域134~285(rhsBAFF134-285)蛋白,并进行纯化与鉴定。方法:重组表达质粒pET-32ammrhsBAFF在大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)中于16℃下进行IPTG诱导表达。经His亲和层析纯化得到融合蛋白后进行TEV蛋白酶酶切切除Trx融合标签,进而纯化得到rhsBAFF目的蛋白,SDS-PAGE、Western Blot和ELISA鉴定纯化产物。结果:Trx-rhsBAFF融合蛋白相对分子量约31000,16℃表达时主要以包涵体形式表达,上清中也有部分表达。融合蛋白纯化后经酶切再纯化得到相对分子量约17000、纯度95%以上的rhsBAFF目的蛋白,鉴定可被小鼠抗rhBAFF单克隆抗体和小鼠抗rhBAFF多抗血清特异性识别。结论:成功原核表达并纯化得到rhsBAFF蛋白,为进一步开发用于研究人类自身免疫性疾病的BAFF检测试剂盒奠定基础。     

人催乳素受体胞外区蛋白的原核表达及纯化

目的:建立人催乳素受体的原核表达系统,并在大肠杆菌中获得表达。方法:由RT-PCR获得人催乳素受体(human prolactin receptor,hPRLR)胞外区氨基酸的编码序列,扩增并通过酶切位点修饰后克隆至pMD18-T载体,经测序正确后,切下编码序列连接到重组表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用IPTG诱导重组工程菌表达,使用谷胱甘肽偶联的GSTrapFF柱亲和层析纯化重组蛋白。结果:重组菌株可以表达GST-hPRLR融合蛋白,用免疫印迹反应鉴定纯化的融合蛋白,在相对分子质量为37.6×103处有一条带。结论:利用大肠杆菌表达系统获得了较高纯度的GST-hPRLR融合蛋白,为进一步研究催乳素受体的功能和制备特异性的抗体奠定了基础。     

重组荞麦蛋白酶抑制剂aBTI的表达及其对肝癌HepG2细胞增殖的影响

为了深入研究不同类型荞麦蛋白酶抑制剂在抑制肿瘤细胞生长及诱导其发生凋亡方面的作用,本实验在先前得到的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)的基础上,运用定点突变技术将rBTI的活性位点进行替换,构建一种新型蛋白酶抑制剂aBTI。通过在大肠杆菌M15[pREP4]中表达,获得以可溶形式存在的aBTI目的蛋白。经Ni~(2+)-NTA亲和层析及superdex 75分子筛层析纯化,目的蛋白的纯度达到95%以上。抑制活性测定表明,aBTI具有专一性的弹性蛋白酶抑制活性,抑制常数K_i为3.34×10~(-7)mol/L。MTT比色法检测及细胞核形态学观察显示,aBTI在体外能够显著抑制HepG2肿瘤细胞的增殖(IC_(50):1.88μmol/L),并诱导其凋亡,具有较好的抗肿瘤效应。     

神经系统富亮氨酸重复超家族成员LRRN3 C端结构域蛋白的原核表达和纯化

神经系统富亮氨酸重复超家族成员LRRN3是一种重要的膜蛋白,与神经系统发生发育和损伤后修复密切相关．运用多聚酶链式反应（PCR）方法,获得长555bp的DNA序列,扩增产物克隆至pET21质粒中,构建Mal和His融合表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,经Ni^＋-NTA agarose亲和层析纯化获得融合蛋白,并以Western blotting鉴定,为进一步研究LRRN3基因的结构和功能奠定了基础．     

人结合珠蛋白cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的：克隆人结合珠蛋白（haptoglobin,Hp）cDNA,并在大肠杆菌中表达和鉴定。方法：从Hela细胞中分离总RNA,采用RT-PCR方法获得人Hp cDNA,分别克隆至原核表达载体pET-32a和PGEX-4T-1,转化至大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,并进行SDS—PAGE及Western blot鉴定。结果：成功构建了高效原核表达质粒PET-32a-Hp和PGEX-4T1-Hp;Western印迹结果表明,经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达了分子量约30kD和37kD的目的蛋白;表达产物经Ni2^＋-NTA离子交换树脂纯化,纯度〉90％。结论：在E．coli成功表达和纯化了人Hp融合蛋白,为进一步开发人Hp诊断试剂打下基础。