酿酒酵母adh2和ald6双基因缺失突变株的构建

酿酒酵母乙醇合成代谢过程中, 阻断或削弱乙醛至乙酸代谢流不但能增强乙醇合成流, 同时还能降低发酵乙酸含量。本研究以乙醇脱氢酶Ⅱ(adh2)基因缺陷型酿酒酵母YS2-Dadh2为出发菌株, 应用长侧翼同源两步PCR(LFH-PCR)策略构建乙醛脱氢酶Ⅵ(ald6)基因敲除组件, 转化酿酒酵母YS2-Dadh2敲除ald6基因, 之后转入表达质粒pSH65到阳性克隆中, 半乳糖诱导表达Cre重组酶切除Kanr基因筛选标记, 最后, 传代丢失质粒pSH65获得单倍体ald6基因缺失突变株。利用同样的敲除组件和技术再次敲除其等位基因, 最终获得双基因缺失突变株YS2-△adh2-Dald6。发酵实验表明与出发菌株YS2相比, 突变株乙酸合成量降低18%, 乙醇最高产量提高12.5%。     

一株乙醇降解菌株的分离和鉴定

从湖北农田土壤中筛选得到一株ALDH活性较高的菌株,该菌株在含0．64％乙醇的培养基中生长较佳,且耐受0．9％的乙醛。经菌种形态学和生理生化特征,以及16S rRNA基因序列分析,鉴定该菌株为不动杆（Acinetobacter sp．）。该菌株在乙醇和乙醛解毒研究中有重要价值。     

乙醛降解菌Bacillus velezensis LT-2的发酵条件优化

【背景】乙醛作为醛类污染物广泛存在于生产生活中,相较于传统的物化方法,生物降解具有诸多优势,已成为研究热点。【目的】筛选获得降解乙醛的菌株并优化其发酵条件,为微生物降解乙醛提供试验资源。【方法】经过富集培养和乙醛降解试验获得一株乙醛降解能力高的菌株;通过单因子优化(碳源、氮源、金属离子、温度、转速、接种量和初始pH)和多因子的交互试验(Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和Box-Behnken design试验)考察培养基组分和发酵条件对菌株降解乙醛的影响,并考察菌株在最佳条件下的生长状态和乙醛降解能力。【结果】筛选获得一株具有乙醛降解能力的菌株Bacillus velezensis LT-2,该菌株降解乙醛的最佳培养条件为：蔗糖30 g/L,营养肉汤0.6 g/L,氯化钾0.12 mol/L,温度28℃,初始pH 7.5,接种量6%,摇床转速200r/min。在此条件下,B.velezensisLT-2可在1g/L乙醛的培养液中生长,22h的降解率为89.77%±2.33%,是优化前降解率的3.58倍。【结论】试验菌株B. velezensis LT-2对乙醛具有良好的...     

乙醛在小鼠酒依赖性行为中的作用研究

乙醛为酒精代谢的中间产物,但其在酒依赖中的作用不清楚.通过条件化位置偏好(CPP)和条件化味觉偏好(CTP)试验,分析乙醛对小鼠乙醇依赖性行为的影响,研究乙醛在酒依赖中的作用.研究发现,经0.8%乙醇预处理7d后,小鼠训练8次则表现出对乙醇的条件化位置偏好(n=6,P<0.01),而经乙醛训练的小鼠则对乙醛无明显条件化偏好行为(n=6,P>0.05).当用0.8%乙醇、0.4%乙醛混合训练乙醇依赖性小鼠时,其位置偏好行为减弱(n=6,P<0.01).10%乙醇预处理的小鼠味觉偏好乙醇(n=6,P<0.01),而当乙醇中加入1%乙醛时,其味觉偏好现象减弱(n=6,P<0.01).1%乙醛训练7d后的小鼠不表现对乙醇的味觉偏好,但选择摄入乙醛及乙醇、乙醛混合溶液的量有所增加.结果表明乙醛在小鼠酒依赖行为中可能存在一定促进作用.     

酱香型白酒酿造主要功能菌株对拜耳接合酵母的作用

【背景】拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)是酱香型白酒自然酿造过程中的优势菌株,但白酒酿造功能菌株对其酿造特征的影响尚不清晰。【目的】分析酱香型白酒酿造体系中3株主要功能菌株对Z.bailii的作用,揭示其在白酒酿造过程中的发酵特征。【方法】分别构建拜耳接合酵母与酿酒酵母、布氏乳酸杆菌和地衣芽孢杆菌的共培养体系,比较生物量、p H、乙醇及风味物质代谢差异;基于表型差异,从转录组学角度进一步分析拜耳接合酵母与地衣芽孢杆菌共培养的代谢机制。【结果】在共培养体系中,拜耳接合酵母的生长及乙醇代谢受到酿酒酵母的抑制,而不受布氏乳酸杆菌和地衣芽孢杆菌的影响。同时,拜耳接合酵母与酿酒酵母、布氏乳酸杆菌共培养时的风味物质产量下降;但与地衣芽孢杆菌共培养时,其风味代谢却显著提高,其中醇类、酸类、酯类和醛类物质含量较其纯培养时分别上升了41%、36%、44%和73%。转录组数据分析表明,与地衣芽孢杆菌共培养时,拜耳接合酵母中与碳水化合物代谢和氨基酸代谢相关的基因表达显著上调(≥2-fold,P0.05),而碳水化合物和氨基酸是风味物质的主要来源,其相关基因的表达上调有助于拜耳接合酵母的风味代谢。【结论】共培养体系中,地衣芽孢杆菌促进了拜耳接合酵母风味代谢,使之形成更多的醇类、酸类、酯类及醛类物质。研究拜耳接合酵母与主要酿造微生物共培养时的发酵特征,有助于正确认识其在酱香型白酒发酵过程中的功能和应用。     

1株杀鲑气单胞菌杀鲑亚种对甲酸乙酯的降解研究

甲酸乙酯广泛存在于化工行业的废水中,对生物体及环境都具有很大的危害。微生物降解是处理甲酸乙酯的重要方法之一。采用富集培养法和平板划线法从活性污泥中筛选出一株能降解甲酸乙酯的菌株ETH-3。经形态观察、生理生化试验和16S rDNA鉴定,确定该菌株为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.salmonicida)。通过摇瓶实验测定菌株ETH-3的最佳生长环境条件以及其对甲酸乙酯的降解能力,结果表明,该菌株最佳生长温度为25-30℃、最佳生长pH为8左右。该菌株具有较强降解甲酸乙酯能力,在30℃时,36 h内对0-10 500 mg/L的甲酸乙酯可达完全降解。经GC-MS对代谢产物的分析发现,甲酸乙酯会先被微生物代谢为甲酸和乙醇,后甲酸和乙醇会被微生物进一步降解为CO_2和H_2O。     

低乙醛Lager型啤酒酵母研究进展

啤酒酵母是啤酒酿造的核心,对啤酒风味及风味稳定性具有重要影响。乙醛是影响啤酒风味和风味稳定性最重要的醛类化合物,是酒精饮料中引起人类致癌的物质之一,主要通过啤酒酵母的生物代谢产生,存在于啤酒发酵过程及成品啤酒中。因此,筛选或选育优良的低产乙醛啤酒酵母菌株将成为有效解决啤酒风味稳定性的途径之一。近年来,随着基因工程技术的发展及啤酒酵母基因组的不断阐明,人们对啤酒酵母菌种改良展开了大量的研究,以期解决啤酒酿造问题,改善啤酒质量。本文对采用传统方式及基因工程手段选育低产乙醛啤酒酵母的最新研究进展进行了综述。其中,对低乙醛啤酒酵母选育的手段及策略进行了讨论并对低乙醛啤酒酵母选育的研究热点及发展趋势进行了展望。     

运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术,以基因组DNA为模板克隆得到运动发酵单胞菌(Zyrnomonas mobilis)乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenaseⅡ)基因adhB,连接到表达载体pSE380上,得到重组质粒pSE-adhB。将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株DH5α中,重组菌株经IPTG诱导后,在乙醛指示平板检测到乙醇脱氢酶活性。SDS-PAGE电泳结果显示出明显的40KD特异性蛋白质条带。重组菌株经诱导培养,每毫升发酵液酶活力为5u。     

18S rDNA介导的FKS1基因过表达对酵母自溶性能的影响

酵母被誉为啤酒酿造的灵魂,然而随着啤酒高浓酿造技术的发展,酿造过程中渗透压增加、乙醇含量升高及营养平衡改变等会加快酵母的自溶,对啤酒的风味品质产生不利的影响。为提高酵母的抗自溶能力,本研究构建了以酿酒酵母18S r DNA序列为同源位点的FKS1过表达菌株。结果表明,过表达菌株细胞壁葡聚糖含量较原菌高62%;通过平板耐受性分析可知,FKS1过表达菌株在8%的乙醇浓度、0.4 mol/L Na Cl的渗透压冲击以及24 h饥饿培养的条件下,其胁迫耐受性均高于原始菌株;模拟自溶实验结果显示FKS1过表达菌株自溶速度缓慢,抗自溶能力明显优于原始菌株。该结果有助于探究酵母自溶的机理,同时也对提高啤酒风味品质和稳定性有着重要的意义。     

基因组重排技术选育乙醇高产菌株

里氏木霉（Trichoderma reesei）被认为是最合适联合生物加工（consolidated bioprocessing）的微生物之一。原始里氏木霉菌株产乙醇能力太低,需要进一步提高其产酒量。我们通过基因组重排技术提高了里氏木霉菌株产乙醇能力和乙醇耐受力。首先对CICC40360菌株孢子进行NTG诱变得到正向突变菌株,再以此为出发菌株进行基因组重排。进行基因组重排后,重组菌株在含不同乙醇浓度的原生质体再生培养基上进行筛选。突变菌株和原始菌株一起做摇瓶发酵实验进行比较以确定产乙醇能力的提高。经过两轮基因组重排后,筛选获得表现最优异的重组菌S2-254。该菌株能在利用50g/l葡萄糖发酵出6.2g/l乙醇,同时能耐受3.5% （v/v）浓度乙醇。上述结果表明,本实验采用的基因组重排技术能够有效而且快速获得具有目的性状的优良菌株。     

菌群、乙醇代谢与急性酒精中毒的关系研究

酒是生活中常见的饮品,过度饮酒会对机体产生毒害作用。要防治急性酒精中毒首要的就是了解乙醇的代谢途径以及致病机制,从而找到加速乙醇代谢,减轻危害的方法。因为菌群与乙醇代谢相关,并可以通过菌群修复乙醇带来的损伤。本研究以乙醇代谢和损伤机制为基础,对菌群调节乙醇代谢及对酒精中毒的缓解作用进行综述。     

pH对Themoanaerobacterium calidifontis Rx1乙醇发酵代谢的影响

Themoanaerobacterium calidifontis Rx1是一株能降解半纤维素发酵乙醇的高温厌氧菌。本研究以Rx1和其乙酸激酶基因(ack)敲除的突变菌株Rx1△ack作为研究对象,研究了不同pH值条件对两种菌株生长与代谢的影响,并通过测定碳中心代谢关键酶的表达量与酶活性分析了pH的代谢调控机制。结果表明,与自然pH相比,控制pH能够改变两种菌株的代谢产物分布;当控制pH值为7.0时,Rx1和Rx1△ack的乳酸产量分别下降了85.7%和89.9%,而乙醇产量分别提高了60%和69%;Rx1和Rx1△ack乙酸产量的变化趋势不同。与自然pH相比,控制p H时,Rx1和Rx1△ack的丙酮酸激酶(PK)基因表达量和酶活性都有所提高;野生型菌株的乙酸激酶(ACK)活性下降11%,而突变菌株基因表达量显著提高,酶活性只有野生型的25%,且与自然pH条件相比,有提高的的趋势;野生型菌株乙醇代谢途径中乙醇脱氢酶(ADH)活性显著下调;研究发现pH对Rx1和Rx1△ack乳酸代谢途径中乳酸脱氢酶(LDH)影响十分显著,在弱碱或中性条件下,其活性还不足酸性条件下的一半。Rx1和Rx1△ack在控制pH条件下乳酸产量下降,同时伴随乳酸生成途径的还原力(即NAD(P)H)积累,而乙醇生成途径可将积累的NAD(P)H氧化成NAD(P)+,这可能是控制pH条件下乙醇产量提高的原因。     

郫县豆瓣中一株耐盐酵母菌的分离鉴定及其发酵性能

为研究酵母菌对郫县豆瓣风味与品质的影响,筛选具有生产应用潜能的酿造功能菌株,从郫县豆瓣中分离筛选到一株耐盐酵母HJ-7Y. 1,经形态生理生化特征和ITS r DNA序列鉴定为鲁氏接合酵母。耐盐性测试显示HJ-7Y. 1在含260 g/L Na Cl培养基中生长良好,表明其具良好的耐盐性能。通过气相色谱(gas chromatography GC)和顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)气质联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC/MS)方法,对菌株发酵液中乙醇的含量和挥发性成分进行了检测。实验结果表明,HJ-7Y. 1在高盐浓度下仍具有较好的产乙醇能力,同时能代谢产生苯乙醇、乙酸乙酯、3-甲基丁醇、乙酸苯乙酯等多种香气成分,这些呈香物质的存在能为豆瓣具有的特色风味奠定良好的物质基础,因此,HJ-7Y. 1具有应用于郫县豆瓣生产的开发潜力。     

乙醇和乙醛在采后园艺作物保鲜中的作用

概述了乙醇和乙醛对果蔬和切花采后生理,如乙烯合成、呼吸作用、果实后熟软化和风味的影响,并对乙醇和乙醛在防治果蔬采后病虫害和生理病害中的应用作了介绍。     

混合糖发酵重组酿酒酵母的菌株构建和菊芋秸秆同步糖化发酵研究

【目的】构建可用于纤维素乙醇高效生产的混合糖发酵重组酿酒酵母菌株,并利用菊芋秸秆为原料进行乙醇发酵。【方法】筛选在木糖中生长较好的酿酒酵母YB-2625作为宿主菌,构建木糖共代谢菌株YB-2625 CCX。进一步通过r DNA位点多拷贝整合的方式,以YB-2625 CCX为出发菌株构建木糖脱氢酶过表达菌株,并筛选得到优势菌株YB-73。采用同步糖化发酵策略研究YB-73的菊芋秸秆发酵性能。【结果】YB-73菌株以90 g/L葡萄糖和30 g/L木糖为碳源进行混合糖发酵,乙醇产量比出发菌株YB-2625 CCX提高了13.9%,副产物木糖醇产率由0.89 g/g降低至0.31 g/g,下降了64.6%。利用重组菌YB-73对菊芋秸秆进行同步糖化发酵,48 h最高乙醇浓度达到6.10%(体积比)。【结论】通过转入木糖代谢途径以及r DNA位点多拷贝整合过表达木糖脱氢酶基因可有效提高菌株木糖发酵性能,并用于菊芋秸秆的纤维素乙醇生产。这是首次报道利用重组酿酒酵母进行菊芋秸秆原料的纤维素乙醇发酵。     

诱导烟草悬浮细胞氧爆发的海绵共附生真菌HMP-F66的筛选与鉴定

激发植物本身的天然免疫系统可作为防控植物病害的新途径。以50株分离自繁茂膜海绵的真菌为受试菌株筛选具有诱导植物抗性活性的菌株及其代谢产物。采用基于H2DCF-DA的荧光酶标法考察这些真菌的粗代谢物诱导烟草悬浮细胞产生氧爆发的活性,最终筛选到一株真菌HMP-F66能够显著诱导烟草悬浮细胞产生活性氧。根据其形态学特征、培养特征、特征性生理生化反应以及基于r DNA ITS的分子生物学分析,推测该菌株为米曲霉(Aspergillus oryzae)。     

多质粒共转化组合筛选方法构建木糖利用酿酒酵母的研究

快速得到目标代谢路径相关基因的大量组合以及实现组合库的高效筛选,是合成生物学领域中一个重要的研究内容。建立了三质粒共转化酵母菌株组合筛选方法并以XR-XDH木糖代谢路径在酿酒酵母中的应用为例进行阐释。首先利用Yeast Golden Gate连接法在三种不同表达载体上构建不同启动子控制下的XR、XDH、XK单个基因的表达盒,然后直接用三质粒共转化系统构建100种不同组合的重组酵母。经过木糖平板初筛筛选出16个能利用木糖的组合,将这16个组合对应的三基因表达模块组装至同一表达载体后转化底盘菌株,再通过限氧发酵进行复筛,最终筛选出木糖代谢能力、木糖醇和乙醇生成速率最优菌株Sc-LQH35（TDH3p-XR-ACS2t-FBA1p-XDH-ENO2t-PDC1p-XK-ASC1t）,在培养基中含有20 g/L木糖的条件下,其木糖醇产量为7.14 g/L,乙醇产量为5.92 g/L,而菌株Sc-LQH39（TDH3p-XR-ACS2t-FBA1p-XDH-ENO2t-ZEO1p-XK-ASC1t）则表现出较强的木糖醇生产能力,特别在限氧发酵时,其木糖醇得率可高达0.71 g/g。三质粒共转化组合筛选方法实现了木糖利用菌株的灵活构建和快速筛选,并成功得到具有优良木糖利用性能的酿酒酵母菌株,表明其在重组菌株的构建和筛选工作中有一定的应用价值。     

产乙醇大肠杆菌的构建及其活性检测方法的改进

adhB和pdc是运动发酵单胞菌产乙醇途径的关键基因,分别编码乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶,将添加有聚球藻PCC7942rbcLS基因RBS序列的adhB和pdc基因插入pUC18载体,经双重菌液PCR检验和酶切检验得到分别含有pUC-adhB、pUC-pdc和pUC-adhB-pdc载体的3个重组菌株。活性检测实验表明聚球藻PCC7942的rbcLS基因的RBS序列能有效介导运动发酵单胞菌的adhB和pdc基因在大肠杆菌中表达,摇瓶发酵实验表明重组大肠杆菌的产乙醇能力较出发菌株大幅提升。鉴于乙醛指示平板法存在着对希夫试剂的要求较高、易产生较强的背景色等缺点,对定性检测丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶表达菌株的方法做了改进,即:将菌液诱导表达,然后分别添加对应于两种酶的底物,让酶与底物反应0.5至1小时,之后再加希夫试剂进行显色反应,结果表明改进后的方法比乙醛指示平板法更加简便、快速、可靠。     

酿酒酵母的"组学"技术研究进展及其在工程菌株构建中的应用

酿酒酵母是真核模式生物,已被广泛用于 "组学"水平的研究。"组学"技术主要由基因组学、转录组学、蛋白质组学及代谢组学构成。综述了酵母菌"组学"的研究进展,并论述了酵母菌"组学"技术在酵母菌菌株改造中的应用,包括酒类及生物燃料乙醇工业生产菌株的基因工程改造等。     

饮酒真能御寒吗?

问:饮酒真能御寒吗? 答:在冬季,人们往往借助饮酒来御寒.但饮酒真能御寒吗?虽然酒精本身产热量比较多,但是在人体内产热量并不多.酒精在胃和小肠内被吸收后,大部分在肝脏中进行代谢,在乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)的作用下依次氧化为乙醛和乙酸,乙酸最终进入三羧酸循环中氧化放能.在这个过程中,约有40%～50%的人乙醛代谢受阻,导致血液中乙醛浓度升高.乙醛不仅刺激肥大细胞释放前列环素等血管扩张剂,使全身皮下毛细血管扩张;而且乙醛刺激神经系统使心跳加速,导致散热加快.这样,反而减少了身体的原有热量.所以,一般来说,饮酒能使人有短暂"热"的感觉,但不久便会寒意临身.