双启动子促进亮氨酸脱氢酶在Bacillus subtilis中表达及发酵研究

为了促进亮氨酸脱氢酶在Bacillus subtilis中高效表达,采取在质粒pMA5自带的启动子P_(HpaⅡ)之后分别添加诱导型和组成型启动子,考察双启动子对酶表达的影响。选取2种诱导型启动子(P_(grac)、P_(gl-M1))和4种组成型启动子(P_(43)、P_(laps)、P_(HpaⅡ)、P_(amyQ))进行构建表达,其中组成型启动子P_(amyQ)与P_(HpaⅡ)构成的双启动子效果最好,有效地将胞外活性提高到31. 24U/ml,是单启动子PHpaⅡ的3. 4倍。在以上最优双启动子的基础上分别融合Sec途径和Tat途径的4种信号肽,但信号肽与双启动子共同作用并没有获得更高的酶活性。选用酶活最高的双启动子突变菌株Bacillus subtilis168/pW6(P_(HpaⅡ)-P_(amyQ))进行7. 5L发酵罐补料发酵产酶研究,LeuDH酶活达到217. 96U/ml,是摇瓶水平的6. 97倍,对工业上产亮氨酸脱氢酶有一定参考价值。     

杆状病毒囊膜糖蛋白gp64基因启动子活性分析

GP64是杆状病毒在其发育循环第一时相所产生的芽生型病毒粒子（budded voirus,BV)的特异性囊膜糖蛋白。它在病毒入侵细胞过程中具有重要作用。为了探明杆状病毒gp64基因的表达调控。从所克隆的BmNPV和AcMNPVgp64基因ATG上游437-439bp启动子的序列分析发现。该启动子同时具有早期和晚期转录模体,将所构建的该启动子控制下荧光素酶报告基因（Luc)的非融合表达质粒分别转染Bm-N和Sf-21细胞进行瞬间表达分析,BmNPVgp64启动子能被允许宿主Bm-N细胞RNA聚合酶Ⅱ所识别,AcMNPVgp64启动子既能被允许宿主Sf-21又能被非允许宿主Bm-N细胞RNA聚合酶Ⅱ所识别,同时,这两个启动子的转录活性在各自的允许宿主细胞中被相应的病毒因子所反式激活2.4-4倍。将家吞核多角体病毒同源重复序列3（BmNPV homologous region-3,hr3)克隆到该启动子控制下的Luc报告基因下游,用所构建的质粒分别转染细胞,瞬间表达分析结果表达,BmNPVhr3能分别增强该启动子在Bm-N和Sf-21细胞中的转录活性13-22倍和7000-14000倍以上,同时,相应的病毒因子能反式激活插入了hr3的gp64启动子在各自允许宿主细胞中转录活性73-78倍,这暗示着BmNPVhr3除了具有病毒DNA复制原点和增强子的功能外,它在病毒的反式激活过程中起着重要的作用。     

基于时间序列转录组筛选谷氨酸棒杆菌内源高效组成型启动子

启动子是重要的转录调控元件,广泛用于工业菌株的代谢工程改造。谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum是重要的氨基酸生产菌株,但已报道的组成型强启动子较少。对谷氨酸高产菌Corynebacterium glutamicum SL4发酵过程的10个时间点样品进行转录组测序,筛选在发酵过程中稳定转录并且转录水平最高的10个基因;分别克隆其启动子序列至红色荧光蛋白(RFP)报告系统,通过荧光强度表征启动子在SL4菌株中的强度,再在野生型C. glutamicum ATCC 13869和ATCC 13032中验证部分启动子的通用性;并采用LacZ蛋白进一步评价强启动子的表达效果。结果显示,成功筛选到3个可以通用的组成型启动子P_(cysK)、P_(gapA)和P_(fumC)。其中P_(cysK)的表达强度最高,与诱导型强启动子P_(tac)对比,在SL4和13869菌株中均达到其2倍(RFP)和4倍(LacZ)以上;在ATCC 13032菌株中,P_(cysK)的表达强度为P_(tac)的0.3-0.4倍。Pcys K首次被报道为强启动子,可用于谷氨酸棒杆菌强化合成途径的代谢工程改造。     

绵羊高硫角蛋白KAP1.3基因启动子活性分析

旨在研究高硫角蛋白基因启动子及相关调控序列的表达活性。以绵羊基因组为模板,克隆KAP1.3基因启动子序列,对其进行5个系列缺失片段pGL4.10表达载体构建,将不同重组质粒转染小鼠成纤维细胞,通过裂解细胞测定其荧光值方法来检测启动子的表达活性。结果显示,除KAP1.3-P5片段其余片段均具有表达活性,其中KAP1.3-P1片段表达活性最高,而缺失-944至-707处的KAP1.3-P2对启动子的活性没有显著影响,但缺失-944至-394处KAP1.3-P3片段对启动子活性影响比较大,从P3和P4的结果中可以看出,虽然两个片段都缺失了转录因子bHLH的结合位点,但P4的活性比P3高出约20%,由此推测在-394至-195之间可能存在一个负调控元件,在-195和-4之间可能存在一个增强元件,但具体的调控元件还需要再进行细致地分析,优化出活性最高且特异性不变的启动子片段。     

棉花曲叶病毒互补链基因启动子功能区的缺失分析

棉花曲叶病毒(CLCuV)互补链基因启动子是一种新型的启动子,它能驱动外源基因在植物体内高效表达.为了研究其最佳启动子区域,对启动子5′端进行了一系列缺失,得到5种不同长度的启动子片段与gus 基因融合的植物表达载体.继而导入根癌农杆菌,采用叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum L.cv.Xanthi),并检测转基因植株的GUS活性.实验结果表明,自启动子5′端缺失至转译起始位点上游-287,-271时启动子活性分别是全长启动子的5倍,3倍.-271～-176元件对启动子在韧皮部的表达活性起重要作用.自-176缺失至-141时,启动子的活性降低至全长启动子的1/30～1/20,启动子在根中失去表达活性,但在叶、茎中仍有微弱的活性.对棉花曲叶病毒互补链基因启动子的功能区进行了分析比较,发现缺失负调控元件的启动子比全长启动子具有更强的活性,平均活性是CaMV 35S启动子的12倍,暗示该启动子具有巨大的应用潜力.研究结果也为进一步了解双生病毒基因表达调控机制及病毒-植物间的相互作用提供了新的线索.     

人claudin-10基因启动子转录调控的初步分析

[目的]构建不同长度的人claudin-10基因上游启动子荧光素酶报告基因载体,并在LO2细胞中比较其活性。[方法]以人LO2肝细胞基因组DNA为模板,PCR扩增获得claudin-10基因5'侧翼序列,并将其插入p MD18-T载体;PCR扩增获得不同长度的claudin-10基因上游启动子区序列,构建p GL3-Basic系列荧光素酶基因报告载体。瞬时转染LO2细胞,双荧光素酶报告基因分析系统检测转录活性。[结果]成功构建6个不同长度的人claudin-10基因上游启动子区(-1 451/+100bp、-1 022/+100bp、-1 005/+100bp、-677/+100bp、-377/+100bp和-108/+100bp)的报告载体;启动子活性实验结果表明:当claudin-10启动子片段从-1 005 bp截短至-677 bp,从-108 bp截短至+100 bp时活性显著下降(P0.05);其余截短时活性无改变(P0.05)。[结论]claudin-10启动子-1 005bp~-677bp和-108bp~+100bp区是claudin-10基因的主要转录调控区。     

启动子对枯草芽孢杆菌表达环糊精葡萄糖基转移酶的影响

以质粒pHY300PLK为骨架构建Bacillus stearothermophilus来源的α/β-环糊精葡萄糖基转移酶(α/β-CGTase)在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表达系统的表达质粒。为了提高α/β-CGTase的表达量,考察了9个单启动子(P_(amyQ), P_(amyQ)', Papr E, Pgsi B, Phpa Ⅱ, Pnpr E, Psrf, Pxyl, Pxyl')对α/β-CGTase表达量的影响,摇瓶发酵表明最优单启动子为P_(amyQ)',α/β-CGTase表达量为6.52 U/mL,其次为Phpa Ⅱ和Pnpr E,分别对应酶活5.80 U/mL和5.73 U/mL。用P_(amyQ)'与P_(amyQ)'、Phpa Ⅱ、Pnpr E两两组合,构建双启动子P_(amyQ)'-P_(amyQ)'、Phpa Ⅱ-P_(amyQ)'、Pnpr E-P_(amyQ)',摇瓶发酵表明最优双启动子为Phpa Ⅱ-P_(amyQ)',α/β-CGTase表达量为11.15 U/mL,是用单启动子PamyQ'表达时的1.7倍。测定Phpa Ⅱ-P_(amyQ)'、P_(amyQ)'-P_(amyQ)'、P_(amyQ)'-P_(amyQ)'、P_(amyQ)'、Pgsi B、Phpa Ⅱ为启动子时,α/β-CGTase m RNA转录水平,结果表明α/β-CGTase表达量随m RNA转录水平的提高而提高。使用含有启动子Phpa Ⅱ-P_(amyQ)'的表达质粒进行3 L罐发酵,培养96 h时,α/β-CGTase酶活达到最高110.4 U/mL。     

利用不同启动子控制木糖代谢关键酶基因构建可共代谢葡萄糖木糖重组酿酒酵母

利用不同强度的启动子调控木糖代谢关键酶活性,构建稳定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的重组酿酒酵母。以本实验室专利菌株Saccharomyces cerevisiae Y5为宿主菌,将树干毕赤酵母Pichia stipitis CBS6054的木糖还原酶基因XYL1和木糖醇脱氢酶基因XYL2置于磷酸甘油酸激酶基因启动子(PGKp)控制下,酿酒酵母Y5内源的木酮糖激酶基因XKS1分别由己糖激酶基因启动子(HXK2p)及其内源启动子(XKS1p)控制。这3个基因连同各自表达元件导入宿主细胞中,打通其木糖上游代谢途径。酶活测定结果显示,HXK2p对木酮糖激酶表现出更强的启动效率。重组菌Y5-X3-1中木糖还原酶/木糖醇脱氢酶/木酮糖激酶(XR/XDH/XK)的酶活比值为1∶5∶4,其木糖消耗量是宿主菌的5倍,最高乙醇产量为24.35 g/L,达到理论值的73%。结果表明,通过调节XYL1、XYL2及XKS1启动子的强度,调控其表达水平,进而改变3种酶的活性水平,对于提高重组酿酒酵母利用木糖发酵产乙醇有明显效果。     

Pib启动子中茉莉酸和乙烯响应元件的转基因分析

水稻Pib基因的表达受茉莉酸、乙烯等激素诱导, 为了确定该基因启动子响应茉莉酸和乙烯诱导的必需区域, 进一步阐明茉莉酸和乙烯响应分子元件, 文章用PCR制备了Pib全长启动子-3 572~2 bp及3个5′端有不同长度缺失的Pib启动子片段-2 692~2 bp、-1 335~2 bp、-761~2 bp。4个不同长度Pib启动子分别置换掉双元质粒中gus基因上游的35S构建为重组质粒, 经农杆菌介导转入水稻获得转基因植株。转基因水稻中gus活性的蛋白质水平和mRNA水平的定性和定量分析结果表明, 全长Pib启动子(-3 572~2 bp, pNAR901)启动活性最强, 茉莉酸或乙烯诱导6 h后, 其驱动gus基因在转基因植株各部组织中的表达量明显上升。而-3 572~-2 692 bp区段序列缺失后不但Pib启动子启动活性显著降低而且也丧失了对茉莉酸和乙烯的诱导活性。pNAR902(-2 692~2 bp),pNAR903(-1 335~2 bp)和pNAR904(-761~2 bp)中的Pib启动子序列的缺失长度相差达2倍和3倍以上, 但其对茉莉酸和乙烯的诱导响应没有区别。这些结果显示3个Pib启动子缺失体构建中, 其共同缺失序列即-3 572~-2 692 bp区域是Pib启动子茉莉酸和乙烯诱导响应的必需区域。软件检索证实, Pib启动子序列中只在上述共同缺失区段之内的-2 722 bp处有一个GCCGCC基序。文章报道的转基因实验表明GCCGCC基序可能是Pib基因中有关茉莉酸和乙烯诱导响应的顺式分子元件。     

利用DNA改组技术改造aacC1基因启动子活性的研究

从表达质粒pYPX251(GenBank 登陆号：AY178046)中获得aacC1基因启动子,采用DNA改组（DNA shuffling）技术在体外获得突变体。以lacZ作为报告基因,筛选获得活性明显改变的启动子。经过验证,对其中活性变化明显的7个启动子用邻硝基苯基β半乳糖苷(ONPG)作为底物进行表达活性测定。结果表明,获得的强启动子比原来的提高了3～8倍,而弱启动子则活性下降明显,其中3个几乎无活性。进一步对这7个启动子进行了序列分析。     

E-box元件修饰端粒酶核心启动子序列及体外转录活性分析

人类端粒酶启动子(hTERT启动子)在肿瘤基因治疗中的有效性已经得到了证实. 然而,hTERT启动子有限的肿瘤靶向转录活性困扰着它的临床应用.早期研究已经揭示,核心hTERT启动子上的-34位E-box元件与该启动子的肿瘤靶向转录活性有关.为进一步探索核心hTERT启动子序列3′端富余E-box元件是否能提高启动子的肿瘤靶向转录能力,用化学合成方法在野生型hTERT(WT-hTERT)核心启动子片段(编码蛋白起始子ATG上游-268 bp～-10 bp)的3′端接入3个E-box序列, 构建成修饰型hTERT(Mod-hTERT)启动子. 然后,分别用WT-hTERT和Mod-hTERT启动子去调控增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及荧光素酶报告基因在293FT、HepGⅡ、SGC7901、U2OS、以及原代培养人成纤维细胞(PHF)中表达. 结果表明, 在Mod-hTERT启动子的各实验组细胞中,能够在端粒酶阳性的293FT、HepGⅡ及 SGC7901细胞组中观测到EGFP的表达,而在端粒酶阴性的U2OS及PHF细胞组中没有观测到EGFP的表达;在端粒酶阳性的293FT、HepGⅡ和SGC7901细胞株中,Mod-hTERT启动子调控下的荧光素酶活性要高于WT-hTERT启动子组（P＜0.01）; 而在端粒酶阴性的U2OS细胞组中,Mod-hTERT启动子调控下的荧光素酶活性则低于WT-hTERT启动子组（P＜0.01); 在PHF细胞组中,Mod-hTERT启动子组与WT-hTERT启动子组的荧光素酶活性差异不显著(P＞0.05).研究提示,在3′端增加E-box元件可以提高核心hTERT启动子序列的肿瘤靶向转录活性.     

转醛醇酶基因差异表达影响酵母发酵木糖及耐受乙酸性能

【目的】木糖发酵是纤维素燃料乙醇生产的一个关键瓶颈,同时木质纤维素水解液中的乙酸严重抑制酿酒酵母的木糖发酵过程,因此通过基因工程手段提高菌株对木糖的利用以及对乙酸的耐受性具有重要意义。本研究以非氧化磷酸戊糖途径(PPP途径)中关键基因转醛醇酶基因(TAL1)为研究对象,探讨了3种不同启动子PTDH3、PAHP1和PUBI4,控制其表达对菌株利用木糖和耐受乙酸的影响。【方法】通过同源重组用3种启动子替换酿酒酵母基因工程菌NAPX37的TAL1基因的启动子PTAL1,再通过孢子分离和单倍体交配构建了纯合子,利用批次发酵比较了在以木糖为唯一碳源和混合糖(葡萄糖和木糖)为碳源条件下,3种启动子控制TAL1基因表达导致的发酵和乙酸耐受能力的差异。【结果】启动子PTDH3、PAHP1和PUBI4在不同程度上提高了TAL1基因的转录水平,提高了菌株对木糖的利用速率及乙酸耐受能力,提高了菌株在60 mmol/L乙酸条件下的葡萄糖利用速率。在以木糖为唯一碳源且无乙酸存在、以及混合糖为碳源的条件下,PAHP1启动子控制TAL1表达菌株的发酵结果优于PTDH3和PUBI4启动子的菌株,PAHP1启动子控制的TAL1基因的转录水平比较合适。在木糖为唯一碳源且乙酸为30 mmol/L时,PUBI4启动子控制TAL1基因表达的菌株发酵结果则优于PAHP1和PTDH3启动子菌株,此时PUBI4启动子控制的TAL1的转录水平比较合适。【结论】启动子PTDH3、PAHP1和PUBI4不同程度地提高TAL1基因的表达,在不同程度上改善了酵母菌株的木糖发酵速率和耐受乙酸性能,改善程度受发酵条件的影响。     

INCENP基因功能性单倍型可调控启动子活性并影响公牛精液品质

为研究内着丝粒蛋白(Inner centromere protein, INCENP)基因启动子区单核苷酸多态性(SNPs)与精液品质的相关性,本文利用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测了250头中国荷斯坦公牛INCENP基因的基因型。在INCENP基因启动子区鉴定出两个SNPs (g.-556 G>T,rs 136823901和g.-692 C>T,rs 211010999),发现了3种单倍型(CG、TT、TG)。分析两个SNP位点的基因型频率和等位基因频率,各SNP及单倍型组合与中国荷斯坦公牛精液品质的相关性,结果表明SNP位点g.-556 G>T GT基因型个体的鲜精活力显著高于GG基因型个体(P<0.05),单倍型组合H1H1(CCGG)、H1H3(CTGT)、H2H3(TTGT)和H3H3(TTTT)个体的鲜精活力和冻精解冻后活力均显著高于H1H2个体(P<0.05)。为进一步研究g.-556 G>T和g.-692 C>T影响精液品质的可能机理,本文将3种单倍型质粒分别转染小鼠睾丸间质细胞(MLTC-1),结果显示含TG单倍型的载体荧光素酶活性最高。由此推测,g.-556 G>T和g.-692 C>T为启动子区功能性突变位点,可通过调节启动子活性来调控INCENP基因表达,进而影响精液品质。     

Ⅰ型干扰素受体启动子多态性与慢性乙型肝炎易感性的相关性研究

目的 研究Ⅰ型干扰素受体启动子(IFNAR1)的基因多态性在不同个体间的差异,以及它们与慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染之间的相关性。方法 对320例慢性乙型肝炎患者、148例自发康复者、148例健康对照和114例正常高加索人的IFNAR1进行基因分型,分析基因的多态性与慢性HBV感染的易感性之间的相关性;构建IFNAR1启动子-荧光素酶报告基因载体,比较不同IFNAR1启动子变异体的转录活性。结果 在-568,-408,-77和-3位点发现基因多态性,其中-568和-77位点,以及-408和-3位点之间存在等位基因连锁。相关性分析结果表明,-568G、-408C和单体型-568G/-408C/-3C/-77(M)与病毒清除有关,-568C、-408T和单体型-568C/-408T/-3T/-77(L)与HBV感染的慢性化有关。启动子-荧光素酶报告基因载体的检测显示,-408和(或)-3位点的多态性可影响调节IFNAR1启动子的转录水平,而-568位点的多态性总体上对转录活性无明显的影响。-77(9)在高加索人中明显多见,携带这一基因型启动子的转录活性明显高于其他基因型启动子的转录活性。结论 IFNAR1的基因多态性与慢性HBV感染的易感性有相关性。     

人β1整合素启动子核心启动序列初步分析

目的:分析人β1整合素在HaCat细胞中核心启动片段.方法:以本室构建的含整合素β1全长启动子1745 bp基因序列(-1745bp～+11 bp)的重组栽体pGL3-1756为模板,用含有酶切位点的特异性引物扩增出整合素β1启动子-845 bp～304bp间基因序列,克隆至荧光素酶表达载体pGL3 basic,构建含正确目的基因重组载体pGL3-542.用pGL3-1756、和pGL3-542质粒转染人表皮细胞株HaCat进行活性分析.结果:酶切及序列测定表明,克隆后插入pGL3 basic中的启动子片段与GenBank DNA序列数据库对比分析序列一致,且插入方向正确.在人永生化表皮细胞株(HaCat细胞)中构建的pGL3-542载体具有很强的启动活性.结论:成功构建了整合素Bl远端启动子542 bp片段载体,在HaCat细胞中具有非常强的启动活性.人整合素β1整合素启动子核心启动序列可能位于-845 bp～-304 bp.     

家蚕滞育关联山梨醇脱氢酶基因的启动子活性分析

【目的】明确家蚕Bombyx mori滞育关联基因山梨醇脱氢酶基因BmSDH(BmSDH-1,BmSDH-2a和BmSDH-2b)的转录特性。【方法】用5'RACE技术确定家蚕3个BmSDH基因的转录起始位点。利用PCR技术克隆3个BmSDH基因约1 kb及BmSDH-2a不同长度的启动子区序列,分别构建带有萤火虫荧光素酶报告基因的载体pGL3-BmSDH-P-luc,并与pRL-CMV报告质粒(含海肾荧光素酶报告基因)共转染家蚕BmN细胞,通过双荧光素酶检测系统检测BmSDH基因启动子活性;分别在BmN细胞培养基中添加昆虫保幼激素、蜕皮激素和滞育激素,通过双荧光素酶检测系统检测不同浓度激素处理对BmSDH-2a基因启动子活性的影响。【结果】BmSDH-1的转录起始位点为A(-41),BmSDH-2a的转录起始位点为C(-41),BmSDH-2b的转录起始位点为A(-40)(翻译起始位点为+1)。双荧光素酶检测结果表明,BmSDH-2a启动子活性极显著高于BmSDH-1和BmSDH-2b启动子,BmSDH-2a 355 bp长度片段的启动子活性极显著高于674 bp和1 117 bp长度片段。用不同浓度滞育激素处理BmN细胞后,BmSDH-2a的1 117 bp启动子活性随着滞育激素浓度的升高有上升的趋势,当浓度高于100 ng/mL时启动子活性有所降低但仍保持在较高水平;用保幼激素进行处理后,随着激素浓度的升高启动子活性逐渐降低;蜕皮激素处理后,0.1 ng/mL激素显著增强启动子活性,当激素浓度继续升高启动子活性逐渐降低。【结论】确定了BmSDH基因的转录起始位点。BmSDH-2a启动子活性显著高于BmSDH-1和BmSDH-2b启动子,一定浓度的蜕皮激素能显著提高BmSDH-2a启动子活性。研究结果有助于阐明BmSDH基因在家蚕滞育中的功能。     

小鼠TIE2基因启动子的克隆及转录活性分析

克隆小鼠TIE2基因的启动子并分析其转录活性.设计并合成引物,以小鼠肝脏组织DNA为模板,巢式PCR扩增小鼠TIE2基因启动子区.将扩增获得的系列截短片段克隆入荧光素酶(Luc)报告基因表达载体pGL3-Basic中,构建系列启动子区转录活性报告质粒pGL3-TIE2-Luc.报告质粒与内参质粒共转染SVEC4-10、NIH3T3、HUVEC及NIT-1细胞系,48h后收获细胞检测双荧光素酶的表达情况.构建的pGL3-TIE2-Luc系列报告质粒经过酶切鉴定及DNA测序分析都显示正确;转染4种细胞系后进行双荧光素酶活性检测的结果表明,TIE2基因启动子区域(-2056-+1)具有较强的转录活性.成功构建小鼠TIE2基因启动子报告质粒,证实TIE2基因上游区域(-2056-+1)具有较强的启动子活性.     

北极狐β-防御素103基因 (CBD103) 启动子活性及转录调控元件分析

本研究旨在筛选调控北极狐毛色基因CBD103的启动子活性区域及转录因子结合位点,为揭示CBD103基因调控北极狐毛色形成的分子遗传机制提供依据。克隆获得了北极狐CBD103基因5′侧翼区2 123 bp的片段,并构建了4个不同长度的启动子缺失片段表达载体,通过双荧光素酶检测系统对启动子活性进行检测。对启动子活性最高区域预测出的3个特异性蛋白1 (Sp1)转录因子结合位点分别进行点突变并构建3个突变载体,利用双荧光素酶检测系统测定其活性。结果显示,在构建的4个不同长度启动子缺失片段中1 656 (-1 604/+51)区域活性最高,在此区域构建的3个突变载体的启动子活性较野生型(片段1 656)均显著降低,说明-1 604/+51区域为北极狐CBD103基因的核心启动子区,-1 552/-1 564、-1 439/-1 454和-329/-339区域为正调控区域。文中成功获得了北极狐CBD103基因的核心启动子区域和正调控区域,这为进一步研究该基因调控北极狐被毛颜色分子遗传机制奠定了基础。     

IL-37基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

[目的]克隆白介素-37(IL-37)基因启动子,构建其荧光素酶报告基因载体,并分析活性。[方法]用PCR方法扩增IL-37基因5'端上游区3个不同长度的启动子片段,分别克隆入荧光素酶报告基因载体p GL3,构建IL-37基因启动子荧光素酶报告基因质粒。将所构建的质粒转染HEK-293细胞,通过双荧光素酶报告基因系统分析启动子的转录活性。[结果]754、1 017、2 043 bp等3个IL-37启动子片段正确亚克隆入荧光素酶报告基因载体,重组质粒转染HEK-293细胞后,双荧光素酶活性分析显示1 017 bp的启动子片段具有较强转录活性,约为对照组(空载体p GL3-basic)的10.9倍。[结论]成功克隆IL-37基因启动子,构建了大小为1 017 bp的IL-37基因启动子荧光素酶报告基因载体,为IL-37表达的调控机制的研究提供有效的工具。