人白细胞介素2受体β(IL-2RB)基因真核表达及与JAK1的相互作用的检测北大核心

[目的]构建含人白介素2受体β(IL-2RB)基因的真核表达质粒p ENTER-IL-2RB-His,并在293T中进行真核表达,并用免疫共沉淀检测JAK1与IL-2RB在细胞内的相互作用。[方法]在Hela细胞中提取人总RNA,通过RT-PCR获得人IL-2RB的基因全长,并将其克隆至真核表达载体p ENTER-His中。经PCR克隆,双酶切、测序鉴定后,将重组质粒p ENTER-IL-2RB-His转染至293T细胞中。免疫印迹法检测不同时间点的IL2RΒ蛋白(24 h、36 h、48 h)在293T细胞中的表达,用免疫共沉淀检测JAK1和IL-2RB蛋白之间的相互作用。[结果]经PCR克隆、双酶切、测序鉴定质粒克隆正确。免疫印迹可见61 k Da的目的蛋白。共同转染JAK1和IL-2RB的质粒,免疫印迹可见分别为133 k Da和61 k Da的目的条带。[结论]成功获得IL-2RB基因全长,成功构建p ENTER-IL-2RB-His真核表达质粒,并在293T细胞中成功表达,随着时间的推移其表达量增高。免疫共沉淀可以检测到JAK1和IL-2RB两者的蛋白相互作用,这为下一步研究JAK1和IL-2RB这一对蛋白的相互作用的作用方式及作用机制奠定了基础。     

人白细胞介素10受体α基因真核表达及与JAK1蛋白的相互作用的检测

构建含人白介素10受体α(IL-10RA)基因的真核表达质粒p ENTER-IL-10RA-His,并在HEK293中进行真核表达,并用免疫共沉淀检测JAK1与IL10RA在细胞内的相互作用。在He La细胞中提取人总RNA,通过RT-PCR获得人IL10RA的基因全长,并将其克隆至真核表达载体p ENTER-His中。经PCR扩增、双酶切、测序鉴定后,将重组质粒p ENTER-IL-10RA-His转染至HEK293细胞中。免疫印迹法检测IL-10RA蛋白在HEK293细胞中的表达。结果显示,经PCR扩增和双酶切,测序鉴定质粒克隆正确。免疫印迹可见63 k D的目的蛋白。共同转染JAK1和IL-10RA的质粒,免疫印迹可见分别为133 k D和63 k D的目的条带,免疫共沉淀鉴定了JAK1和IL-10RA的相互作用。IL-10RA基因成功构建在p ENTER-His中,并在HEK293细胞中成功表达,并成功共转染JAK1和IL-10RA质粒,免疫共沉淀检测两者的相互作用。这为JAK1和IL-10RA相互作用的机制研究奠定基础。     

白细胞介素2受体α链(IL-2R_α):基因结构及表达调控

IL-2 R基因结构及表达调控是当代免疫学研究的重要课题,其阐明有助于揭示机体免疫应答及调节的机制。自1984年IL-2R_α链cDNA克隆建立以来,该领域研究已有很大突破,本文概要介绍了这方面的进展。     

人白细胞介素2受体(IL-2R)cDNA在哺乳类细胞中表达的初步研究

按DNA-磷酸钙共沉淀法将人白细胞介素2受体(IL-2R)cDNA转染小鼠成纤维细胞L929,经RNA点渍杂交分析、荧光标记IL-2染色和抗Tac(人IL-2受体α链)特异性玫瑰花环试验,均证明转入的IL-2R cDNA在L929细胞中表达,其产物具有结合IL-2和抗Tac抗体的能力。本文还报道了T细胞白血病Jukat细胞和Molt-4等细胞系异常表达IL-2R的结果,并对此作了分析和讨论。     

白细胞介素2受体α链(IL-2Rα):基因结构及表达调控

IL-2 R基因结构及表达调控是当代免疫学研究的重要课题,其阐明有助于揭示机体免疫应答及调节的机制。自1984年IL-2R_α链cDNA克隆建立以来,该领域研究已有很大突破,本文概要介绍了这方面的进展。     

人IL-37b基因真核表达载体的构建与表达

目的构建p EGFP-N1/IL-37b真核表达载体,并检测其在THP-1细胞中的表达情况。方法从人PBMCs中提取总RNA,利用RT-qPCR技术扩增出IL-37b基因编码区序列,克隆至p EGFP-N1真核表达载体,将构建的重组质粒p EGFP-N1/IL-37b转染到THP-1细胞中,通过RT-qPCR和Western blot检测IL-37的表达。结果双酶切及基因测序结果显示IL-37b基因正确插入真核表达载体p EGFP-N1中;RT-qPCR和Western blot结果显示转染THP-1细胞后,IL-37表达水平明显升高(P0.01)。结论成功构建了新型抗炎因子IL-37真核表达载体p EGFP-N1/IL-37b,为进一步研究IL-37功能及与相关疾病的关系奠定基础。     

人可溶性VEGFR2和IL-12融合基因真核表达质粒的构建与表达

[目的]构建和表达人可溶性血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)与白细胞介素12(IL-12)融合基因的真核表达质粒,并初步验证其抗肿瘤活性。[方法]根据Gen Bank公布的基因序列,设计并分别全基因合成全长人VEGFR2和IL-12基因,VEGFR2与IL-12通过Furin/2A(F2A)进行连接,融合基因克隆入真核表达载体p VAX1,构建p VAX1-VEGFR2-F2A-IL-12表达质粒。将p VAX1-VEGFR2-F2A-IL-12质粒瞬时转染293T细胞后,通过ELISA法测其真核表达能力。质粒注射B16荷瘤小鼠模型后,分析其抗肿瘤效果。[结果]质粒p VAX1-VEGFR2-F2A-IL-12构建成功;ELISA检测293T细胞转染上清液结果显示,VEGFR2和IL-12都能够在293T细胞中得到表达。质粒注射荷瘤小鼠模型后,显示出了较强的抑制B16肿瘤生长的能力,达到50%。[结论]p VAX1-VEGFR2-F2A-IL-12质粒成功构建和表达,该质粒具有较好的抑制B16肿瘤生长的能力,其抑制率达50%。     

人MDM2基因真核表达载体的构建及其与p53的相互作用

目的:构建带Flag标签的MDM2真核表达载体,并检测MDM2与p53的相互作用。方法:从人乳腺文库中PCR扩增MDM2编码序列,将其插入pcDNA3.0-Flag载体,转染293T细胞后用Western印迹检测其在293T细胞中的表达,并通过免疫共沉淀实验检测MDM2与p53的相互作用。结果:双酶切和测序结果表明,Flag-MDM2真核表达载体构建成功,转染293T细胞后成功表达;免疫共沉淀实验证明Flag-MDM2与p53存在相互作用。结论:构建了带Flag标签的人MDM2真核表达载体,并检测了MDM2与p53之间的相互作用,为研究MDM2的功能奠定了基础。     

人核受体Nurr1基因的克隆和表达及产物纯化(英文)

核受体相关因子 1(nuclearreceptor relatedfactor 1,Nurr1)是主要表达于中脑黑质及腹侧被盖区多巴胺能神经元的一种转录因子 ,属于核受体超家族成员 ,其功能性配体尚未被确认 .研究表明 ,Nurr1对中脑多巴胺神经元的发育、存活以及成熟后功能的维持具有特殊重要意义 .如能找到它的特异性配体 ,将为最终筛选出治疗帕金森病等中枢多巴胺失调性疾病的药物或化学合成先导物打下基础 .为了获取Nurr1蛋白以标定其配体以及研究蛋白质间的相互作用 ,采用RT PCR技术 ,从人胚中脑组织特异性扩增及克隆了人Nurr1cDNA ,并获得一个在氨基端缺失 35 0bp碱基的Nurr1突变体 .将正常的Nurr1基因片段亚克隆至表达载体pET2 8a ,分别在TNTRT7偶联网织红细胞溶胞系统和大肠杆菌BL2 1(DE3)中获得表达 ,均以可溶性形式存在 ,且产自于体外转录 翻译系统的真核表达Nurr1蛋白已标记上同位素3 5S .Western印迹分析表明 ,所表达的重组目的蛋白具有特异的免疫反应性 .经Ni NTA亲和层析 ,得到了初步纯化的rhNurr1蛋白 .     

人核受体Nurr1基因的克隆和表达及产物纯化(英文)

核受体相关因子 1(nuclearreceptor relatedfactor 1,Nurr1)是主要表达于中脑黑质及腹侧被盖区多巴胺能神经元的一种转录因子 ,属于核受体超家族成员 ,其功能性配体尚未被确认 .研究表明 ,Nurr1对中脑多巴胺神经元的发育、存活以及成熟后功能的维持具有特殊重要意义 .如能找到它的特异性配体 ,将为最终筛选出治疗帕金森病等中枢多巴胺失调性疾病的药物或化学合成先导物打下基础 .为了获取Nurr1蛋白以标定其配体以及研究蛋白质间的相互作用 ,采用RT PCR技术 ,从人胚中脑组织特异性扩增及克隆了人Nurr1cDNA ,并获得一个在氨基端缺失 35 0bp碱基的Nurr1突变体 .将正常的Nurr1基因片段亚克隆至表达载体pET2 8a ,分别在TNTRT7偶联网织红细胞溶胞系统和大肠杆菌BL2 1(DE3)中获得表达 ,均以可溶性形式存在 ,且产自于体外转录 翻译系统的真核表达Nurr1蛋白已标记上同位素3 5S .Western印迹分析表明 ,所表达的重组目的蛋白具有特异的免疫反应性 .经Ni NTA亲和层析 ,得到了初步纯化的rhNurr1蛋白 .     

人白细胞介素－2基因在人骨肉瘤细胞系内表达

从pHIG53质粒内切下人白细胞介素-2(IL-2)cDNA基因, 并经中间质粒pSP72转换成与pDOR-neo载体相匹配的酶切位点, 然后将IL-2cDNA定向连接入pDOR-neo载体, 构建成功人IL-2逆转录病毒载体, 经脂质体导入人骨肉瘤细胞系Ma中, 经G418筛选后测转基因肿瘤细胞培养上清中IL-2表达量, 每1×10⁵细胞24hIL-2表达量为50～800U, 为骨肉瘤的基因治疗创造条件.     

人白细胞介素—2基因在人骨肉瘤细胞系内表达

从ｐＨＩＧ５３质粒内切下人白细胞介素－２ｃＤＮＡ基因,并经中间一ｐＳＰ７２转换成与ｐＤＯＲ－ｎｅｏ载体相区域的酶切位点,然后将ＩＬ－２ｃＤＮＡ定向连接入ｐＤＯＲ－ｎｅｏ载体,构建成功人ＩＬ－２逆转录病毒载体,经脂质体民入人骨肉瘤细胞系Ｍａ中,经Ｇ４１８筛选后测转基因肿瘤细胞培养上清中ＩＬ－２表达量,每１×１０＾５细胞２４ｈＩＬ－２表达量为５０－８００Ｕ,为骨肉瘤的基因治疗创造条件。     

非受体型酪氨酸激酶JAK1基因真核表达质粒的构建与真核表达

[目的]构建非受体型酪氨酸激酶JAK1(nonreceptor tyrosine kinase-JAK1)基因真核表达质粒pcDNA4.0-HisJAK1,并转染293T细胞进行真核表达。[方法]从Hela细胞中提取总的RNA,通过RT-PCR获得JAK1基因全长c DNA序列,并将其克隆至真核表达载体pcDNA4.0-His中,构建重组质粒pcDNA4.0-His-JAK1。将真核重组表达质粒转染293T细胞,转染48 h后,在荧光显微镜下观察转染情况。免疫印迹法检测JAK1蛋白转染24 h、36 h与48 h在293T细胞中的表达。[结果]经双酶切与质粒PCR鉴定质粒克隆正确,测序鉴定序列中第2199位碱基A突变为G,为同义突变,不影响氨基酸序列。转染293T细胞48 h后,间接免疫荧光实验显示在293T细胞中检测到绿色荧光。免疫印迹检测可见大小约为133 kDa的目的蛋白。[结论]成功获得JAK1基因全长序列,并成功构建pcDNA4.0-HisJAK1真核重组表达质粒,并在真核细胞293T中获得有效表达,为进一步研究JAK1蛋白质相互作用奠定了基础。     

人CDK9基因真核表达及其与TP53蛋白的相互作用

[目的]构建细胞周期依赖性蛋白激酶9(CDK9)的真核表达载体pEnter-CDK9-His,利用HEK 293T真核表达系统表达CDK9蛋白并验证其与TP53蛋白之间的相互作用。[方法]利用聚合酶链反应从Hela细胞中扩增出CDK9靶基因序列,并将扩增出的CDK9基因片段通过无缝克隆技术克隆至pEnter载体上,经过PCR和一代测序验证插入位置正确且无突变后转染至人胚肾HEK 293T细胞,利用GST-pulldown技术检测本研究所表达的CDK9蛋白与TP53蛋白之间的相互作用。[结果]重组质粒pEnter-CDK9-His的插入基因序列与目的序列完全一致,蛋白免疫印迹检测到融合蛋白表达; GST-pulldown实验证实了CDK9蛋白与TP53蛋白存在直接的相互作用。[结论]成功构建了人CDK9基因的真核表达载体pEnter-CDK9-His,证实了所表达的CDK9融合蛋白与TP53蛋白存在着直接的相互作用,具有一定的生物学功能,为进一步研究CDK9和TP53在肿瘤发生发展以及治疗过程中发挥的功能奠定了基础。     

人Smurf1基因真核表达质粒的构建和表达

[目的]构建人Smurf1基因的真核表达载体并检测其表达和细胞亚定位。[方法]PCR法从人胚肾细胞HEK-293T中扩增Smurf1基因的ORF序列,将其插入到带Flag标签的p CMV5真核表达载体,插入位点为限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ之间。酶切并测序鉴定该质粒的正确性。将成功构建的质粒Flag-Smurf1转染HEK-293T细胞和Hela细胞,Western Blotting检测Smurf1蛋白的表达情况;转染Mv. 1. Lu细胞,免疫荧光检测Smurf1蛋白在细胞中的亚定位。[结果]成功扩增出Smurf1基因的ORF序列;连入p CMV5中获得了质粒Flag-Smurf1;酶切鉴定得到2. 2 kb大小的片段,测序结果显示连入的是Smurf1基因的c DNA序列正确。Western Blotting结果显示该质粒可在HEK-293T细胞和Hela细胞中表达,表达大小约为80 k Da,符合预期。免疫荧光实验结果显示过表达的Smurf1主要定位在细胞膜上。[结论]成功构建了带Flag标签的人Smurf1基因的真核表达质粒,该质粒可在细胞中顺利表达。     

TGF-β1基因真核表达载体的构建及在BMSCs中的表达

目的研究真核表达载体pCDNA3.1( )-TGF-β1在骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达.方法基因克隆构建pCDNA3.1( )-TGF-β1真核表达载体,转染大鼠BMSCs,G418筛选获得稳定转染的细胞,RT-PCR、ELISA和免疫细胞化学检测其表达,MTT法检测其增殖活性.结果成功构建含TGF-β1基因的真核表达载体;RT-PCR、ELISA、免疫细胞化学证实了TGF-β1基因在BMSCs中至少可以表达一个月;MTT法提示转染TGF-β1基因可以促进BMSCs增殖.结论 pCDNA3.1( )-TGF-β1转染BMSCs可获得稳定表达.     

人Tim-3 基因真核表达载体的构建及表达

目的:为了构建可在真核细胞中高效表达人Tim-3(hTim-3)的真核表达质粒,以便用于hTim-3肿瘤免疫治疗研究。方法:取健康人外周血的单个核细胞,用高保真聚合酶扩增hTim-3基因,先进行hTim-3基因的亚克隆,用BglⅡ和SalⅠ限制性内切酶切下带有酶切位点的hTim-3基因,最终构建hTim-3基因的真核表达质粒pEGFP-N1-hTim-3。用脂质体方法转染质粒至肝癌细胞SMMC7721和巨噬细胞U937中。48h后荧光显微镜观察转染细胞绿色荧光表达情况,初步判断转染效率。结果:酶切和测序鉴定证实目的基因hTim-3正确插入到真核表达载体pEGFP-N1中,转染肝癌细胞SMMC7721和巨噬细胞U937后,在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:成功构建了可在真核细胞中高效表达hTim-3基因的真核表达质粒pEGFP-N1-hTim-3,为进一步研究hTim-3的肿瘤免疫治疗奠定了基础。     

人Tim-3基因真核表达载体的构建及表达

目的：为了构建可在真核细胞中高效表达人Tim-3（hTim-3）的真核表达质粒,以便用于hTim-3肿瘤免疫治疗研究。方法：取健康人外周血的单个核细胞,用高保真聚合酶扩增hTim-3基因,先进行hTim-3基因的亚克隆,用Bgl II和SalI限制性内切酶切下带有酶切位点的hTim-3基因,最终构建hTim-3基因的真核表达质粒pEGFP-N1-hTim-3。用脂质体方法转染质粒至肝癌细胞SMMC7721和巨噬细胞U937中。48h后荧光显微镜观察转染细胞绿色荧光表达情况,初步判断转染效率。结果：酶切和测序鉴定证实目的基因hTim-3正确插入到真核表达载体pEGFP—N1中,转染肝癌细胞SMMC7721和巨噬细胞U937后,在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。结论：成功构建了可在真核细胞中高效表达hTim-3基因的真核表达质粒pEGFP-N1-hTim-3,为进一步研究hTim-3的肿瘤免疫治疗奠定了基础.     

牦牛白细胞介素2(IL2)基因cDNA 的分子克隆和表达研究

目的克隆牦牛免疫基因并研究其免疫特性。方法以伴刀豆球蛋白A（ConA）激活的体外培养的牦牛血液淋巴细胞,提取激活淋巴细胞的总RNA,用RT—PCR方法,从中克隆出白细胞介素2cDNA,连接到T载体上测序,并亚克隆到pC,EX4T-1表达质粒,在大肠杆菌进行了重组表达,纯化融合表达YIL2产物,MTT比色法测定其体外刺激牦牛血液淋巴母细胞增殖的免疫活性。结果YIL2cDNA序列分析显示：在其编码区442位点的一个碱基发生突变（由C突变为T）,从而导致终止密码子（TAA）出现,使YIL2蛋白表达提前终止,与其它牛IL2蛋白相比少了8个氨基酸。MTT比色法测定结果表明重组牦牛IL2蛋白体外能显著促进牦牛淋巴母细胞的增殖。结论本实验成功克隆了牦牛IL2基因,其原核表达产物具有显著的免疫活性,这为研制新型免疫增强剂来提高牦牛对各种疾病的抵抗力,增强牦牛疫苗的免疫保护率奠定了基础。