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相似文献
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1.
目的 克隆小鼠的Uncv基因并在真核细胞表达.方法 采用RT-PCR方法扩增小鼠皮肤组织中Uncv基因编码区,以真核表达质粒pcDNA 3.1-Flag为载体,构建Uncv真核表达质粒,将重组载体转染Hela细胞并用Western blot法检测基因表达.结果 构建Uncv基因真核表达载体pcDNA 3.1-Flag/Unev,重组质粒在Hela细胞中有效表达约95×103的融合蛋白.结论 成功构建真核表达载体pcDNA 3.1-Flag/Uncv,并且在真核细胞中有效表达,为研究Uncv基因生物学功能奠定基础.  相似文献   

2.
目的:探讨抑癌基因p16对肝癌细胞生长的抑制作用及其机制。方法:将p16 cDNA亚克隆至pcDNA3.1真核表达载体上,并经脂质体介导转染至人肝癌细胞株SMMC-7721。用MTT法和Western blot分析转染细胞的生长情况。结果:成功构建重组表达质粒pcDNA3.1-p16,转染pcDNA3.1-p16的SMMC-7721细胞生长速度受到明显抑制;转染后有外源p16蛋白的表达,且伴随Bax上调,Bcl-2和cIAP2的下调。结论:重组pcDNA3.1-p16质粒能在人肝癌细胞SMMC-7721内表达,且能抑制SMMC-7721的生长,其机理与诱导肿瘤细胞凋亡相关。  相似文献   

3.
组织金属蛋白酶抑制因子3(TIMP3)在肝癌中的具体作用机制尚不明确。该文探讨了TIMP3在肝癌细胞中的表达及其对细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期的影响。通过q RT-PCR和Western blot检测肝癌细胞株(97H、97L和HUH7)和人正常肝细胞(LO2)中TIMP3的表达情况。将过表达TIMP3的质粒转染进97H和HUH7细胞,利用q RT-PCR和Western blot检测转染后细胞的TIMP3表达情况。通过MTT实验和活细胞工作站检测过表达TIMP3对肝癌细胞增殖的影响。此外,通过流式细胞术检测过表达TIMP3对肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响,通过划痕实验检测表达TIMP3对肝癌细胞迁移的影响。最后,利用GESA软件进行基因富集分析以及Int Act数据库构建相互作用蛋白网络图对TIMP3相关生物学功能进行探索。研究结果表明, 97H、97L和HUH7细胞中TIMP3的表达比LO2细胞中低。97H和HUH7细胞转染TIMP3质粒后RNA及蛋白水平明显升高,且过表达TIMP3可以促进细胞增殖,促进G1期向S期转化,抑制细胞凋亡,下调Bax的表达,上调Bcl-2、Bcl-xl的...  相似文献   

4.
克隆人基质金属蛋白酶-2基因(Mmp2)编码区并构建重组真核表达载体pEYFP-Mmp2,研究其在肝癌细胞中的作用。以肝癌细胞Hep G2的总RNA为模板,通过RT-PCR获得cDNA,并通过PCR获得Mmp2基因编码区。经TA克隆和测序鉴定将无任何突变的Mmp2基因编码区插入到真核表达载体pEYFPN1中,构建p EYFP-Mmp2重组真核表达载体并进行酶切鉴定和测序鉴定。pEYFP-Mmp2稳定性转染肝癌细胞,经G418筛选获得Mmp2稳转单克隆细胞株,并用Western blotting分析鉴定。用实时无标记细胞增殖分析技术(RTCA)分析Mmp2基因对肝癌细胞生长增殖的作用,细胞划痕愈合实验分析Mmp2基因对肝癌细胞迁移的作用。结果证明成功构建重组真核表达载体pEYFP-Mmp2,Western Blotting证实稳转株中高表达外源融合蛋白MMP2-YFP。细胞增殖和迁移结果表明,Mmp2基因可以抑制肝癌细胞增殖但能够促进肝癌细胞迁移。以上研究表明,Mmp2基因能够促进肝癌细胞迁移。  相似文献   

5.
目的:构建βig-h3基因真核表达载体pEGFP-C2 /βig-h3并转染人7721肝癌细胞,检测转染后细胞MMPs表达水平的变化。方法:用RT—PCR方法获得βig-h3基因,以pEGFP-C2为载体,构建重组表达质粒pEGFP-C2 /βig-h3。重组质粒用脂质体转染人7721肝癌细胞,明胶酶谱法检测转染后细胞MMPs表达水平的变化。结果:正确构建了pEGFP-C2 /βig-h3重组质粒,并且在人7721肝癌细胞达到高转染效率,转染后细胞MMPs表达水平明显升高。结论:成功构建了pEGFP-C2 /βig-h3真核表达质粒,βig-h3促进人7721肝癌细胞分泌MMPs,提示βig-h3与肝癌的侵袭和转移密切相关。  相似文献   

6.
目的 构建人蛋白激酶Bγ(Akt3)基因编码区序列(cDNA)的真核表达载体、建立其稳定表达细胞株并观察其对MDA-MB-231细胞增殖的影响.方法 从流产胎儿脑组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增Akt3 cDNA的全长序列后克隆入pEGFP-N2质粒中,构建成Akt3基因真核表达载体,然后转染入MDA-MB-231细胞中,新霉素筛选稳定转染细胞克隆,通过MTT实验,研究转染Akt3基因前后细胞增殖的变化.结果 重组载体经酶切鉴定和测序证实目的 基因正确无误.Western印迹检测结果显示AKT3融合蛋白在MDA-MB-231细胞中表达良好,而转染空载体及未转染细胞对照中未见有此融合蛋白质条带;MTT结果显示AKT3表达上调的稳定克隆组,其增殖活性显著高于空载体稳定转染细胞组及未转染亲代细胞组,差异具有统计学意义(P<0.01),而后两者差异无统计学意义(P>0.05).结论 Akt3过表达可增强MDA-MB-231细胞的增殖.  相似文献   

7.
人同源盒基因NKX3.1对前列腺癌细胞的诱导凋亡作用   总被引:3,自引:0,他引:3  
构建人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体,研究其在前列腺癌细胞PC-3、LNCaP 中的表达及对细胞的促凋亡作用.以人前列腺癌细胞LNCaP细胞中的总RNA为模板,RT-PCR扩增NKX3.1基因全长编码片段,将NKX3.1 cDNA重组到真核表达载体pcDNA3.1(+)中; 将pcDNA3.1-NKX3.1表达载体瞬时转染前列腺癌细胞PC-3和LNCaP 细胞,用RT-PCR和Western印迹检测NKX3.1 cDNA在转录水平和蛋白水平的表达;绘制细胞生长曲线,观察NKX3.1对前列腺癌细胞增殖的抑制作用;用DNA/ladder和流式细胞术检测NKX3.1对前列腺癌细胞凋亡的影响,进一步用RT PCR检测凋亡相关基因caspase3、caspase8、caspase9、Apaf1、survivin和Bcl2表达的变化.人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体pcDNA3.1-NKX3.1经酶切及测序鉴定正确. pcDNA3.1-NKX3.1转染PC-3和LNCaP细胞后,经RT-PCR和Western印迹证明能有效表达NKX3.1.生长曲线显示,前列腺癌细胞转染NKX3.1 cDNA后细胞增殖受到抑制;前列腺癌细胞转染NKX3.1 cDNA 48 h后,DNA电泳呈现具有凋亡特征的DNA ladder;流式细胞术检测出现明显凋亡峰;RT-PCR检测凋亡相关基因.结果显示,caspase3、caspase8、caspase9基因表达明显增加,Bcl2基因表达明显减少.本研究成功构建了真核表达载体pcDNA3.1 NKX3.1, 转染PC3和LNCaP细胞后能有效表达,并对细胞具有诱导凋亡作用  相似文献   

8.
通过RNAi技术干扰人前列腺癌PC3细胞Bloom(BLM)解旋酶基因的表达。实验前期根据BLM解旋酶基因序列设计并合成两对sh RNA,插入到CMV-cop GFP-T2A-Puro-H1-mcs载体,构建针对BLM解旋酶基因的重组干扰载体CMV-cop GFP-T2A-Puro-H1-mcs-BLM1、CMV-cop GFPT2A-Puro-H1-mcs-BLM2。经测序载体构建成功后,用脂质体将所构建的载体及阴性对照载体转染前列腺癌PC3细胞,通过荧光定量PCR和Western blot检测转染细胞的BLM解旋酶表达情况。检测结果显示,成功构建了BLM解旋酶RNAi真核表达载体;利用脂质体转染PC3细胞后,荧光定量PCR和Western blot鉴定结果表明,BLM解旋酶的表达水平显著降低,即Bloom RNAi真核表达载体在m RNA和蛋白质水平阻断了BLM解旋酶的表达。  相似文献   

9.
构建真核表达载体pCAG-IRES-SHIP-GFP,并观察其在K562细胞中的表达。将SHIP逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)产物克隆入pCAG-IRES-GFP,经酶切、PCR鉴定及测序分析,构建pCAG-IRES-SHIP-GFP重组真核表达载体;采用脂质体转染法将pCAG-IRES-SHIP-GFP及空载体转入K562细胞,实时荧光定量PCR(FQ-PCR)、Western blot方法检测转染前后K562细胞中SHIP mRNA和蛋白的表达及Akt磷酸化水平改变,MTT、流式细胞仪检测等方法观察野生型SHIP基因表达对白血病细胞K562凋亡的影响。结果显示重组后的pCAG-IRES-SHIP-GFP质粒已成功载入SHIP的全长编码基因,序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜下可见在转染pCAG-IRES-SHIP-GFP的K562细胞中存在荧光分布。外源性SHIP基因表达能使K562细胞增殖受抑;Western blot检测提示K562细胞Akt308和Akt473的磷酸化水平为较转染前显著下调,分别为转染前的38.7%和36.8%(P<0.01)。上述结果表明基因全长3.5kb的人野生型SHIP基因真核表达载体质粒pCAG-IRES-SHIP-GFP构建成功,并在K562细胞中表达;外源性SHIP基因表达能使K562细胞凋亡增加;这些改变可能与p-Akt表达下调有关。  相似文献   

10.
目的探讨尾侧型同源转录因子-2(CDX2)基因过表达对胃癌BGC-823细胞增殖、迁移、凋亡等生物学特征的影响。方法采用脂质体转染法建立CDX2基因过表达的胃癌BGC-823稳定细胞株,分别采用RT-PCR、Western blotting和免疫细胞化学等方法检测转染重组表达载体pEGFP-C1/CDX2后,BGC-823细胞中CDX2基因及其蛋白的表达。MTT法检测CDX2基因过表达对细胞的增殖能力的影响;划痕实验检测CDX2过表达对细胞迁移能力的影响;流式细胞术检测CDX2过表达对细胞的凋亡的影响;应用基因芯片技术检测转染前后相关基因的差异表达。结果 RT-PCR及Western blotting检测结果显示,与对照组相比,转染pEGFP-C1/CDX2后,BGC-823细胞中CDX2基因和蛋白均呈高表达;CDX2过表达能明显降低转然组BGC-823细胞增殖能力和迁移能力;但对细胞凋亡影响不明显;基因芯片结果提示CDX2基因高表达能影响某些基因的表达。结论 CDX2过表达能明显抑制胃癌细胞增殖、降低迁移能力,提示CDX2在胃癌中可能发挥抑癌基因的作用。  相似文献   

11.
目的:探讨抑癌基因p16对肝癌细胞生长的抑制作用及其机制。方法:将p16cDNA亚克隆至pcDNA3.1真核表达载体上,并经脂质体介导转染至人肝癌细胞株SMMC-7721:用MTT法和Western blot分析转染细胞的生长情况。结果:成功构建重组表达质粒pcDNA3.1-p16,转染pcDNA3.1-p16的SMMC-7721细胞生长速度受到明显抑制;转染后有外源p16蛋白的表达,且伴随Bax上调,Bcl-2和cIAP2的下调。结论:重组pcDNA3.1-p16质粒能在人肝癌细胞SMMC-7721内表达,且能抑制SMMC-7721的生长,其机理与诱导肿瘤细胞凋亡相关。  相似文献   

12.
目的:构建干扰载体pSilencer 3.1-spl,并初步研究其对Spl基因的干扰作用.方法:根据Spl cDNA编码序列,设计并合成针对Spl基因的特异性RNA干扰片段,并将其克隆入pSilencer 3.1-Hl neo干扰载体中,构建Spl基因小干扰RNA(siRNA)真核表达载体pSilencer 3.1-Spl;分别将阴性对照载体pSilencer 3.1与重组载体pSilencer 3.1-Spl经脂质体LipofectAMINE2000介导转染HeLa细胞,采用RT-PCR、Western blot方法分别检测Spl基因的转录与表达水平.结果:构建了Spl基因siRNA真核表达载体pSilencer 3.1-Spl,经酶切、测序鉴定证实克隆正确,并在mRNA水平和蛋白水平证实了载体的干扰效果.结论:特异性siRNA能明显抑制Spl基因在HeLa细胞中的表达,为进一步研究Spl的生物学功能和作用机制奠定了实验基础.  相似文献   

13.
目的:构建小鼠CDC6基因的RNAi真核表达载体PGCsilencer TM u6/Neo/GFP/RNAi,观察其转染小鼠肝细胞前后CDC6的表达变化。方法:根据GenBank中CDC6的序列,设计特异性siRNA序列,将模板序列克隆至PGCsilencer U6/Neo/GFP质粒中,通过测序鉴定后,用脂质体将重组子转染至正常小鼠肝细胞中,用RT-PCR检测CDC6的mRNA的表达及用Western blot方法检测CDC6蛋白水平的表达,并比较转染前后其表达水平的变化。结果:经测序,模板序列与设计序列完全正确,经过RT-PCR及Western blot方法检测,转染干扰质粒后,小鼠肝细胞中CDC6表达在mRNA及蛋白水平都有明显的下降。结论:成功构建了CDC6基因的RNAi真核表达载体并转染至小鼠肝细胞中,为下一步探讨CDC6在肝再生的作用奠定了基础。  相似文献   

14.
旨在构建人C-Src蛋白酪氨酸激酶(Csk)基因真核表达系统。从He La细胞中提取总的RNA,通过RT-PCR获得Csk基因全长c DNA序列,并将其克隆至真核表达载体p ENTER中,构建重组质粒p ENTER-Csk-his。重组质粒转染293T细胞48h后通过SDS-PAGE、Western blot检测Csk蛋白表达情况,间接免疫荧光进行蛋白定位,通过镍螯合的磁珠法纯化Csk蛋白,hispulldown及CO-IP检测表达蛋白的活性。结果显示,经双酶切及测序鉴定,真核表达载体p ENTER-Csk-his正确没有突变,SDSPAGE及Western blot均可检测到大小约为51 k D的目的蛋白,说明Csk蛋白在293T细胞中表达成功,间接免疫荧光定位重组Csk蛋白在细胞质中表达,通过磁珠纯化得到Csk蛋白,最后通过his-pulldown及CO-IP发现Csk能够与IGF1R、SHC1相互作用,说明表达的Csk蛋白具有生物学活性。成功获得Csk基因全长序列,并构建重组p ENTER-Csk-his真核表达质粒,在真核细胞293T的细胞质中获得高效表达且表达的蛋白具有生物学活性。  相似文献   

15.
16.
人源性长寿保障基因2(Homo sapiens longevity assurance homologue2,LASS2)是本实验室克隆到的一个与酵母长寿保障基因LAG1高度同源的人类新基因。前期研究显示,LASS2可与V-ATPase质子泵的c亚基ATP6L结合,过表达LASS2可以抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长。本研究旨在探讨LASS2对V-ATPase质子泵功能的调节是否参与LASS2对肝癌细胞生长的抑制作用。使用本室构建、保存的pCMV-HA2-LASS2质粒瞬时转染肝癌细胞(HCCLM3),而未转染质粒的HCCLM3细胞作为空白对照,运用CCK-8试剂盒检测细胞生长情况;采用BCECF-AM和BCECF氢离子敏感探针分别测定细胞内、外H+浓度;应用流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测线粒体和胞质内细胞色素c(cytochrome c,Cytc)、胞质中的无活性pro-caspase-3的表达情况。结果显示,外源性LASS2的过表达对HCCLM3细胞生长有抑制作用;过表达LASS2使HCCLM3细胞内H+浓度上升,细胞凋亡率提高,线粒体Cyt c释放增加,胞质中pro-caspase-3含量下降。以上结果提示提示LASS2可能通过调控V-ATPase质子泵的功能,提高细胞内H+浓度,从而激活细胞线粒体凋亡途径、抑制肝癌细胞的生长。  相似文献   

17.
通过RT-PCR从培养的HUVECs中扩增MOB2基因片段,将该片段克隆在真核表达载体pEGFP-C1中,转染NIH3T3细胞,经G418筛选,构建稳定表达细胞系,并用荧光显微镜和Western blot对其进行鉴定。经RT-PCR扩增出734 bp基因片段,经测序分析并与GenBank的DNA序列比对分析后,在NIH3T3细胞中表达。G418筛选后,细胞荧光信号较强,Western blot检测,细胞中的融合蛋白能够与抗MOB2的多抗结合。成功地扩增了HUVECs中的MOB2基因全长cDNA并进行真核表达与鉴定。  相似文献   

18.
PIAS3α过表达对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响   总被引:1,自引:1,他引:0  
目的 研究过表达PIAS3α蛋白对人前列腺癌细胞系DU145细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响.方法 构建pcDNA3.1(+)-HA-PIAS3α真核表达载体,转染前列腺癌细胞系DU145,以蛋白免疫印迹实验检测外源PIAS3α的表达,通过MTT法检测细胞增殖,以流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡.结果 成功构建PIAS3α真核表达质粒,蛋白免疫印迹实验证实外源性PIAS3蛋白质DU145细胞中获得表达.分析目的 蛋白质过表达后的细胞生物学效应,结果显示在DU145细胞中过表达PIAS3α后,细胞增殖受到抑制;同时,细胞周期G0/G1期细胞显著增加,而S期细胞减少,细胞凋亡比率增加.结论 过表达PIAS3α抑制前列腺癌细胞的增殖并诱导其凋亡.  相似文献   

19.
目的:构建大鼠大麻素型Ⅰ受体绿色荧光融合蛋白真核表达载体并观察其在细胞中的表达。方法:大鼠CB1基因序列设计引物,以大鼠脑组织为模板扩增CB1基因编码区片段,克隆至增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N3中,构建重组融合蛋白表达载体pCB1-EGFP。将pCB1-EGFP质粒转染HeLa细胞,通过观察EGFP报告基因的表达以及免疫荧光,Western Blot方法鉴定CB1可在真核细胞中过表达情况。结果:构建重组融合蛋白表达载体pCB1-EGFP,单双酶切和测序验证正确。将pCB1-EGFP质粒转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察到融合表达的绿色荧光蛋白,且呈胞膜表达。免疫荧光试验也证明重组载体转染后,CB1基因和GFP共同定位于胞膜部分。Western Blot实验证明表达CB1蛋白。结论:成功构建了高表达的CB1-EGFP融合蛋白真核表达载体。  相似文献   

20.
H3N2亚型猪流感病毒M1基因克隆及表达特性分析   总被引:1,自引:1,他引:0  
从H3N2亚型猪流感病毒感染的鸡胚尿囊液中提取病毒基因组RNA,采用RT-PCR方法克隆M1全长基因,将M1基因亚克隆至pET-28a(+)表达载体中,构建重组表达质粒pET-28a-M1,将该重组质粒转化大肠杆菌BL21并经IPTG诱导表达。诱导产物经SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白M1获得大量表达,表达蛋白纯化后免疫Wistar大鼠制备多克隆抗体。Westernblotting检测结果表明制备的抗M1蛋白多克隆抗体可以识别大肠杆菌表达的M1蛋白和病毒感染细胞的病毒M1蛋白。构建M1基因真核重组质粒p3xFLAG-CMV-7.1-M1并转染Vero细胞,Western blotting检测表明抗M1蛋白多克隆抗体可以识别在Vero细胞中得到表达的M1蛋白,成功建立M1基因的真核表达系统。分析了病毒感染过程中M1蛋白的变化及其作为病毒复制指示分子的可能性。鼠源M1蛋白多克隆抗体的制备和M1基因真核重组表达质粒的构建,为进一步研究猪流感病毒的复制机理以及M1蛋白在病毒复制过程中的生物学功能奠定了基础。  相似文献   

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