Leptin过表达对猪前脂肪细胞脂滴形成的研究

研究Leptin过表达对猪前脂肪细胞脂滴形成的影响,旨为进一步研究Leptin与脂质代谢相关的分子机制奠定理论基础。选取Leptin过表达与野生型猪皮下脂肪组织,在无菌条件下分离前脂肪细胞进行传代培养并诱导分化形成脂滴,通过油红O和Bodipy染色后观察脂滴面积并分析脂质的含量,利用Q-PCR检测脂滴形成相关基因mRNA的表达水平。诱导4 d后可分化形成脂滴,油红O和Bodipy染色的结果显示,Leptin过表达猪前脂肪细胞脂滴数量和甘油三酯含量显著低于野生型(P0.05);且脂质合成相关基因PPARγ、SCAP、SREPB1和PLIN2的表达水平显著低于野生型(P0.01)。结果表明,过表达Leptin可促使猪前脂肪细胞中PPARγ、SREPB1、SCAP、PLIN2基因的表达下调,进而抑制脂滴形成。     

雌激素受体关联受体α 调节脂肪细胞甘油三酯分解

雌激素受体关联受体a (Estrogen-related receptor a,ERRα) 是调控机体能量代谢的关键转录调控因子,也是脂肪生成的关键调控者。为研究ERRα对脂肪细胞甘油三酯分解的影响及其分子机制,分化的猪脂肪细胞在PKA (Protein kinase A) 或/和ERK (Extracellular signal-related kinase) 抑制剂预处理和不处理的情况下,再用Ad-ERRα侵染或XCT790处理48 h。通过测定脂肪细胞中甘油三酯浓度和培养液中的甘油释放量分析脂肪细胞的脂解变化;Western blotting方法检测PPARγ (Peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)、perilipin A、p-perilipin A、HSL (Hormone sensitive lipase,HSL) 和ATGL (Adipose triglyceride lipase,ATGL) 蛋白表达。结果显示,ERRα显著促进猪脂肪细胞分化及甘油三酯积累,同时促进了甘油三酯水解;分别及同时阻断PKA和ERK通路并不影响ERRα对脂肪细胞甘油释放的促进作用;ERRα显著上调HSL、ATGL、PPARγ及perilipin A蛋白表达,但p-perilipin A水平并未发生变化。推测过量表达ERRα可能导致HSL和ATGL蛋白表达上调并促进甘油三酯水解,从而为脂肪细胞分化提供更多的游离脂肪酸 (Free fat acid,FFA) 作为甘油三酯合成周转的底物。     

CRISPR/Cas9敲除PLIN1基因增强3T3-L1脂肪细胞的脂解作用

应用CRISPR/Cas9技术敲除3T3-L1前脂肪细胞plin1,观察PLIN1缺失对脂肪细胞中脂肪水解的影响并探究可能机制。常规培养3T3-L1前脂肪细胞,电穿孔法转染plin1敲除载体,嘌呤霉素培养基挑选plin1敲除细胞,观察转染及筛选后的细胞存活率。"鸡尾酒"法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化,酶法测定甘油和TG含量,油红O染色观察脂滴形态及数目的变化。Western blotting检测PLIN1、PPARγ、Fsp27和脂肪酶的蛋白表达;RT-PCR检测PLIN1和脂肪酶的mRNA表达。对照组细胞诱导分化后,微小脂滴数目较少,单房脂滴数目较多并围绕细胞核呈环型排列。相较于对照组,敲除组细胞诱导分化后微小脂滴数目增加,单房脂滴体积缩小,数目减少;细胞中PLIN1mRNA及蛋白表达被显著抑制(P0.05);甘油水平显著上升(0.0984±0.0076),TG含量显著下降(0.031 0±0.005 3);HSL和ATGL两种脂肪酶的mRNA及蛋白表达均升高(P0.05);PPARγ和Fsp27的表达未有明显变化。上述结果表明plin1敲除后通过暴露脂滴中脂质以及上调脂肪酶等效应增强了3T3-L1脂肪细胞的脂解作用。     

Fsp27基因沉默载体的构建及其对细胞脂解的影响研究

构建脂肪特异性蛋白27(Fat-specific protein of 27,Fsp27)基因沉默载体,研究沉默Fsp27基因表达对3T3-L1细胞脂解的影响,并对其作用机制进行探究。采用RNAi技术,构建Fsp27基因真核干扰载体,下调Fsp27基因的表达。“鸡尾酒”法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞。脂质体转染脂肪细胞,油红O染色脂滴,酶法测定细胞中甘油及甘油三酯的含量。Western blot法检测细胞中Fsp27、HSL、ATGL和PPARγ的蛋白表达。Western blot结果显示:阳性sh-Fsp27干扰载体均能有效下调Fsp27的表达,且伴随细胞内ATGL和PPARγ的表达量升高(P<0.05),其中sh-Fsp27-2的沉默效果最好;酶学方法检测结果显示:阳性sh-Fsp27干扰组细胞中甘油三酯含量下降,甘油含量升高(P<0.05);油红O染色结果发现:空白对照组与阴性对照组均有大脂滴堆积,阳性sh-Fsp27组小脂滴分布广泛,未见明显的大脂滴。sh-Fsp27-2组基因沉默载体的沉默效果最好,Fsp27基因沉默可以加快3T3-L1细胞的脂解速率,其主要是通过抑制脂滴融合和增强ATGL酶的水解来完成对脂解的调控。     

下调Fsp27基因表达联合杨梅素干预对3T3-L1细胞脂解的影响

目的:下调脂肪特异性蛋白27(Fsp27)基因表达联合杨梅素干预,观察对3T3-L1细胞中脂质代谢的影响,并探究脂滴发生、发展变化的调控机制。方法:常规培养3T3-L1前脂肪细胞,采用"鸡尾酒"法诱导其分化为成熟脂肪细胞。脂质体法转染sh-Fsp27干扰载体,以杨梅素浓度为100μmol/L的完全培养基干预成熟脂肪细胞72h。油红O染色,观察脂滴形态及大小的变化;酶法测定细胞内甘油及甘油三酯的含量,观察细胞脂质代谢的变化。Western blot检测Fsp27、激素敏感性甘油三酯脂肪酶(HSL)、甘油三酯脂肪酶(ATGL)以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路蛋白的表达。结果:1. 3T3-L1细胞诱导分化后,形态由纤维样变成圆形,并伴随有细胞体积的增大。2.与对照组相比,杨梅素组和转染组细胞中甘油三酯含量下降,甘油含量升高(P 0. 05)。与其他三组相比,联合干预组细胞中甘油三酯含量减少,甘油含量增加(P 0. 05)。3.与对照组相比,其余三组细胞内Fsp27蛋白的表达量均降低,ATGL和PPARγ的表达量升高(P 0. 05)。另外,联合干预组和杨梅素组细胞内HSL的表达量和p-p38MAPK/p38MAPK的比值均大于sh-Fsp27组和对照组(P 0. 05)。结论:1. Fsp27基因沉默与杨梅素联合干预可以更大程度地促进脂肪分解代谢。2.杨梅素可通过激活MAPK信号通路,上调HSL和ATGL的蛋白表达来发挥其促脂解的作用; sh-Fsp27干扰载体通过调节PPARγ和Fsp27蛋白的表达,增加ATGL含量来加速脂肪分解。     

过表达miR-103促进猪前体脂肪细胞分化

为阐明miR-103在猪前体脂肪细胞分化过程中的调控作用,采用Real-time PCR检测猪前体脂肪细胞成脂分化过程中的miR-103表达谱,明确了其在分化过程中的表达趋势;使用miR-103的腺病毒超表达载体感染猪原代脂肪细胞,随后采用Real-time PCR和Western blotting分别检测成脂标记基因PPARγ、aP2的mRNA和蛋白表达量变化;油红O染色观察腺病毒miR-103侵染的前体脂肪细胞诱导分化第8天的成脂情况。结果显示,miR-103的表达量随着脂肪细胞分化而增加,在miR-103超表达的猪原代脂肪细胞的诱导分化过程中,成脂标记基因PPARγ、aP2的表达量与对照相比显著升高,分化第8天观察到明显的脂滴。说明miR-103能够促进猪前体脂肪细胞分化。     

EGCG对猪前体脂肪细胞增殖和分化的作用

表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin-3-gallate,EGCG）是绿茶提取物EGCG的生物活性成分,为了探讨其对猪前体脂肪细胞增殖和分化的影响,以不同浓度EGCG处理猪前体脂肪细胞,MTT法测定EGCG对猪前体脂肪细胞生长的影响;油红O染色检测猪前体脂肪细胞的形态学变化;油红O染色提取法定量分析脂肪细胞充脂量的变化;半定量RT-PCR检测分化转录因子过氧化物酶体增生物激活受体佗（PPARγ2）和CCAAT／增强子结合蛋白α（C／EBPα）mRNA表达水平变化。结果显示：EGCG随着浓度的递增显著抑制猪前体脂肪细胞的增殖（P〈0．01）;低浓度的EGCG（5μmol／L）不影响脂肪细胞分化,而高浓度EGCG（200μmol／L）显著抑制猪前体脂肪细胞分化,同时下调PPARγ2和C／EBPαmRNA表达,本研究结果表明EGCG可抑制猪前体脂肪细胞的增殖和分化。     

miR-301b对山羊肌内脂肪细胞分化的调控作用

旨在明确miR-301b对山羊肌内脂肪细胞分化的调控作用,探讨其发挥调控作用的可能机制。利用化学合成的miR-301b mimics和miR-301b siRNA,通过脂质体转染法在山羊肌内脂肪细胞过表达和干扰miR-301b,并通过油红O染色、qPCR和生物信息学分析等方法,从细胞形态学和mRNA水平明确miR-301b对山羊肌内脂肪细胞分化的调控作用,并初步探究其可能的作用机制。结果表明,过表达miR-301b效率约29 290倍,细胞形态学结果显示,过表达miR-301b后山羊肌内脂肪细胞脂滴积聚减少,甘油三酯合成降低。qPCR结果显示,过表达miR-301b后成脂标志基因CEBPα、PPARγ、SREBP1、LPL表达水平极显著下调(P<0.01)。miR-301b干扰效率约60%,干扰miR-301b表达后,细胞形态学结果显示,山羊肌内脂肪细胞脂滴积聚增加,甘油三酯合成升高。qPCR结果显示,干扰miR-301b后成脂标志基因AP2、CEBPα、CEBPβ、PPARγ、SREBP1、LPL表达水平极显著上调(P<0.01)。通过对miR-301b生物信息学分析,推...     

Rheb过表达在前体脂肪细胞株3T3-L1分化中的作用

目的:利用前体脂肪细胞株3T3-L1细胞观察mTOR(mammalian target of rapamycin)信号通路中上游调控因子Rheb(Ras homolog enriched in brain)对其分化的影响。方法:利用高表达Rheb的基因重组质粒转染前体脂肪细胞株,3T3-L1。通过蛋白质免疫印迹实验鉴定质粒成功转染细胞后,诱导该细胞脂肪分化。予以分化第8天的3T3-L1细胞油红染色,并检测细胞内甘油三酯的含量。另外,我们用Western blot方法检测脂肪细胞特异性转录因子PPAR-γ(Peroxisome proliferator-activated receptor-γ)和C/EBP-α(CCAAT-enhancer-binding protein-α)的表达情况来研究Rheb在脂肪细胞分化过程中的作用。结果:我们成功构建了高表达Rheb的3T3-L1细胞株,发现高表达Rheb后可以促进脂滴的生成,油红O染色有显著区别,与对照组相比Rheb高表达组的三酰甘油含量明显升高(P0.05);C/EBP-α和PPAR-γ等脂肪细胞特异性的转录因子蛋白表达量与对照组相比也均有升高(P0.05)。结论:Rheb基因作为mTOR通路上游调控因子,可以促进脂肪细胞的分化。     

黄芩素对猪前体脂肪细胞增殖分化的影响

研究黄芩素(BAI)对猪前体脂肪细胞增殖分化的影响,并探讨其可能的作用机制。原代培养猪前体脂肪细胞,采用油红O染色观察细胞分化的形态学变化;MTT检测细胞增殖状况;油红O染色提取定量分析细胞内脂肪生成及细胞分化程度;分光光度法测定脂肪酸合酶(FAS)的活性;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测分化特异基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ2)mRNA表达变化。结果显示,前体脂肪细胞在分化成脂肪细胞的过程中,其形态由梭形变成椭圆形、圆形,细胞内充满大小不一的脂滴;BAI浓度在160～640μmol/L时显著抑制其增殖(P<0.05)、BAI浓度为40～320μmol/L时显著抑制PPARγ2mRNA表达和FAS的活性,并抑制细胞分化(P<0.05)。以上结果说明,BAI对前体脂肪细胞增殖分化均有一定抑制作用,BAI可能通过抑制PPARγ2mRNA表达和降低FAS活性,从而抑制猪前体脂肪细胞分化。     

miR-486通过靶基因Pten/Foxo1调控小鼠肝细胞脂质代谢

该文研究了mi R-486在小鼠肝细胞内是否可通过调控其靶基因Pten(phosphatase and tensin homolog,同源性磷酸酶–张力蛋白)/Foxo1(forkhead box O1,叉头转录因子)进而影响甘油三酯(triglyceride,TG)和极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)的合成。采用腺病毒载体感染小鼠肝癌细胞Hepa1-6,并测定靶基因Pten/Foxo1表达及VLDL和TG变化。腺病毒载体感染mi R-486的模拟剂(mimic)和抑制剂(antago)至细胞株Hepa1-6,Ad-mi R-486 mimic组mi R-486水平显著增加(P0.001),PTEN/Fox O1的m RNA和蛋白质水平显著降低,细胞内VLDL含量显著降低(P0.01),TG含量明显增加(P0.05);反之,Ad-mi R-486 antago组mi R-486表达水平受到抑制,PTEN/Fox O1的m RNA和蛋白质水平显著增加(P0.01),且细胞内VLDL含量显著增加(P0.01),TG含量明显降低(P0.05)。该研究结果表明,mi R-486可能通过调节Pten/Foxo1来影响细胞内的VLDL和TG生成。     

维生素C通过调控脂肪形成相关基因的转录促进猪前体脂肪细胞的增殖与分化

探讨维生素C（Vit C）诱导猪前体脂肪细胞增殖分化最佳浓度及在分化过程中,5种脂肪形成相关基因peroxisome proliferator activated receptor gamma(PPARγ)和retinoid X receptor alpha(RXRα),脂肪细胞分化标志基因lipoprotein lipase (LPL),生脂基因phosphoenolpyruvate carboxykinase(PEPCK)、stearoyl CoA desaturase(SCD) mRNA表达时序性的变化. 以3　d龄猪前体脂肪细胞为实验对象,用Vit C诱导猪前体脂肪细胞增殖分化,分别在增殖分化第2、4、6和8 d收获细胞,利用MTT测定其增殖程度;油红O染色提取法检测其脂肪含量;采用SQ RT PCR法检测脂肪生成相关基因PPARγ、RXRα、LPL、PEPCK和SCD mRNA表达的变化. 结果显示,PPARγ mRNA在诱导分化第2 d时有低水平表达,在诱导分化过程中表达量逐步升高,在终末分化阶段仍保持高水平表达;RXRα mRNA在诱导分化第2和4 d表达量很低,诱导分化第6 d时表达增加.在诱导分化第8 d,RXRα mRNA表达与第6 d相比差异不显著,直至终末分化. 脂肪细胞分化标志基因LPL在第2 d开始表达,第4和6 d逐步升高,在终末分化阶段仍保持高水平的表达;生脂基因PEPCK和SCD mRNA在第2和4 d开始表达,第6和8 d仍保持高水平的表达. 研究结果表明,100 μmol/L的Vit C促进猪前体脂肪细胞增殖能力最强;250 μmol/L Vit C能显著促进猪前体脂肪细胞分化. 其作用机制可能是通过对转录因子PPARγ和RXRα及标志基因LPL mRNA时序性表达的调控来进行的,促进生脂基因的表达,从而诱导脂肪细胞的分化.     

Arg缓解MSTN对猪肌肉间充质干细胞成脂-分化的抑制

间充质干细胞可分化为脂肪细胞并沉积脂质,从而增加动物脂肪沉积.因此,猪肌肉间充质干细胞被认为是肌内脂肪的重要来源之一.本研究主要在体外探讨了肌肉生长抑制素（MSTN）对猪肌肉来源间充质干细胞成脂分化的影响及Arg的调控作用.结果表明,外源添加MSTN活性蛋白极显著地降低了胞内甘油三酯水平,而添加Arg或MSTN抗体则表现相反的作用（P〈0.01）.同时添加Arg可缓解MSTN对间充质干细胞脂质沉积的抑制作用（P〈0.01）.生脂转录因子表达模式分析表明,外源添加MSTN抑制了细胞PPARγ2和aP2的表达,添加Arg和MSTN抗体增强了细胞ADD1的表达（P〈0.01）.此外,同时添加MSTN蛋白和Arg较仅添加MSTN蛋白极显著增强了细胞ADD1和PPARδ的表达（P〈0.01）,同时添加MSTN和Arg抗体较仅添加MSTN抗体显著增强了细胞ADD1,PPARδ,C/EBPα,PPARγ2和LPL的表达（P〈0.05）.由此可见,MSTN抑制了猪肌肉来源间充质干细胞成脂分化,添加Arg至少部分地通过上调ADD1和PPARδ的表达来缓解MSTN对成脂分化的抑制作用.     

PPARγ对结核分枝杆菌脂蛋白P19诱导的巨噬细胞炎症反应的影响

目的:探讨PPARγ对结核分枝杆菌细胞壁成分19 kDa脂蛋白(M.tb-P19)诱导的巨噬细胞免疫反应的影响。方法:以M.tb H37Rv和M.tb-P19刺激人源性巨噬细胞48 h,观察其对巨噬细胞PPARγ表达的影响。分别采用激动剂、拮抗剂干预PPARγ活性,观察PPARγ被激活或抑制后对M.tb-P19诱导的ERK磷酸化、NF-κB的表达以及炎症细胞因子IL-6、TNF-α的表达的影响。结果:M.tb-P19感染的人巨噬细胞中PPARγ的表达较正常对照细胞显著升高,且随作用时间的延长逐渐增加(P0.05),48h达高峰。M.tb-P19感染可显著增加人巨噬细胞中磷酸化ERK、NF-κB、TNF-α和IL-6的表达(P0.05),PPARγ激动剂预处理可显著抑制M.tb-P19感染所致的磷酸化ERK、NF-κB、TNF-α和IL-6的表达增加(P0.05),而PPARγ拮抗剂预处理可进一步提高磷酸化ERK、NF-κB、TNF-α和IL-6的表达(P0.05)。结论:PPARγ可能是通过激活ERK及NF-κB信号通路,抑制M.tb-P19所介导的巨噬细胞炎症反应。     

过表达MicroRNA-199a促进TNFα诱导的脂肪细胞凋亡

旨为探明micro RNA-199a(mi R-199a)对脂肪细胞凋亡的影响及核转录因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)在其中的作用。培养3T3-L1脂肪细胞,使用肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα)诱导细胞凋亡。在此基础上分别使用NF-κB阻断剂PDTC和mi R-199a mimic处理细胞,判断过表达mi R-199a对TNFα诱导的脂肪细胞凋亡的影响及NF-κB在其中的作用。使用流式细胞仪分析细胞凋亡率,试剂盒检测Caspase3/7酶活,双荧光素酶报告系统检测NF-κB活性,q RT-PCR检测mi R-199a的表达水平,Western blotting检测NF-κB相关蛋白变化。结果显示,TNFα可以诱导分化的脂肪细胞凋亡并同时激活NF-κB,激活的NF-κB在TNFα诱导的脂肪细胞凋亡中发挥负调控作用。在脂肪细胞过表达mi R-199a明显抑制NF-κB的激活进而显著促进TNFα诱导的凋亡。mi R-199a通过调控NF-κB活性参与TNFα诱导的脂肪细胞凋亡。     

MiR-130a 在猪皮下脂肪细胞分化中的调节作用

为研究miR-130a对猪皮下脂肪细胞分化的影响及可能机制,本试验分离猪皮下脂肪前体细胞,诱导分化为成熟脂肪细胞,检测脂肪细胞分化过程中脂滴变化及miR-130a及其可能靶基因TNF α和PPARγ的表达模式.同时合成miR-130a mimics及inhibitor 对细胞进行转染,并以乱序序列作为阴性对照（NC）.细胞转染24 h后进行诱导分化,连续诱导8 d,检测各处理细胞的聚脂情况及甘油三酯含量变化,荧光定量PCR检测脂肪细胞分化相关基因的表达变化.结果显示,猪皮下脂肪前体细胞分化过程中脂滴逐渐变大增多,miR-130a、TNF α和PPARγ的表达模式具有一定的相似性.转染结果显示,相对于对照组,miR 130a mimics转染组细胞脂滴减少变小,甘油三酯含量降低（P<0.05）,脂肪细胞分化相关基因LPL、PPARγ、adiponectin、FASN和葡萄糖转运相关基因GLUT1,GLUT4以及JNK通路上的PDE3B的表达均比对照组显著下调（P<0.01）;而miR-130a inhibitor转染组细胞则脂滴增多,甘油三酯含量提高（P<0.05）,但大部分分化相关基因的表达与对照组无显著差异,提示miR-130a可能不只通过单一的靶基因影响脂肪细胞分化.其结果为后续深入研究miR-130a调节猪脂肪细胞分化的通路及机制奠定基础.     

罗格列酮对猪脂肪前体细胞分化过程中聚脂相关基因表达模式的影响

为了解罗格列酮对猪脂肪前体细胞诱导分化过程的影响, 利用胶原酶消化法分离猪皮下脂肪前体细胞, 采用含50 nmol/L胰岛素、100 nmol/L地塞米松及0.25 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的分化培养液Ⅰ(对照组)和在分化培养液Ⅰ中添加100 nmol/L罗格列酮的分化培养液Ⅱ(实验组)两种诱导分化方法对脂肪前体细胞进行诱导分化, 借助实时定量RT-PCR方法检测了细胞分化过程中聚脂相关基因的表达。结果显示: 罗格列酮对PPARγ、C/EBPα、FABP4、FASN和GPAT基因的表达有显著的上调作用, 而对PPARα有一定的下调作用。试验组中PPARα、PPARγ、C/EBPα、FABP4、FASN和GPAT等基因分别于48 h、48 h、48 h、108 h、60 h和24 h达到表达高峰, 此时的表达量分别是诱导前的1.7、48、3.3、487.5、5.8和3.6倍, GPAT同PPARα和FASN基因表达量间均达到显著相关(P<0.05); 而对照组中PPARα、PPARγ、C/EBPα、FABP4、FASN和GPAT等基因分别于84 h、96 h、48 h、96 h、36 h和36 h达到表达高峰, 此时的表达量分别是诱导前的2.1、11、1.6、216.5、3.5和2.8倍, GPAT同PPARα和FASN基因表达量间均达到极显著相关(P<0.01)。本实验结果表明: 罗格列酮不仅可以极大的促进PPARγ和C/EBPα基因的表达, 还能让其协同达到表达高峰; PPARγ和C/EBPα可能是调控猪脂肪前体细胞分化的关键转录因子; 在脂肪形成过程中, 甘油脂类的生物合成可能发生较早, 同时PPARα可能主要参与甘油脂类生物合成的调控。     

视黄酸X受体α促进猪前体脂肪细胞分化

采用细胞转染、油红O染色、油红O染色提取法、GPDH活性测定、semi-qRT-PCR等方法研究了视黄酸X受体α (retinoic acid X receptor α, RXRα)在猪原代前体脂肪细胞分化中的作用及其机理.结果表明,转染pRXRα-EGFP促进了猪前体脂肪细胞RXRα 的表达,脂肪细胞分化能力随之增强, 脂肪细胞GPDH活性、分化转录因子PPARγ和C/EBPαmRNA表达水平均显著升高(P<0.05). 结果提示,RXRα可能通过调控过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptor-γ, PPARγ)和CAAT/增强子结合蛋白家族（CCAAT/enhancer binding proteins, C/EBP）C/EBPα 基因表达变化促进猪前体脂肪细胞分化.     

下调Perilipin 1基因表达对3T3-L1细胞脂解的影响

目的:研究下调围脂滴蛋白基因(PLIN1)表达对3T3-L1细胞脂解的影响。方法:采用RNA干扰技术,构建3组阳性及1组阴性sh-PLIN1重组载体,并进行菌液PCR和DNA测序鉴定。Western blot测定PLIN1A蛋白表达,评价载体下调效果。细胞转染有效载体2天后,Bodipy 493/503染色脂滴;酶学方法测定细胞中甘油三酯和甘油含量;Western blot检测甘油三酯脂肪酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)及其磷酸化蛋白(p-HSL)的表达。酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞中环磷酸腺苷(c AMP)和蛋白激酶A(PKA)的浓度。结果:各sh-PLIN1干扰载体构建成功,且3组阳性载体均能显著下调PLIN1A蛋白的表达(P0.05)。转染有效载体后,与阴性转染组相比,sh-PLIN1转染组细胞中脂滴减小,甘油三酯含量降低,甘油含量升高,ATGL和HSL相对表达量显著升高(P0.05),p-HSL相对表达量及c AMP、PKA的浓度无显著性差异(P0.05)。结论:下调PLIN1基因表达可加快3T3-L1细胞脂解速率,其可能通过上调ATGL和HSL的表达而实现,c AMP/PKA信号通路对其无明显调节作用。     

Txnip基因siRNA慢病毒表达质粒构建及促进猪前体脂肪细胞分化

硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein, Txnip)是一种氧化还原调节蛋白质,与硫氧还蛋白结合并抑制其活性,调节细胞氧化还原状态,影响细胞多种生理过程,然而其在猪脂肪细胞分化中的作用尚不明确。本文设计合成3对靶向猪Txnip基因的shRNA寡核苷酸,分别连接于重组慢病毒载体pGLV_3/H_1/GFP+Puro构建siRNA表达质粒。测序验证后,与包装质粒共转染293T细胞,获得滴度1×10~8 pfu/mL的慢病毒干扰质粒。以MOI值100转染原代培养猪前体脂肪细胞,转染率均达80%以上,其中Txnip-shRNA-2转染细胞Txnip基因沉默率达75%。转染Txnip-shRNA-2的猪前体脂肪细胞用成脂分化培养液诱导后,每隔1 d检测细胞成脂分化及相关基因表达。结果发现,其分化比阴性对照质粒转染或未转染细胞显著增强(P<0.05),PPARγ和FAS mRNA表达水平显著提高(P<0.05)。本文构建siRNA慢病毒表达质粒能有效干扰猪Txnip基因表达,Txnip表达沉默可通过上调PPARγ表达促进猪前体脂肪细胞分化。本研究提示,Txnip可能是猪脂肪细胞分化的抑制因子。