Srsf1敲低对GT1-7细胞基因表达谱的影响

目的:本研究通过RNA-seq技术分析Srsf1基因表达敲低的GT1-7细胞(knock down, KD)和野生型GT1-7细胞(wide type,WT)的表达谱和可变剪接事件,研究Srsf1敲低对GT1-7细胞基因表达谱的影响。方法:利用实验室现有的Srsf1基因表达敲低的GT1-7细胞(SRSF1-KD)和野生型GT1-7细胞分别抽提RNA,做RNA-seq数据分析,利用r MATS软件分析两株细胞内可变剪接事件的变化,确定Srsf1调控的下游关键基因。结果:结果显示共有875个基因表达存在显著性差异,对这些基因进行KEGG通路分析,发现γ-氨基丁酸能突触、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等与性发育相关的通路均受到影响。此外,P53通路也受到Srsf1敲低的影响。利用r MATS软件进行可变剪接事件分析,显示共发生839个可变剪接事件,涉及719个基因,进行KEGG通路分析发现与性发育相关的MAPK信号通路受到影响。结论:成功检测了GT1-7细胞和Srsf1基因敲低的GT1-7细胞表达谱,通过分析基因表达差异以及可变剪接事件,证明了Srsf1对于PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、γ-氨基丁酸能突触信号通路、p53通路的调控作用,并且这些信号通路提示我们Srsf1可能更多的通过非可变剪接方式影响性发育相关基因的表达,而非可变剪接方式,从而为更深入的性发育研究提供了理论基础。     

肝癌细胞HepG2中增强子的识别及生物信息学分析

目的:整合增强子特征识别肝癌细胞HepG2增强子,并对其保守性、GC含量、转录因子调控、靶基因功能等进行分析,以期解析肝癌细胞增强子参与的调控网络。方法:通过整合H3K27ac、H3K4me1和H3K4me3组蛋白修饰及DNaseⅠ高敏位点的Chip-seq数据预测HepG2中的增强子,计算每个增强子的平均Phast Cons分数和GC含量,评估整体增强子的保守性与GC含量,整合ENCODE转录因子结合位点数据寻找转录因子-增强子调控,使用GREAT和DAVID分别对增强子和增强子的靶基因进行GO与KEGG通路功能富集分析。结果:共识别2254个肝细胞癌增强子,1432个增强子靶基因,135个转录因子的9983个增强子结合位点;比较随机位点靶基因,发现增强子显著正调控靶基因的表达;保守性与GC含量分析表明增强子具有显著高的保守性与GC含量,并存在C-T/C-T/C-T-G模式的motif;增强子功能分析显示增强子显著富集于蛋白结合、酶结合、转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ结合等已知增强子功能,增强子GO与KEGG通路功能富集分析表明增强子靶基因显著参与细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期调控和细胞迁移等肿瘤相关的生物进程与信号通路。结论:识别的肝细胞癌增强子具有显著高的保守性与GC含量,受多种转录因子调控,对其靶基因起正调控作用并且显著富集于肿瘤相关生物学进程与信号通路中。     

绵羊不同发育阶段背最长肌组织中可变剪接的鉴定与分析

可变剪接(Alternative splicing,AS)是动植物体内蛋白质多样性和遗传多样性的重要调控机制。为鉴定和分析绵羊不同发育阶段背最长肌组织中可变剪接,对多浪绵羊妊娠90日龄胎儿(F90)、出生后30日龄羔羊(L30)和成年3岁羊(A3Y)的背最长肌组织进行转录组测序,利用rMATS软件鉴定样品中的可变剪接事件和差异剪接基因(Differential splicing gene,DSG),并对DSG进行GO和KEGG功能富集分析。结果表明,绵羊背最长肌组织在F90、L30和A3Y时期分别鉴定出13 923、11 959和12 164个可变剪接事件,其中外显子跳跃(Skipped exons,SE)的比例最高,约为70.69%,5'端可变剪接位点(Alternative 5'splice sites,A5SS)、3'端可变剪接位点(Alternative 3'splice sites,A3SS)、互斥外显子(Mutually exclusive exons,MXE)和内含子保留(Retained introns,RI)的比例分别约为7.28%、11.18%、5.96%和4.84%。在F90_vs_L30、F90_vs_A3Y和L30_vs_A3Y比较组中分别鉴定到2 545、2 689和1 701个显著的差异剪接基因(P0.05)。GO和KEGG功能富集分析显示,差异剪接基因显著富集到横纹肌发育、肌肉结构发育、肌细胞分化、肌膜、胰岛素信号通路、Wnt信号通路、MAPK信号通路等与肌肉发育密切相关的通路上。上述结果表明可变剪接在背最长肌发育中发挥重要作用。     

基于RNA-Seq数据识别果蝇剪接位点和可变剪接事件

完整基因结构的预测是当前生命科学研究的一个重要基础课题,其中一个关键环节是剪接位点和各种可变剪接事件的精确识别.基于转录组测序（RNA-seq）数据,识别剪接位点和可变剪接事件是近几年随着新一代测序技术发展起来的新技术策略和方法.本工作基于黑腹果蝇睾丸RNA-seq数据,使用TopHat软件成功识别出39718个果蝇剪接位点,其中有10584个新剪接位点.同时,基于剪接位点的不同组合,针对各类型可变剪接特征开发出计算识别算法,成功识别了8477个可变剪接事件（其中新识别的可变剪接事件3922个）,包括可变供体位点、可变受体位点、内含子保留和外显子缺失4种类型.RT-PCR实验验证了2个果蝇基因上新识别的可变剪接事件,发现了全新的剪接异构体.进一步表明,RNA-seq数据可有效应用于识别剪接位点和可变剪接事件,为深入揭示剪接机制及可变剪接生物学功能提供新思路和新手段.     

东方蜜蜂微孢子虫的SNP与InDel位点鉴定及分析

【目的】东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae是一种专性侵染成年蜜蜂中肠上皮细胞的单细胞真菌病原,广泛感染世界各地的蜂群。本研究拟利用已获得的东方蜜蜂微孢子虫纯净孢子的高质量转录组数据进行单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNP）和插入缺失（Insertion-Deletion,InDel）位点的鉴定和分析,旨在丰富东方蜜蜂微孢子虫的SNP和InDel信息,并为新型分子标记的开发提供基础。【方法】使用GATK软件识别东方蜜蜂微孢子虫的SNP和InDel位点。采用SnpEff软件预测变异位点发生的基因组区域及变异产生的影响。通过相关生物信息学软件分别将SNP和InDel位点所在基因分别比对GO和KEGG数据库,获得相应的功能和通路注释。【结果】共鉴定到28195个SNP位点,其中发生转换和颠换的SNP位点分别有21403和6792个;上述SNP位点的突变类型有12种,其中最丰富的突变类型为C/T;分布在CDS区的SNP位点最多,其次是基因间区、上游区、下游区和内含子区;最丰富的密码子突变类型是同义突变;SNP位点所在基因可注释到代谢进程、细胞组分和催化活性等43个GO条目以及代谢途径、核糖体和等次生代谢产物的生物合成等85条KEGG通路。共鉴定到2831个InDel位点,其中分布在基因间区InDel位点最多,分布在CDS区的InDel位点最少;最丰富的密码子突变类型是移码突变;InDel位点所在基因可注释到细胞进程、细胞和结合等38个GO条目以及代谢途径、次生代谢产物的生物合成及核糖体等73条KEGG通路。【结论】东方蜜蜂微孢子虫中存在大量的SNP和InDel位点,SNP位点的突变类型主要为转换,与其他物种类似;SNP与InDel位点的基因组功能元件分布规律和突变类型具有明显差异;SNP和InDel位点所在基因与东方蜜蜂微孢子虫适应宿主细胞内环境及病原增殖过程具有潜在关系。     

人锰超氧化物歧化酶基因剪接异构体的表达分析

对人锰超氧化物歧化酶(human manganese superoxide dismutase,hMn-SOD)基因剪接异构体进行分析,并检测异构体的表达情况。在GenBank库中检索人锰超氧化物歧化酶基因异构体及编码基因组序列,利用Vector NTI9生物软件进行核酸及蛋白序列比对;利用RT-PCR方法分析锰超氧化物歧化酶基因异构体的表达。结果显示,在GenBank库检索发现有3种人锰超氧化物歧化酶基因异构体,剪接异构的类型为可变的5′剪接位点和外显子盒,各异构体基因内含子均符合"GT-AG"规则。3种基因异构体编码两种异构体蛋白,即222个氨基酸的人锰超氧化物歧化酶蛋白以及中部缺少39个氨基酸的截短型异构蛋白。RT-PCR检测结果表明,剪接异构体hMn-SODb在HEK293T和HSC细胞中的表达比在HepG2细胞中高,未见异构体hMn-SODc的表达。     

真菌基因可变剪接可视化分析的新方法:ZOOM软件的应用扩展（英文）

可变剪接是引起蛋白多样性的主要机制之一,而转录组reads的重新定位是获取可变剪接位点的有效方法,适合在基因组较小的真菌中应用。ZOOM软件是一款可在window系统下运行的reads可视化定位软件,被广泛用于下一代基因组测序(NGS)的reads定位及单碱基多态性位点(SNP)的发掘。本文发现该软件分析可变剪接的新用途,并以禾谷镰刀菌Fusarium graminearum的4个基因为例详细描述该方法在真菌可变剪接位点识别中的应用,这些结果均获得RT-PCR的验证。     

阿霉素诱导下的肝癌细胞HepG2中微小RNA差异表达分析

旨在研究阿霉素诱导引起的DNA损伤压力下,肝癌细胞Hep G2中参与DNA损伤应答的mi RNA,并分析这些mi RNA靶基因参与肝癌DNA损伤应答相关的生物学进程与通路。通过小RNA测序检测阿霉素处理肝癌细胞Hep G2前后mi RNA的差异表达情况,使用GO与KEGG通路富集方法对差异表达mi RNA靶基因进行功能富集分析。结果显示,共检测出显著表达差异mi RNA 68个,其中上调13个,下调55个。mi RNA靶基因的功能分析结果显示,53条mi RNAs靶基因显著富集于调控细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移和细胞周期等与DNA损伤应答以及肿瘤相关的生物进程和信号通路,包括p53信号通路、癌症通路、Wnt信号通路和MAPK信号通路等。研究表明,在阿霉素诱导下,Hep G2中的差异表达mi RNAs与DNA损伤相关的肿瘤生物学进程以及信号通路显著相关,预示这些mi RNAs在阿霉素引发的肝细胞癌DNA损伤应答中起着重要的作用。     

肝癌中增强子调控miRNA前馈环路的识别与功能分析

先前研究表明前馈环路(Feed-forward loops,FFLs)作为重要的网络单元在肿瘤疾病的发生发展中起着重要作用。microRNA(miRNA)、增强子、转录因子三类调控元件已被文献证实与肝肿瘤密切相关,然而三者形成何种FFL以及在肝癌中的特征目前并不清楚。基于肝癌细胞HepG2的DNase高敏位点以及H3K4me1、H3K27ac、H3K4me3三类组蛋白修饰信息的ChIP-seq数据识别了5 055个肝癌特异的增强子。此外,基于超几何检验及元件调控关系识别了2 070个TF-enhancer-miRNA FFL并对其中miRNA的靶基因进行了GO与KEGG功能富集分析。富集结果显示FFL中miRNA的靶基因显著富集于肿瘤或肝癌相关信号通路与生物进程。其中hsa-miR-574参与了99个FFL且在HepG2细胞中高表达,显著富集于已知的与抑制肝癌细胞增殖相关的cAMP信号通路。初步探讨了以增强子-miRNA为核心的FFL在肝细胞癌中的特征与功能,有望为基于网络模体为单位的肝肿瘤标志物识别奠定理论与数据基础。     

中华猕猴桃基因组可变剪接事件鉴定及分析

可变剪接使一个基因能产生多种m RNA成熟体,极大地增加蛋白多样性.采用中华猕猴桃基因组数据做参考数据,利用中华猕猴桃叶片和果实3个不同发育时期(未成熟、半成熟和成熟期)的转录组数据,从中华猕猴桃基因组(39040个基因)中共鉴定出11651个基因(占总基因数的29%)对应的32180个可变剪接事件.在可变剪接不同类型中,内含子保留类型的发生频率最高,占50%以上;3′可变位点类型频率约为5′端可变类型的2倍.GO富集分析结果表明,可变剪接的基因主要富集于酶调控及核苷酸结合相关功能的GO类别中,而组织特有可变剪接基因功能富集热点与组织的重要功能关联,叶片多为肌动蛋白及微管相关;未成熟果实与双组分信号系统相关;半成熟果实多与磷脂合成过程相关;成熟果实多与信号传递过程相关.另外,55.6%的维生素合成相关基因发生可变剪接事件,显著高于基因组水平的29.6%,暗示着可变剪接参与维生素合成相关基因代谢过程中的重要作用.通过对中华猕猴桃全基因组可变剪接的分析,为解析中华猕猴桃基因组及进一步开展相关分子育种工作提供依据.     

肝癌细胞HepG2中p53调控miRNA-3661的生物信息分析与功能验证

对已在前期实验中通过Dox诱导肝癌细胞HepG2 DNA损伤发现的受p53调控的hsa-miR-3661进行生物信息学分析,并通过分子生物学实验对其功能进行了验证,为miR-3661在肝肿瘤中的调控机制的研究提供理论基础。获取miR-3661结构与序列信息;预测靶基因,使用DAVID进行miRNA靶基因功能富集分析;分析miR-3661的p53结合位点,通过基因间的相互作用构建调控网络;进行细胞增殖实验验证miR-3661抑制肿瘤功能。结果表明,miR-3661序列保守,启动子区存在p53结合位点,暗示p53与hsa-miR-3661存在直接调控;预测靶基因1 009个,369个显著富集于细胞周期调控、细胞增殖、细胞凋亡等肿瘤相关生物学过程(P0.05),主要参与了癌症信号通路、MAPK信号通路与Erb B信号通路(P0.05);通过268组基因间的相互作用数据构建了p53、hsa-miR-3661和靶基因的调控网络,从系统生物学角度分析了参与多个肿瘤生物进程的关键靶基因;在实验中证实过表达miR-3661可以显著抑制肝癌细胞HepG2的增殖过程(P-value=0.001 46)。miR-3661受p53直接调控,其靶基因显著富集于多种肿瘤相关生物进程与信号通路,过表达miR-3661可显著抑制肝癌细胞增殖。     

细胞信号转导与可变剪接调控

大多数真核基因能够发生可变剪接,其调控对于生理和病理状态下细胞功能的实现至关重要,而异常可变剪接则可导致多种疾病。虽然已知可变剪接能够在转录后水平调节基因表达,然而目前仍不清楚特定的可变剪接模式是如何被调控的。越来越多的研究发现细胞信号和外界环境刺激能够调控靶基因的剪接模式,并且已发现一些与可变剪接调控有关的信号转导通路,而后者能够通过修饰剪接因子进而改变剪接因子的亚细胞定位或者活性,从而实现对靶基因可变剪接模式的调控。由细胞信号转导通路所构成的网络能够灵活多样地调控基因剪接,一条信号通路可调控多个基因剪接,而多条信号通路也可调控同一基因剪接,对于理解信号转导过程的分子机制具有重要意义。     

中华蜜蜂的单核苷酸多态性和插入缺失突变位点鉴定

【目的】本研究拟利用已获得的中华蜜蜂Apis cerana cerana幼虫肠道的转录组数据对单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNP）和插入缺失（Insertion-Deletion,InDel）突变位点进行挖掘和分析,旨在丰富中华蜜蜂的SNP和InDel信息,并为新型分子标记的开发提供基础。【方法】根据有效读段与东方蜜蜂Apis cerana参考基因组的比对情况,采用GATK软件识别单碱基错配和碱基的插入缺失情况,再利用ANNOVAR软件对SNP位点和InDel位点进行分析。通过相关生物信息学软件将SNP和InDel位点所在基因分别比对GO和KEGG数据库,以获得相应的功能和通路注释。【结果】共鉴定到中华蜜蜂的58 919个SNP位点,包括24 548个纯合位点和34 371个杂合位点;发生转换和颠换的SNP位点分别有49102和9817个;数量最多和最少的突变类型分别是C/T和T/G;分布在外显子区的SNP位点数量最多,达到22 649个;此外,发生同义突变的SNP位点数量最多,其次是非同义突变;SNP位点所在基因可注释到46个GO条目和121条KEGG通路。共鉴定到6 551个InDel位点,包括3 270个插入突变和3 281个缺失突变;分布在内含子区InDel位点最多,共计2 793个;发生移码插入的InDel位点最多;进一步分析结果显示InDel位点所在基因可注释到27个GO条目和28条KEGG通路。【结论】本研究鉴定到中华蜜蜂的大量SNP位点和InDel位点,解析了SNP和InDel位点的突变类型、基因组功能元件分布和密码子突变类型,并揭示SNP和InDel位点对中华蜜蜂的重要生物学过程具有潜在影响。     

嗜热四膜虫可变剪接基因鉴定及功能分析

可变剪接是产生蛋白质组多样性和调节基因表达的重要机制,相关研究在高等真核生物中开展较多,而在单细胞真核生物中则较少,尤其是单细胞原生动物纤毛虫中,仅有少量报道。本文基于单细胞模式原生动物嗜热四膜虫种大量转录组数据,对其可变剪接基因进行了鉴定及分析。在嗜热四膜虫中共鉴定到2 894个可变剪接位点,涉及到2 698个可变剪接基因,可分为四类。考虑到转录本拼接的准确性,选择了其中464个与基因组预测模型完全一致的可变剪接基因进行深入分析,其中生长(growth)时期、饥饿(starvation)时期、接合生殖(conjugation)时期特异性的可变剪接基因分别为49个、79个和135个。对可变剪接基因的功能进行分析表明其涉及的功能广泛且显著富集于蛋白激酶过程,提示可变剪接基因在嗜热四膜虫蛋白磷酸化和信号传导中具有重要作用。     

基于SNP共表达网络肝癌分子分型及预后分析

基于SNP突变数据与mRNA表达谱关联分析,构建一种肝癌分子分型方法并对比不同分型预后的差异,并对不同分型肝癌的发生发展机制进一步研究。首先通过TCGA数据库收集359例肝细胞癌患者的SNP突变数据和mRNA表达数据,采用Wilcoxon秩和检验,筛选突变后差异表达基因,并通过生物信息学工具String和Cytoscape构建差异表达基因的蛋白互作网络,筛选连接度最高的10个Hub基因。利用Consensus Cluster Plus软件包,基于Hub基因mRNA表达水平构建NMF分子分型模型,再结合生存数据评估各分型患者的预后。最后利用加权基因共表达网络分析(WGCNA),识别与肝癌分子分型相关的模块,并针对关键模块的基因进行通路富集,从而对不同分型肝癌的基因表达谱进行比较。结果：NMF模型将肝癌分为高危、低危2个分型,其中CDKN2A和FOXO1基因对分型贡献度高。生存分析显示低危组患者的生存情况显著优于高危组,高危组富集多个与肿瘤细胞侵蚀、转移、复发过程相关的信号通路,低危组则与细胞周期和胰液分泌相关。本研究在无先验性信息的前提下,基于突变后显著差异表达的Hub基因表达水平构建的...     

鉴定9个新的RHD基因mRNA可变剪接体

为了研究各种RHD基因mRNA可变剪接体的基因结构, 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测正常人脐血样本RHD mRNA, 对RHD cDNA进行TA克隆和序列分析, 对各可变剪接体的剪接位点进行DNA序列分析, 并将RHD mRNA进行表达序列标签(ESTs)分析。结果在28个阳性克隆中, 除全长RHD cDNA外, 共检测到12种(包括9种新的)RHD可变剪接体, 发现外显子遗漏、5′和3′剪接位点变异3种剪接形式, 涉及外显子2~9, 其中6种新的剪接体同时存在RHD和RHCE基因同源杂交现象。ESTs分析还检索到内含子保留形式的剪接体。研究表明, RHD基因mRNA存在复杂的可变剪接机制, 除已报道的剪接体外, 检测到9种新的RHD可变剪接体, 并发现了可变剪接和同源杂交并存现象。     

拟南芥不同组织基因表达及可变剪接差异分析

可变剪接是转录后重要的基因表达调控方式,也是转录组和蛋白质组多样性的重要来源. 近年来随着拟南芥、水稻、玉米等植物转录组测序的完成,研究人员发现植物pre-mRNA可变剪接的发生与组织分化、发育等生物学过程密切相关. 本工作基于GEO数据库的RNA-seq数据,使用高通量测序数据分析常用的Trimmomatic、Salmon、DESeq2、SUPPA2等工具,识别了拟南芥的种子、根、叶、花、花梗、节间、长角果共7种组织的表达基因和可变剪接事件,以及7种组织间的差异表达基因和差异可变剪接事件,并以叶和花为例展示了相应的生物学功能分析. 该工作系统地研究了拟南芥基因表达和可变剪接发生的组织特异性,有助于进一步阐明植物基因组的基因表达调控机制.     

基于深度卷积神经网络识别可变剪接位点

可变剪接源于多外显子基因生成多个转录本的调控过程。随着高通量测序,尤其是RNA-seq的研究进展,剪接序列和剪接位点可以通过挖掘海量的测序数据进行预测。可变剪接现象拓宽了人们对基因结构和蛋白质亚型的知识。然而现有的短序列比对软件受到随机性比对的影响,产生很多假阳性剪接位点,干扰下游数据分析。本研究发现,可变剪接位点周边序列的结构特征可被深度学习模型提取,并利用深度卷积神经网络识别剪接位点。本研究的模型具有识别率高、计算速度快,模型泛化能力强、鲁棒性高等优势。     

基于加权网络的卵巢癌可变剪接预后特征分析

可变剪接作为转录调节的调控机制,对肿瘤的治疗和预后具有重要意义。本文对卵巢癌预后相关的可变剪接事件进行了系统分析,以挖掘可变剪接在卵巢癌中的预后价值。首先,从TCGASpliceSeq数据库中下载卵巢癌患者数据,运用单因素Cox回归分析筛选得到290个与预后相关的剪接事件(prognostic-associated alternative splicing events, PASEs);其次,融合PASEs对应基因的蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)数据构建卵巢癌预后加权网络,同时对网络进行拓扑分析,对PASEs对应基因进行功能富集分析;最后,根据网络中节点的度选出前20个可变剪接事件作为预后特征,利用Cox比例风险模型建立卵巢癌预后预测模型。结果显示,这些可变剪接事件作为预后特征可以较好地预测卵巢癌患者的预后情况,可作为潜在的卵巢癌预后生物标志物。     

靶向FoxM1 多肽P201对人肝癌HepG2 细胞的杀伤作用及关键氨基酸分析

目的:初步探究靶向FoxM1多肽P201对人肝癌细胞的杀伤作用、死亡途径以及寻找多肽序列中关键的氨基酸残基。方法:本研究选取人肝癌HepG2细胞为主要研究对象,采用MTT法、AO-EB双染和流式细胞术检测P201多肽对HepG2细胞的杀伤作用和死亡途径,结合模体序列捜索、反义肽氨基酸、虚拟丙氨酸突变和分子对接等方法:确定P201多肽的关键氨基酸。结果:MTT法检测60.0μg/mL P201多肽对HepG2细胞作用48 h抑制率高达96%,形态观察和定量测定显示细胞早期凋亡的发生与P201多肽作用时间和剂量呈一定依赖关系;共确定5个氨基酸(第1、2、4、7、9位残基)为P201多肽的关键氨基酸残基。结论:初步揭示P201多肽对HepG2细胞的强杀伤作用与细胞凋亡相关并确定关键氨基酸为多肽分子的优化和多肽抗癌靶向药物的进一步研发提供了重要的依据与参考。