莱茵衣藻Nfr-4突变株中类胡萝卜素含量的变化及其对藻生长的影响

文章对相同条件下培养的莱茵衣藻野生型CC-137和八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)基因突变株Nfr-4的生长进行分析;并用反相高效液相色谱分析总有色类胡萝卜素以及叶绿素含量变化,结果表明两者生长的差异明显;Nfr-4突变株的单细胞叶绿素和总有色类胡萝卜素含量高于野生型CC-137的。     

Cr6+胁迫对莱茵衣藻光合作用的影响

以莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)为研究材料,采用氧电极和快速叶绿素a荧光诱导动力学方法研究了不同浓度和时间Cr6+处理对其光合作用的影响.结果表明:当Cr6+浓度大于40 μmol/L时,莱茵衣藻细胞数逐渐下降,而藻细胞变大;表观光合速率成为负值,呼吸作用随Cr6+处理浓度的增加先上升后下降至对照水平;莱茵衣藻有活性放氧复合体比例随Cr6+处理浓度的增加逐渐降低,80 μmol/L Cr6+处理3 d时已下降至13.72%;光合驱动力(DFABS)随Cr6+浓度增加逐步下降,并以DFφPo在DFABS的下降中的贡献最大.研究发现,重金属Cr6+胁迫显著影响莱茵衣藻的光合作用,而对呼吸作用则影响较小;Cr6+主要通过损伤供体侧的放氧复合体以及阻断QA至QB的电子传递而抑制光系统Ⅱ的功能;莱茵衣藻光系统Ⅱ对Cr6+处理比较敏感且存在着多个作用位点,并首先影响反应中心光能捕获效率,其次影响反应中心的活性,最后影响QA-之后的电子传递.     

Cd2+对紫球藻生长及光化学活性的影响

以紫球藻(Porphyridium purpureum)为供试材料, 研究了5个不同浓度的Cd2+对紫球藻的细胞密度、叶绿素a含量、藻红蛋白含量及ATP含量的影响, 以及对紫球藻的最大光量子产额(F_v/F_m)、实际光量子产额(YII)、相对电子传递效率(ETR)及非光化学淬灭(NPQ)的影响, 探讨了各荧光参数在不同浓度的Cd2+胁迫下的变化规律。研究结果表明, 在Cd2+胁迫的6d内, 紫球藻的生长速度显著下降, 且Cd2+的浓度越高, 生长速度下降越快; Cd2+胁迫显著的减少叶绿素a、藻红蛋白及ATP含量, 且浓度越高, 减少的幅度越大; 在Cd2+浓度低于200 μmol/L时, 紫球藻的叶绿素荧光参数F_v/F_m、YII及ETR呈现先下降后上升的趋势,而且随着胁迫时间的延长, 下降幅度逐步增大; NPQ在低浓度下(<200 μmol/L)呈现显著上升趋势, 高浓度下(>500 μmol/L)呈现显著下降趋势。因此, 水体中浓度超过50 μmol/L的Cd2+就会显著影响紫球藻的生长及光化学活性, 水生环境中不断累积的Cd2+将会对紫球藻的生态平衡产生影响。     

桉树脑和柠檬烯对莱茵衣藻光合特性的影响

为了揭示蓝藻挥发性有机化合物（VOCs）中两种主要萜烯类化合物桉树脑和柠檬烯对其他藻类的化感作用,研究了此两种化合物对莱茵衣藻细胞生长、光合素吸收光谱和光合性能的影响。结果表明,莱茵衣藻在1.6和4 mmol/L桉树脑以及0.4和0.8 mmol/L柠檬烯处理24h后,细胞生长受到明显抑制,与对照相比,细胞密度分别降低了16.7%、50.6%、29.1%和44.4%。同时,1.6和4 mmol/L柠檬烯处理会诱导藻细胞全部死亡。此外,莱茵衣藻光合色素在413、433、457和663 nm处的吸收峰均明显降低,光合色素的各成分发生明显降解,叶黄素甚至在0.8 mmol/L柠檬烯处理下完全降解消失。在桉树脑和柠檬烯处理后,莱茵衣藻从O点到P点的荧光强度均低于对照,并且随处理浓度升高而降低。同时,荧光诱导动力学参数中,φP_o、Ψ_o、φE_o、RC/CS_MS、ABS/CS_M、TR_o/CS_M、ET_o/CS_M和PI_ABS均明显降低,而DI_o/CS_M则明显升高,这表明桉树脑和柠檬烯可抑制莱茵衣藻PSⅡ量子产生和电子传递,并使吸收的光能以热的形式进行耗散。由此可见,桉树脑和柠檬烯可能通过引起其他藻细胞光合色素降解、降低光合性能而发挥化感作用。     

莱茵衣藻基因组文库的构建

以莱菌衣藻CC-849为材料,提取基因组DNA,利用BamHⅠ和BglⅡ对基因组DNA进行酶解,获得了可用于构建基因组文库的6-12 kb的基因组片段,并浓缩至200 ng/μL。该片段与λDNA载体连接,经噬菌体蛋白包装、侵染大肠杆菌XL1-blue后,获得了莱菌衣藻基因组文库。该文库的滴度为2.12×10~5 pfu/mL,共有转化子4.26×10~4个,插入片段的平均长度约为9kb,扩增后基因组文库滴度为9.5×10~6 pfu/mL。     

茉莉酸对莱茵衣藻代谢降解杀菌剂三氯生的影响机制

三氯生是一种广谱抗菌剂,广泛应用于日用化学品之中。长期以来,三氯生随生活污水排放至水环境中,对动植物产生毒性作用,进一步通过食物链对人类健康产生威胁。开发高效绿色的三氯生降解方法具有重要的现实意义。微藻作为重要的水环境分解者,参与水体中外源化学物的代谢降解。茉莉酸是一种常见的植物激素,能诱导高等植物对环境胁迫的抗逆性,但其对微藻类低等植物防御体系的影响还未见报道。因此,本文中,笔者考察了不同浓度茉莉酸处理对莱茵衣藻应答三氯生胁迫作用及对三氯生代谢的影响。结果发现,0. 05、0. 15和0. 45μmol/L茉莉酸处理不同程度缓解了三氯生对莱茵衣藻的氧化胁迫,但高浓度茉莉酸(0. 45μmol/L)会抑制莱茵衣藻的生长。与三氯生单独处理的莱茵衣藻样本相比,0. 15μmol/L茉莉酸处理显著提高了谷胱甘肽S-转移酶和多酚氧化酶活力,降低了体内过氧化物酶活力。此外,茉莉酸处理莱茵衣藻体内三氯生积累量显著小于未处理组,而培养液中三氯生残留量无显著差异,说明茉莉酸促进了衣藻对三氯生的代谢降解。进一步通过高分辨质谱鉴定了6种三氯生在莱茵衣藻体内的代谢产物,其中有4种只在茉莉酸处理组中检出,说明在茉莉酸处理下莱茵衣藻代谢三氯生的方式更加多样化,降解效率更高。     

利用Imaging-PAM研究莱茵衣藻对环境变化的响应

本文介绍了Imaging—PAM—M—Series调制叶绿素荧光成像技术在莱茵衣藻活体叶绿素荧光检测中的应用。该方法利用CCD对藻体直接成像,可同时检测多个样品。后期分析可获得图像中任意区域的初始荧光产量（R）、充分暗适应后PSII的最大光化学效率（眠）、PSⅡ光化学能量转化的有效量子产量【Y（Ⅱ）】、光化学淬灭系数（qp）、非光化学淬灭系数（NPQ）等指标。文章以敌草隆[3-（3,4-dichlorophenyl）-1,1-dimethylurea,DCMU]和没食子酸丙酯（propyl gallate,PG）对莱茵衣藻野生型及其抗DCMU突变体的影响为例,说明该技术在莱茵衣藻研究中是可靠的,具有简单、快速、灵敏等特点。     

小球藻和莱茵衣藻原生质体的电转化研究

以小球藻及莱茵衣藻原生质体为受体细胞,利用电击法将质粒p CAMBIA1301转入小球藻和莱茵衣藻,摸索电击转化条件并进行分子检测。结果表明:两类藻都对潮霉素敏感,小球藻及莱茵衣藻分别在含25 mg/L和100 mg/L潮霉素的固体培养基上的生长被完全抑制;小球藻和莱茵衣藻原生质体电击转化的最佳电击场强分别为0.8 k V/cm和0.6 k V/cm,最佳脉冲时间均为10 ms;制备原生质体和通过2-脱氧-D-葡萄糖处理可明显提高转化效率;分子检测说明GUS报告基因成功转入两种藻并可稳定遗传。     

4株沙漠小球藻对几种常用抗生素的敏感性研究

目的:对分离自新疆沙漠的4株小球藻GTD8A1、GTD4A-1、GTD7C-2和TLD6B进行几种常用基因工程抗生素的敏感性研究,以期筛选出沙漠小球藻基因工程中选择标记的抗生素。方法:运用藻株在液体培养过程中藻体颜色变化和血球板细胞计数的方法,系统性研究沙漠小球藻对几种常用基因工程抗生素的敏感性。结果:4株沙漠小球藻对卡那霉素和链霉素都非常敏感,敏感浓度(细胞致死浓度,下同)均为25μg/m L;对氯霉素也很敏感,GTD8A1、GTD7C-2和TLD6B的敏感浓度也均为25μg/m L,GTD4A-1的敏感浓度为100μg/m L;4株沙漠小球藻对氨苄西林和头孢霉素的敏感性都不是很明显,在一定的浓度范围,氨苄西林和头孢霉素对藻细胞的生长还具有促进作用,当氨苄西林和头孢霉素的浓度很高时才表现出一定的抑制作用。结论:卡那霉素和链霉素可作为沙漠小球藻基因工程选择标记中的2种抗生素,为今后建立其遗传转化系统奠定了基础。     

4种市售抗生素对发酵床垫料中益生微生物生长的影响

目的研究不同剂量土霉素、盐酸环丙沙星、克拉霉素、乙酰甲喹对垫料中益生微生物生长的影响。方法以饲料中抗生素添加量、抗生素在动物体内转化率为依据,观察0.1×国标、1×国标和10×国标对应的抗生素残留对垫料中主要益生微生物生长的影响。结果与空白组相比,0.1×国标的土霉素和克拉霉素残留对3种益生微生物影响小,盐酸环丙沙星和乙酰甲喹残留使枯草芽胞杆菌和酵母菌数量不可检测;1×国标量的土霉素残留对3种益生微生物影响较小,而盐酸环丙沙星、克拉霉素、乙酰甲喹残留造成了益生微生物的不可检测;除植物乳杆菌在10×国标的土霉素残留中生长变化小外,所有检测菌在该浓度其他抗生素残留中均不可检测。结论土霉素、盐酸环丙沙星、克拉霉素、乙酰甲喹残留对垫料中主要益生微生物生长均有不同程度的影响。     

莱茵衣藻BBS1基因RNAi载体的构建及应用

巴德-毕氏综合症(Bardet-Biedl syndrome,BBS)是一种由多种基因突变造成、与原生纤毛功能缺失相关的疾病,包含12种致病基因,分别为BBS1-12。旨在通过对衣藻BBS1基因进行RNAi干扰来研究其在衣藻中的功能。首先搭建衣藻快捷简单的RNAi骨架载体;再用RT-PCR克隆莱茵衣藻BBS1基因的一段c DNA序列于中间载体p EASY-T1上;测序后通过两次酶切连接到RNAi骨架载体上,经菌液PCR、酶切和测序验证,成功构建BBS1基因的RNAi干涉载体。经基因枪介导法转化莱茵衣藻CC503,转基因衣藻具有明显不同于对照的表现型,趋光性发生了改变。     

串联抗菌肽Cecropin B基因在莱茵衣藻中的表达及其抗菌活性分析

为了应对各种抗生素在水产养殖业所带来的副作用,我们在本文中尝试利用微藻对一种抗菌肽进行表达的可行性研究．根据莱茵衣藻核基因组偏爱密码子对抗菌肽Cecropin B基因进行改造,并将4个经改造的Cecropin B基因依次串联起来,中间加上莱茵衣藻的自剪切连接肽序列LWMRFA,人工合成总长度为522 bp的串联Cecropin B基因．将串联Cecropin B基因克隆到含hsp70-RBCS2启动子和RBCS2终止子的pH105载体上,再与携带ble筛选基因的表达框架连接,构建重组表达载体pCB124．采用玻璃珠转化法将载体pCB124导入莱茵衣藻cc-849中,筛选得到能表达抗菌肽Cecropin B的转基因衣藻．经过6个月的保持培养后,进一步对转基因藻细胞提取液进行抗菌活性分析,发现转基因藻具有明显的抑制革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌和溶壁微球菌)生长的特征．这一结果为具有抗菌活性的饵料藻的生产和应用提供了新的途径．     

谷氨酸废液培养莱茵衣藻的产氢研究

通过在一般培养基中添加尿素、谷氨酸、葡萄糖等有机物,考察了菜茵衣藻混合营养培养的产氢效果。结果表明,含尿素混合营养培养菜茵衣藻产氢是含铵氮的培养基培养的6倍,无硫含尿素的混合营养培养具有最佳的产氢效果,是有硫含铵氮的培养基的10倍。谷氨酸及葡萄糖的添加对其生长和产氢也有促进作用,对菜茵衣藻生长和产氢促进作用的尿素的最佳添加量为0．25g/L,谷氨酸的最佳添加量为0．7g/L,葡萄糖的添加量为0．2g/L。     

农杆菌介导转化莱茵衣藻体系的优化

[目的]为建立根癌农杆菌介导的莱茵衣藻快速简便高效的遗传转化体系,本研究以模式生物莱茵衣藻为受体材料,从转化方法和转化子快速鉴定两个方面进行了优化.[方法]比较了固体培养基共培养转化方法和液体培养基共培养转化方法对根癌农杆菌LBA 4404介导的莱茵衣藻CC425转化效率的影响;研究并比较了(1)首先经过TE裂解再进行...     

CPI大部分缺失影响莱茵衣藻光能转换特性的研究

用紫外光处理野生型莱菌衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）CC－125得到突变体CC－1047。电泳检测证明：突变型衣藻CC－1047缺失了绝大部分色素蛋白复合体I（CPI）。进而详细地研究了CPI的部分缺失对突变型衣藻的光物理和光化学反应的影响。野生型衣藻的低温荧光峰有两个,分别在691nm和717nm左右;突变型CC－1047的低温荧光峰只有一个,在709nm左右,且荧光强度增加了3－4倍。709nm的峰被认为是光系统I捕光天线色素所发出的。在突变体中出现的这个峰,说明天线色素吸收的光能未能传递到光系统I的反应中心,再进行电荷分离;而是以荧光的形式也发生了改变,野生型和突变型的荧光在开启作用光后都很快上升,但随后野生型的逐渐下降,而突变型CC－1047的基本上不下降;与野生型相比,突变型衣藻CC－1047的光系统I反应中心色系P700的氧化还原活性降低80％以上,表明突变型衣藻细胞内与PSI相关的电子传递已不能正常运转。     

莱茵衣藻LZTFL1蛋白的多克隆抗体制备及应用

目的:亮氨酸拉链转录因子1(LZTFL1)是一种与纤毛信号转导相关的蛋白质,关于其如何在信号转导中发挥作用以及作用机制目前尚不清楚。莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是研究纤毛信号传导的模式生物,而目前对莱茵衣藻LZTFL1蛋白的研究甚少,尚未有相应的检测抗体,因此制备LZTFL1多克隆抗体用于后续实验研究。方法:采用RT-PCR技术从C.reinhardtii CC125中提取总RNA,扩增981bp的目的基因Lztfl1,插入到p ET-28a(+)原核表达载体,成功构建p ET-28a(+)-Lztfl1重组质粒,转入E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导后成功表达6×His-LZTFL1融合蛋白,融合蛋白经亲和纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,最后采用间接ELISA法测得抗血清效价达到1∶512 000,经Western blot对C.reinhardtii CC125检测具有较高特异性。结果:首次实现了莱茵衣藻LZTFL1蛋白的原核表达,制备出一支兔抗莱茵衣藻LZTFL1蛋白的多克隆抗体,为后续研究LZTFL1蛋白在莱茵衣藻中的结构功能及在纤毛信号转导中的相互作用奠定了基础。     

莱茵衣藻LZTFL1蛋白的多克隆抗体制备及应用

目的:亮氨酸拉链转录因子1(LZTFL1)是一种与纤毛信号转导相关的蛋白质,关于其如何在信号转导中发挥作用以及作用机制目前尚不清楚。莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是研究纤毛信号传导的模式生物,而目前对莱茵衣藻LZTFL1蛋白的研究甚少,尚未有相应的检测抗体,因此制备LZTFL1多克隆抗体用于后续实验研究。方法:采用RT-PCR技术从C.reinhardtii CC125中提取总RNA,扩增981bp的目的基因Lztfl1,插入到p ET-28a(+)原核表达载体,成功构建p ET-28a(+)-Lztfl1重组质粒,转入E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导后成功表达6×His-LZTFL1融合蛋白,融合蛋白经亲和纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,最后采用间接ELISA法测得抗血清效价达到1∶512 000,经Western blot对C.reinhardtii CC125检测具有较高特异性。结果:首次实现了莱茵衣藻LZTFL1蛋白的原核表达,制备出一支兔抗莱茵衣藻LZTFL1蛋白的多克隆抗体,为后续研究LZTFL1蛋白在莱茵衣藻中的结构功能及在纤毛信号转导中的相互作用奠定了基础。     

高浓度CO2对莱茵衣藻光系统Ⅱ能量流和能量利用效率的影响

研究了短期内高浓度CO2培养下莱茵衣藻光系统Ⅱ行为的变化,结果表明高浓度CO2培养导致叶绿素a、b和类胡萝卜素含量明显增加,同时随培养时间的延长叶绿素a荧光动力学(快相)曲线中O、J、I、P期的荧光强度明显增加。与空气培养的细胞相比,高浓度CO2在J期的相对可变荧光均维持在较高水平;单位反应中心复合体吸收的能量在高浓度CO2培养6小时后有明显的增加,但单位反应中心捕获和用于电子传递的能量并没有明显地增加。高浓度CO2培养使光系统Ⅱ最大光化学效率、传递的电子能引起的光化学反应效率和电子传递的量子效率均明显低于通空气培养的细胞。以上结果表明不同CO2浓度培养导致莱茵衣藻叶绿素a荧光动力学快相的变化与其光系统Ⅱ功能的变化密切相关,也可能与HCO-3转运过程中能量需求的变化有关。     

高温对仁用杏光合特性及PSⅡ光化学活性的影响

为探讨高温胁迫下仁用杏叶片的光合适应机制,以科尔沁沙地生长的4年生'超仁'仁用杏为试材,设置环境温度为25℃、30℃、40℃和50℃处理,利用气体交换技术和快速叶绿素荧光诱导动力学曲线分析技术(JIP-test),研究了仁用杏叶片光合特性和PSⅡ光化学活性.结果表明:在一定温度范围内,随着温度升高,仁用杏通过提高光合色素含量和比例来维持光能的吸收、传递和转换能力,从而保证光合机构正常运转;当高温超过叶片自身生理调节限度后,叶绿素发生分解、净光合速率(Pn)明显下降、胞间CO2浓度(Ci)上升,说明光合作用的下降是由叶肉因素造成的.温度40℃导致单位面积有活性反应中心数量(RC/CSo)显著下降;而50℃高温下荧光诱导曲线中K点(Wk)和J点(Vj)明显增加,高温对仁用杏叶片放氧复合体(OEC)、受体侧和PsⅡ反应中心造成了伤害.此外,50℃高温还导致初始荧光(Fo)显著升高,为对照的2.26倍,PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)和光化学性能指数(PI/ABS)分别下降为对照的37.9%和10.3%.高温损害了PSⅡ供体侧和受体侧的功能,造成光合效率下降,这是高温胁迫对仁用杏叶片光合机构伤害的主要机制之一.     

莱茵衣藻缺铁应答基因Femu2p的克隆及原核表达

[目的]克隆莱茵衣藻缺铁应答基因Femu2p,构建重组表达载体p GEX-6p-1-Femu2p,优化条件使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。[方法]提取莱茵衣藻CC425的总RNA后,利用RT-PCR和两次重叠延伸PCR相结合的方法获得Femu2p的全长编码区,构建原核表达载体p GEX-6p-1-Femu2p,并将其转入大肠杆菌DL21(DE3)中,利用IPTG诱导融合蛋白的表达并优化表达条件。[结果]Femu2p的全长编码区为2 904 bp,编码967个氨基酸,理论分子量为100.4 k Da,理论等电点为8.86。序列分析结果显示该蛋白属于包含多个C2H2类型锌指结构域的Ran BP2家族。IPTG诱导融合蛋白表达的最佳条件为:IPTG浓度0.25 mmol/L,诱导温度16℃,诱导时间8 h。[结论]成功克隆了Femu2p基因的全长编码区,并使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。