AM79 EPSPS蛋白的体外模拟胃肠液消化稳定性研究

AM79 EPSPS基因是从草甘膦高度污染的土壤中克隆的、具有我国自主知识产权的一个新型抗草甘膦基因,在转基因玉米中过表达能显著提高转基因玉米的草甘膦抗性,具有重要应用价值。为了评价AM79 EPSPS蛋白的食用安全性,本研究参考中华人民共和国国家标准,开展了AM79 EPSPS蛋白的消化稳定性研究。将AM79 EPSPS基因构建到原核表达载体pET-30a上,在大肠杆菌中表达了分子量为48.3 kD的可溶性AM79 EPSPS蛋白。通过Ni-NTA亲和层析方法纯化了AM79 EPSPS蛋白用于体外模拟胃肠液实验。结果表明,AM79 EPSPS蛋白在模拟胃肠液中均在15 s内即被消化,SDS-PAGE和Western蛋白免疫印迹均未检测到蛋白残留,表明AM79 EPSPS蛋白在模拟胃肠液体系中极易被消化。     

Cry1Ie蛋白的模拟胃肠液消化稳定性及热稳定性分析

Cry1Ie蛋白对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)具有高毒力,cry1Ie基因已经应用于转基因抗虫玉米的种质创制。为评价Cry1Ie蛋白的食用安全性,开展了Cry1Ie蛋白的消化及热稳定性研究。利用实验室已经构建的表达载体,在大肠杆菌中表达了分子量为81 k D的可溶性Cry1Ie蛋白,经过Ni-NTA亲和层析和Superdex-75分子筛层析获得纯度达91%蛋白。模拟消化液实验结果表明,Cry1Ie蛋白在模拟胃肠液中15 s内即被消化,SDS-PAGE未检测到蛋白残留。热稳定性实验中,Cry1Ie蛋白在玉米粉提取液中不稳定,100℃30 min内蛋白基本降解。对样品进行了生物活性测定发现,经模拟胃肠液消化处理和热处理后的Cry1Ie蛋白对亚洲玉米螟无杀虫活性。Cry1Ie蛋白在胃肠液系统中和热处理条件下均不稳定,并丧失了对亚洲玉米螟的杀虫活性。     

CP4-EPSPS转基因棉花植株鉴定方法比较分析

CP4-EPSPS是从土壤农杆菌CP4菌株中分离得到的抗除草剂草甘膦基因,是转基因植物研究中最为常用的一种筛选标记基因。但是在CP4-EPSPS转基因植物后期筛选过程中仅凭简单的草甘膦抗性筛选并不能得到完全准确的鉴定结果,常会出现假阳性或漏选的情况。本研究以抗草甘膦转CP4-EPSPS基因棉花为材料,对PCR扩增、ELISA、CP4-EPSPS蛋白检测试纸条及草甘膦抗性四种转基因阳性植株筛选方法进行比较,从筛选结果的准确性、时效性、易用性及实惠性等不同方面综合分析了各种筛选方法的优缺点,结果表明ELISA、试纸条检测方法的准确性显著高于PCR检测与0.3%浓度草甘膦抗性检测,而试纸条检测操作更加便捷,因此建议将草甘膦抗性与试纸条检测方法结合起来使用。本研究结果为以CP4-EPSPS基因为标记筛选的转基因植物的室内及大田筛选提供实验依据。     

棉铃虫乙醇脱氢酶原核可溶性表达条件的优化北大核心

[目的]提高棉铃虫乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)在大肠杆菌中可溶性蛋白的表达量。[方法]研究了诱导温度和诱导剂IPTG浓度对可溶性His-ADH融合蛋白表达量的影响。设置15℃、20℃、25℃、30℃、37℃五个不同温度和0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L五个不同的IPTG诱导剂浓度分别进行原核诱导表达。基于SDS-PAGE和灰度扫描来评价可溶性融合蛋白的表达水平。[结果]表达的目的融合蛋白相对分子质量约为53 k Da,与预测的分子量大小一致,Western Blot分析表明能与His单克隆抗体特异性结合;可溶性融合蛋白的最佳诱导条件为温度25℃、IPTG浓度0.6 mmol/L。[结论]表达优化最终条件为温度25℃(相对表达量为2.21)、IPTG浓度0.6 mmol/L(相对表达量为1.14)。低温有利于可溶性蛋白的形成,诱导剂IPTG浓度并不是越高越好。     

棉铃虫乙醇脱氢酶原核可溶性表达条件的优化

[目的]提高棉铃虫乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)在大肠杆菌中可溶性蛋白的表达量。[方法]研究了诱导温度和诱导剂IPTG浓度对可溶性His-ADH融合蛋白表达量的影响。设置15℃、20℃、25℃、30℃、37℃五个不同温度和0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L五个不同的IPTG诱导剂浓度分别进行原核诱导表达。基于SDS-PAGE和灰度扫描来评价可溶性融合蛋白的表达水平。[结果]表达的目的融合蛋白相对分子质量约为53 k Da,与预测的分子量大小一致,Western Blot分析表明能与His单克隆抗体特异性结合;可溶性融合蛋白的最佳诱导条件为温度25℃、IPTG浓度0.6 mmol/L。[结论]表达优化最终条件为温度25℃(相对表达量为2.21)、IPTG浓度0.6 mmol/L(相对表达量为1.14)。低温有利于可溶性蛋白的形成,诱导剂IPTG浓度并不是越高越好。     

FGF20原核表达载体构建及在大肠杆菌中优化表达

[目的]构建人FGF20原核表达载体并在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)中优化表达。[方法]从胃癌细胞中经RT-PCR扩增FGF20基因并构建p ET28b-FGF20载体,转化E.coli,IPTG诱导表达。对诱导OD值、IPTG浓度、诱导温度、时间及溶氧量进行优化,同时采用正交试验优化培养基配方,以SDS-PAGE及Western Blot检测蛋白表达,以确定最佳表达条件。[结果]构建了p ET28b-FGF20原核表达载体,实现了FGF20蛋白的表达,确定最佳表达条件为:培养基占锥形瓶容积20%,菌体生长至OD600=0.4,加入终浓度1.0 mmol/L的IPTG,37℃诱导6 h。培养基最佳成分为:蛋白胨11 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠10 g/L、葡萄糖0 g/L。[结论]实现了FGF20在大肠杆菌中的优化表达,为其基因工程药物生产及药用研究奠定了基础。     

小鼠cofilin2蛋白的原核表达及纯化

[目的]构建小鼠cofilin2原核表达载体并纯化表达产物。[方法]以胚胎期小鼠心脏组织的c DNA为模板PCR扩增cofilin2基因,经酶切连接表达载体PGEX-4T-1后转化入大肠杆菌E. coli BL21感受态细胞中,利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达及优化,利用SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝R-250进行染色,检测GST-cofilin2的表达情况。通过谷胱甘肽树脂(Glutathione Resin)亲和层析进行纯化,最后通过Western Blot进行验证。[结果]PCR成功扩增cofilin2基因,双酶切及测序结果表明p GEX-4T-1-cofilin2原核表达载体构建成功,SDS-PAGE鉴定表明,在22℃、200μmol/L的IPTG能诱导出大量可溶性的GST-cofilin2蛋白,分子量为43 k Da。Western Blot验证得到纯化的GST-cofilin2。[结论]成功构建小鼠cofilin2原核表达载体,纯化得到的重组小鼠cofilin2蛋白可用于后续的生物学研究。     

美洲大蠊抗菌肽AMPPA13的表达及纯化

[目的]预测美洲大蠊新的抗菌肽基因,构建原核表达体系并纯化表达产物。[方法]通过生物信息学方法,预测分析出潜在的美洲大蠊抗菌肽。构建pET32a重组质粒,优化诱导表达条件,通过亲和层析,分子筛等手段获得纯化的抗菌肽,并进行Western Blot鉴定。[结果]预测出美洲大蠊新的抗菌肽基因AMPPA13,成功构建重组质粒pET32aAMPPA13。优化诱导表达条件得最佳IPTG浓度为0.1 mmol/L,最佳诱导时间为4 h,最佳诱导温度为37℃。纯化后AMPPA13浓度为268μg/m L。[结论]克隆出美洲大蠊抗菌肽基因,并成功构建原核表达体系,得到1 m L纯化的AMPPA13,经Western Blot鉴定,表达产物正确。     

小鼠Prune蛋白DHH结构域的原核表达及多克隆抗体的制备

[目的]表达、纯化小鼠Prune蛋白DHH结构域(m-Prune D),并制备多克隆抗体。[方法]生物信息学方法分析m-Prune D氨基酸序列;PCR扩增目的基因m-Prune D,克隆入原核表达载体p ET28a(+);IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE和Western Blot鉴定蛋白表达,亲和层析法纯化蛋白;用纯化的重组m-Prune D免疫小鼠制备多克隆抗体;Western Blot检测多克隆抗体特异性。[结果]PCR成功扩增m-Prune D基因,双酶切及测序结果表明成功构建m-Prune D原核表达载体,SDS-PAGE和Western Blot鉴定表明成功表达约25 k Da的重组蛋白。纯化蛋白免疫小鼠后抗体滴度最高可达1∶25 600,所制备的多克隆抗体可特异性识别原核和真核细胞中DHH结构域蛋白。[结论]在E.coli中成功表达小鼠Prune蛋白DHH结构域,制备了多克隆抗体血清,可用于Prune蛋白生物学功能的进一步研究。     

布鲁氏菌VirB5基因的原核表达及生物信息学分析

[目的]获得高效表达并且抗原性较好的VirB5蛋白,并分析其生物信息学功能。[方法]以羊种布鲁氏菌16M基因组为模板扩增VirB5基因,连接表达载体p ET-32a,并转化至大肠杆菌(DE3)中表达,用SDS-PAGE和Western Blot检测其免疫学特性,采用信息生物学方法对VirB5基因编码蛋白的理化性质、结构、保守结构域进行分析。[结果]成功克隆出VirB5基因,并在大肠杆菌中成功表达,SDS-PAGE和Western Blot证实表达重组蛋白对布鲁氏菌阳性血清具有反应原性,生物信息学方法推测VirB5基因可能在胞内运输功能方面发挥重要作用。[结论]成功克隆出717bp大小的VirB5基因,并在大肠杆菌中成功表达45 k Da大小的蛋白,具有良好的抗原性,且证明VirB5蛋白与布鲁氏菌的胞内运输相关。     

牛病毒性腹泻病毒E2抗原表位表达及验证

[目的]获得高效表达的重组牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea virus,BVDV)E2免疫抗原蛋白。[方法]应用软件分析BVDV-E2蛋白抗原表位,将富含抗原表位基因片段连接表达载体p GEX-4T-1,并转化至大肠杆菌(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot检测诱导表达蛋白,经镍柱分离纯化;以纯化蛋白为包被抗原,用间接ELISA检测抗原对免疫血清的反应性。[结果]成功克隆BVDV-E2抗原表位基因,并在大肠杆菌中高效表达,Western Blot和ELISA证实表达重组蛋白对BVDV阳性血清具有反应原性。[结论]获得大小为49.5 k Da的BVDV-E2抗原表位蛋白,并且该抗原稀释度在1:40,抗体稀释度在1:20时结合效果最佳。可用于后续的纳米抗体筛选的研究。     

草甘膦对胰蛋白酶、胃蛋白酶及禽类DNA的影响

随着农药草甘膦的使用增加,其在生物体内的残留引起广泛关注。本实验分别探究不同浓度的草甘膦对生物大分子DNA、胰蛋白酶及胃蛋白酶构象的影响,同时测定喷施不同浓度草甘膦的玉米叶片经模拟胃肠液消化后进入血液后各项血相指标的变化。结果表明:经消化后的草甘膦对鸡血相指标产生了一定影响;紫外分光光度计测定结果表明,3倍标准使用浓度的草甘膦对DNA、胰蛋白酶、胃蛋白酶构象的影响最大。     

猪丹毒丝菌SpaA蛋白的表达与纯化

[目的]在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌spaA基因并纯化重组蛋白。[方法]利用PCR扩增猪丹毒丝菌临床分离株spaA基因,构建重组质粒p GEX-4T-1-spaA,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达融合蛋白GST-SpaA,并优化表达条件。最后采用GST琼脂糖纯化树脂纯化,SDS-PAGE和Western Blotting检测。[结果]成功扩增spaA基因,获得重组表达菌株BL21(DE3)/p GEX-4T-1-spaA;在菌体OD_(600)为0. 9时,加入IPTG至终浓度0. 1 mmol/L,34℃诱导6 h的条件下表达效果最好。经SDS-PAGE检测和纯化后得到大小为97 kDa的GST-SpaA; Western Blotting检测结果表明,GST-SpaA具有良好的免疫原性。[结论]成功在大肠杆菌中表达了SpaA蛋白,经纯化得到具有免疫原性的重组蛋白,为后续研制猪丹毒丝菌SpaA蛋白亚单位疫苗奠定基础。     

非洲猪瘟病毒CP204L基因的原核表达与单抗制备

由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的非洲猪瘟(ASF)给我国养猪业带来了不可估量的经济损失,严重阻碍了我国养猪业的发展,研发ASFV快速诊断试剂是目前最重要的内容之一。CP204L基因编码ASFV结构蛋白p30。本研究以克隆ASFV的CP204L基因为基础,通过基因重组技术,加入His标签,将构建的重组质粒命名为pET-28a-CP204L。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,37℃经1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达6h,表达蛋白进行SDS-PAGE鉴定和Western Blot检测。重组蛋白纯化后免疫小鼠制备筛选单克隆抗体,Western Blot和IFA验证单抗的结合特异性。结果表明,重组的pET-28a-CP204L诱导后表达蛋白为30kD,以不可溶性包涵体形式存在;表达蛋白利用His标签进行纯化,获得纯化蛋白2mg,单克隆抗体筛选获得5株IgG亚型的ASFV p30蛋白的单抗,且均具有良好的结合活性。本研究为发展ASFV检测方法提供了基础。     

转基因抗草甘膦油菜的检测方法

目的:建立检测田间转基因抗草甘膦油菜的方法。方法:用CTAB法提取DNA,经PCR分别扩增内参基因BnACCg8,及抗草甘膦外源基因CP4-EPSPS、FMV 35S启动子和E9 3’终止子等4种基因的片段,以琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析比对。结果:抗草甘膦油菜中分别扩增出与外源基因FMV 35S启动子、E9 3’终止子和CP4-EPSPS大小一致的片段。结论:该方法能有效地用于转基因抗草甘膦油菜的检测。     

C2株贾第虫醛糖还原酶的原核表达与生物信息学分析

[目的]克隆、原核表达、纯化C2株蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,简称贾第虫)醛糖还原酶(Aldose reductase,AR)基因,并进行生物信息学分析。[方法]从C2株贾第虫基因组DNA中克隆贾第虫AR编码区,双酶切连入原核表达载体pET-28a(+),酶切和测序进行验证,并进行生物信息学分析;将构建成功的重组质粒pET-28a(+)-AR转化大肠杆菌Rosetta(DE3)并进行诱导表达,SDS-PAGE及Western Blot验证表达效果;镍亲和层析纯化AR蛋白,SDS-PAGE观察纯化效果。[结果]成功克隆了C2株贾第虫AR蛋白编码区并构建了原核表达载体,SDS-PAGE及Western Blot显示,AR表达载体转化的大肠杆菌经诱导可表达出相对分子量约37.2k Da的目的蛋白,与预期一致;重组蛋白通过亲和层析获得了高效纯化;生物信息学分析显示贾第虫AR蛋白主要二级结构为无规则卷曲,整体为一个NADPH依赖的氧化还原酶结构域。AR蛋白在真核生物中相当保守,贾第虫AR蛋白在进化上相对独立。[结论]证实了贾第虫AR蛋白的存在并明确了其结构和进化上的特征,为贾第虫AR抗体的制备和功能的研究提供了基础。     

C2株贾第虫醛糖还原酶的原核表达与生物信息学分析北大核心

[目的]克隆、原核表达、纯化C2株蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,简称贾第虫)醛糖还原酶(Aldose reductase,AR)基因,并进行生物信息学分析。[方法]从C2株贾第虫基因组DNA中克隆贾第虫AR编码区,双酶切连入原核表达载体pET-28a(+),酶切和测序进行验证,并进行生物信息学分析;将构建成功的重组质粒pET-28a(+)-AR转化大肠杆菌Rosetta(DE3)并进行诱导表达,SDS-PAGE及Western Blot验证表达效果;镍亲和层析纯化AR蛋白,SDS-PAGE观察纯化效果。[结果]成功克隆了C2株贾第虫AR蛋白编码区并构建了原核表达载体,SDS-PAGE及Western Blot显示,AR表达载体转化的大肠杆菌经诱导可表达出相对分子量约37.2k Da的目的蛋白,与预期一致;重组蛋白通过亲和层析获得了高效纯化;生物信息学分析显示贾第虫AR蛋白主要二级结构为无规则卷曲,整体为一个NADPH依赖的氧化还原酶结构域。AR蛋白在真核生物中相当保守,贾第虫AR蛋白在进化上相对独立。[结论]证实了贾第虫AR蛋白的存在并明确了其结构和进化上的特征,为贾第虫AR抗体的制备和功能的研究提供了基础。     

转录因子LRF蛋白POZ结构域的表达与纯化

[目的]旨在原核表达转录因子LRF的POZ结构域,纯化获得GST-POZ融合蛋白。[方法]以SD大鼠海马组织c DNA为模板,利用PCR扩增带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的LRF基因的POZ结构域,并将其插入到原核表达载体p GEX-4T-1中,将构建成功的p GEX-4T-1-POZ原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导融合蛋白表达,再利用MagneGST particles亲和纯化GST-POZ融合蛋白,最后通过Western Blot鉴定融合蛋白。[结果]p GEX-4T-1-POZ原核表达质粒构建成功;在37℃条件下,浓度为0. 2 mmol/L的IPTG诱导7 h能够使重组蛋白大量表达,经MagneGST particles纯化后的GST-POZ重组蛋白能够被识别LRF的抗体特异性识别。[结论]纯化后的GST–POZ重组蛋白能够用于后续的生物学研究。     

PKM2对乳腺癌细胞有氧糖酵解、增殖和凋亡的影响

[目的]探讨siRNA介导的PKM2基因沉默对乳腺癌细胞中有氧糖酵解、细胞增殖和凋亡产生的影响。[方法]荧光定量PCR检测乳腺癌细胞转染siRNA-PKM2的效率,葡萄糖和乳酸试剂盒及Western Blot检测细胞的糖酵解能力,CCK-8法检测细胞增殖能力,Western Blot检测细胞的凋亡状况。[结果]与对照组相比,转染PKM2的siRNA 48h后,细胞摄取葡萄糖量及乳酸分泌量均明显降低(P0.05),两种与糖酵解相关的蛋白Glut1和PFK-1表达量均降低;细胞增殖速率减慢(P0.05);抗凋亡蛋白bcl-x L蛋白表达降低,促凋亡蛋白caspase-9蛋白表达增多。[结论]siRNA介导的PKM2基因沉默能抑制乳腺癌细胞的有氧糖酵解及增殖能力,并促进细胞凋亡。     

大豆微核心种质对草甘膦的耐受性鉴定

以萌发初期大豆弯曲的子叶节为靶点,利用草甘膦(Roundup)点施鉴定法,分析了221份大豆微核心种质的草甘膦耐受性及其与抗草甘膦转CP4-EPSPS基因大豆AG5601的差异,结果表明,草甘膦对不同大豆种质的抑制程度与点施的草甘膦浓度呈正相关,Roundup稀释浓度为1/1000、1/10000时,草甘膦对大豆生长几乎无影响;Roundup稀释浓度为1/10时,草甘膦显著抑制大豆生长,导致植株死亡;Roundup稀释浓度为1/100时,不同大豆种质对草甘膦耐受性差异显著,并鉴定出对草甘膦具有较好耐受性的种质10份。虽然大豆微核心种质对草甘膦的耐受程度远远低于AG5601,但不同大豆种质对草甘膦耐受性存在显著差异,这为利用转基因和杂交转育技术培育抗草甘膦转基因大豆的受体或轮回亲本的选择提供了理论依据。