人源性天然抗体库的构建及淀粉样蛋白Ab1-42寡聚体单链抗体的筛选和鉴定

本研究旨在利用噬菌体展示技术构建人源性天然抗体库,以可溶性Aβ1-42寡聚体对抗体库进行筛选获得针对低分子量Aβ1-42寡聚体的特异性单链抗体。利用RT-PCR法从10个健康人外周血淋巴细胞中得到全套人抗体VH和VL基因,经过重叠延伸PCR将VH和VL连接得到scFv片段,将scFv片段酶切后克隆至pCANTAB5E噬菌体载体,电转化TG1感受态菌,获得库容为2.5×109单链抗体库。经辅助噬菌体M13K07拯救,以可溶性Aβ1-42寡聚体为抗原,对抗体库进行4轮筛选,ELISA法筛选特异性识别Aβ1-42寡聚体的阳性克隆,将筛选到的阳性克隆B19转化至E.coli HB2151菌,诱导表达可溶性scFv抗体。SDS-PAGE及Western blotting分析结果显示可溶性scFv抗体获得了正确表达,且能够与Aβ1-42三聚体及纤维特异性结合,亲和力(Kd)为9×10-6 mol/L。Aβ1-42寡聚体特异性单链抗体的获得为老年性痴呆(AD)的治疗研究奠定了基础。     

人源性天然抗体库的构建及淀粉样蛋白Aβ1-42寡聚体单链抗体的筛选和鉴定

本研究旨在利用噬菌体展示技术构建人源性天然抗体库,以可溶性Aβ1-42寡聚体对抗体库进行筛选获得针对低分子量Aβ1-42寡聚体的特异性单链抗体.利用RT-PCR法从10个健康人外周血淋巴细胞中得到全套人抗体VH和VL基因,经过重叠延伸PCR将VH和VL连接得到scFv片段,将scFv片段酶切后克隆至pCANTAB5E噬菌体载体,电转化TG1感受态菌,获得库容为2.5×109单链抗体库.经辅助噬菌体M13K07拯救,以可溶性Aβ1-42寡聚体为抗原,对抗体库进行4轮筛选,ELISA法筛选特异性识别Aβ1-42寡聚体的阳性克隆,将筛选到的阳性克隆B19转化至E coliHB2151菌,诱导表达可溶性scFv抗体.SDS-PAGE及Western blotting分析结果显示可溶性scFv抗体获得了正确表达,且能够与Aβ1-42三聚体及纤维特异性结合,亲和力(Kd)为9×10-6 mol/L.Aβ1-42寡聚体特异性单链抗体的获得为老年性痴呆(AD)的治疗研究奠定了基础.     

不同佐剂条件下Aβ多肽B细胞表位疫苗诱导产生抗体的免疫反应特性分析

目的:研究阿尔茨海默病β淀粉样肽(Aβ)B细胞表位疫苗2Aβ1-15-PADRE(Aβ-T)诱导产生抗体的免疫反应特性,并探讨不同佐剂对该疫苗免疫反应效果的影响。方法:合成了含2个Aβ42的 B细胞表位—Aβ1-15及1个辅助T细胞表位—PADRE的多肽2Aβ1-15-PADRE。采用Al(OH)₃佐剂,弗氏佐剂,Abisco佐剂,MF59佐剂分别与多肽疫苗联合免疫小鼠,并另设3个对照组:无佐剂多肽免疫组(Mock),PBS免疫组(PBS),未免疫组(Native)。结果:5组多肽免疫组小鼠均产生了针对Aβ的特异性抗体,无佐剂多肽免疫组的IgG抗体滴度最低,Al(OH)₃佐剂组,MF59佐剂组,Abisco佐剂组小鼠IgG抗体滴度较高,弗氏佐剂组IgG抗体滴度最高。斑点杂交实验结果显示5组小鼠免疫后血清与Aβ42单体反应较弱,与寡聚体反应最明显,与纤维状Aβ42几乎不反应。结论:4种佐剂均能提高多肽疫苗的免疫反应,产生高水平抗Aβ的特异性抗体。5组免疫小鼠产生的抗体均与Aβ寡聚体反应较强,与纤维状Aβ42反应较弱,表明该多肽疫苗具有良好的应用前景。     

噬菌体展示随机十肽库的构建及抗WSSV单链抗体A1的模拟抗原表位的淘选和鉴定

本实验以pCANTAB5E噬菌粒为载体,成功构建了较高容量的噬菌体展示随机十肽库,并将其应用于抗原模拟表位的淘选和鉴定。将一种特异识别对虾白斑综合症病毒(Whitespotsyndromevirus,WSSV)的单链抗体A1对十肽库和十五肽库分别进行淘选,结果得到一系列能与单链抗体A1特异性结合的阳性克隆。将这些阳性克隆所编码的多肽氨基酸序列与已知的单链抗体A1的抗原WSSV388片段氨基酸序列做比对,发现多数阳性多肽序列都与WSSV388片段序列的C端一处K????R??R?QS的氨基酸片段相似,由此推论单链抗体A1的模拟抗原表位可能是由该不连续氨基酸片段所构成的构象表位,而非线性表位。研究结果表明,噬菌体展示随机肽库技术是一种用于研究抗原表位结构的有效方法,有助于进一步探讨WSSV的结构蛋白的构象及功能,以及相应单链抗体与细胞受体相互作用的机理。     

噬菌体展示随机十肽库的构建及抗WSSV单链抗体A1的模拟抗原表位的淘选和鉴定

本实验以pCANTAB 5 E噬菌粒为载体,成功构建了较高容量的噬菌体展示随机十肽库,并将其应用于抗原模拟表位的淘选和鉴定.将一种特异识别对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus, WSSV)的单链抗体A1对十肽库和十五肽库分别进行淘选,结果得到一系列能与单链抗体A1特异性结合的阳性克隆.将这些阳性克隆所编码的多肽氨基酸序列与已知的单链抗体A1的抗原WSSV388片段氨基酸序列做比对,发现多数阳性多肽序列都与WSSV388片段序列的C端一处K····R··R·QS的氨基酸片段相似,由此推论单链抗体A1的模拟抗原表位可能是由该不连续氨基酸片段所构成的构象表位,而非线性表位.研究结果表明,噬菌体展示随机肽库技术是一种用于研究抗原表位结构的有效方法,有助于进一步探讨WSSV的结构蛋白的构象及功能,以及相应单链抗体与细胞受体相互作用的机理.     

噬菌体肽库筛选抗人B7-H4中和抗体的模拟抗原表位及其免疫原性鉴定

目的:用噬菌体呈现随机12肽库筛选能与抗人B7-H4(h B7-H4)中和抗体特异性结合的模拟抗原表位肽,并用其免疫小鼠检测其免疫原性。方法:以抗h B7-H4中和抗体为靶分子,用体外生物淘洗法从噬菌体呈现随机12肽库中筛选与之结合的噬菌体克隆,用竞争性细胞ELISA鉴定阳性噬菌体克隆;化学合成候选多肽,并与钥孔血蓝蛋白或破伤风毒素偶联鉴定多肽的特异性;进一步用融合蛋白免疫小鼠检测其免疫原性和抗血清的补体依赖的细胞杀伤活性(CDC)。结果:经过3轮体外筛选后随机挑取50个阳性噬菌体克隆,其中20个克隆与抗h B7-H4抗体有较强的结合能力,DNA测序得到6组结构相似的肽序列;竞争性ELISA结果显示1号肽噬菌体能与细胞表面的h B7-H4竞争性地结合抗h B7-H4单抗;点杂交结果显示1号肽能特异性结合抗h B7-H4单抗;小鼠免疫实验结果显示1号肽融合蛋白能诱导高滴度的抗h B7-H4抗血清,并且抗血清具有补体依赖的细胞杀伤活性。结论:筛选得到能与抗h B7-H4中和抗体特异性结合的12肽模拟抗原表位序列并且具有免疫原性,为进一步开发h B7-H4相关的多肽疫苗提供了实验依据。     

抗人白细胞介素15中和抗体识别抗原表位的噬菌体肽库筛选与鉴定

目的:用噬菌体呈现随机七肽库筛选能与抗人白细胞介素15(h IL-15)中和抗体特异性结合的模拟抗原表位肽,并初步鉴定其免疫原性。方法:以抗h IL-15中和抗体为靶分子,用生物淘洗法从噬菌体呈现线性七肽库中筛选与之结合的噬菌体克隆,用噬菌体ELISA和竞争抑制ELISA鉴定阳性噬菌体克隆;化学合成筛选得到的多肽,并与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联免疫BALB/c小鼠,检测其免疫原性。结果:经过3轮体外筛选后随机挑取50个阳性噬菌体克隆,ELISA检测结果显示其中15个克隆与抗h IL-15抗体有较强的结合能力,DNA测序结果得到的结构相似群为MTPFWQK、MSPFNQK、MIPYWQK和MIPFHQK;竞争性ELISA结果显示4个序列均能与IL-15竞争性地结合抗IL-15单抗;小鼠免疫实验结果显示4组多肽均能诱导IL-15特异性免疫反应。结论:筛选得到能与抗h IL-15中和抗体特异性结合,且具有免疫原性的模拟抗原7肽序列,为进一步开发h IL-15相关的多肽疫苗提供了依据。     

阿尔茨海默病重组4Aβ15-TF亚单位疫苗的免疫原性研究

目的:研究重组嵌合抗原4Aβ15-TF的免疫原性,评估其作为亚单位疫苗的可行性。方法:设计合成了重组融合蛋白4Aβ15-TF的基因序列,插入原核表达载体p TIG-Trx中,用大肠杆菌表达并纯化重组嵌合抗原4Aβ15-TF,与铝佐剂配制成亚单位疫苗免疫C57BL/6小鼠以研究其免疫原性。结果:重组嵌合抗原4Aβ15-TF免疫小鼠后刺激其产生了抗β淀粉样蛋白(Aβ)42的特异性抗体,抗体滴度4次免疫后达到较高水平,抗体亚型主要为IgG1型,并且伴随着少量的IgG2b,T淋巴细胞增殖实验证明免疫后产生了针对辅助性T细胞表位的T细胞免疫反应,不产生针对Aβ42的T细胞免疫反应。结论:大肠杆菌表达的重组嵌合抗原4Aβ15-TF具有良好的免疫原性,能够刺激产生高滴度的抗Aβ42抗体,并且产生的免疫反应主要为Th2型,无Aβ42特异的T淋巴细胞增殖反应。提示它可作为候选疫苗用于预防或免疫治疗阿尔茨海默病。     

羧基末端亚单位肽疫苗KLH-Aβ24-42诱导正常BALB/c小鼠制备抗Aβ42抗体

目的:探讨亚单位肽疫苗KLH-Aβ24-42接种小鼠后特异性抗Aβ42抗体的产生情况.方法:将Aβ24-42羧基端与载体蛋白KLH结合制成亚单位肤疫苗免疫BALB/c小鼠.间接ELISA法检测其血清和脑匀浆上清液中的抗体滴度,HE染色对小鼠脑、肝、脾、心、肺和肾行形态学观察抗体毒性.结果:第2次接种后各实验组开始有血清抗体产生,抗体滴度随接种次数的增多而增高;但脑匀浆上清液中未检测到抗体;小鼠各主要脏器均未见病理性变化.结论:亚单位肽疫苗KLH-Aβ24-42越免疫BALB/c小鼠后能产生抗Aβ42抗体,观察未见抗体对各重要脏器的毒性病理.     

噬菌体展示技术及其在肿瘤研究中的应用

噬菌体表面展示技术是一项特异性多肽或蛋白的筛选技术,它将随机序列的多肽或蛋白片段与噬菌体衣壳蛋白融合表达而呈现于病毒表面,被展示的多肽能保持相对独立的空间结构,使其能够与配体作用而达到模仿性筛选特异性分子表位,从而提供了高通量高效率的筛选系统。近年来噬菌体展示技术已广泛应用于肿瘤抗原抗体库的建立、单克隆抗体制备、多肽筛选、疫苗研制、肿瘤相关抗原筛选和抗原表位研究、药物设计、癌症检测和诊断、基因治疗及细胞信号转导研究等。就近年来噬菌体展示技术在肿瘤相关研究中的运用作以综述。     

GM-CSF和IL-4增强Aβ表位DNA疫苗的免疫原性研究

目的:探究和评价粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及白细胞介素4(IL-4)作为β淀粉样蛋白(Aβ)表位DNA疫苗的分子佐剂,增强DNA疫苗体液和细胞免疫反应的水平。方法:阿尔茨海默病DNA表位疫苗p VAX1-6Aβ15-T分别与重组DNA分子佐剂p VAX1-S-IL-4和p VAX1-S-GM-CSF联合免疫BALB/c小鼠,并检测其免疫原性。结果:分子佐剂IL-4组相比单独的DNA表位疫苗p VAX1-6Aβ15-T组抗体水平具有一定程度的提高;GM-CSF能明显提高DNA疫苗Aβ特异的抗体水平和泛DR辅助T细胞表位(PADRE)特异的细胞免疫反应,4次免疫后其抗体滴度提高了4倍。结论:GM-CSF佐剂能够有效地用于今后阿尔茨海默病DNA表位疫苗的研究中。     

重组痘苗病毒表达人免疫缺陷病毒中国株B'亚型Gag蛋白及免疫效果观察

为筛选用于我国HIV疫苗的候选基因,利用痘苗病毒载体构建表达HIV-1 B′亚型中国流行株RL42的Gag蛋白的重组病毒rVV-RL42gag,并免疫BALB/c小鼠,检测其诱导的特异性抗体及中和抗体,同时检测其诱导的特异性CTL及与中国流行株C(B′/C重组)亚型和国际流行株A亚型之间的CTL交叉反应.结果显示:重组病毒能很好地表达Gag蛋白,它具有与7株单克隆抗体结合的抗体表位;电镜下可观察到Gag蛋白形成的颗粒.rVV-RL42gag免疫小鼠后能诱导产生高滴度的特异性抗体和CTL,抗体具一定的中和活性,且检测到与C(B′/C重组)亚型和国际流行株A亚型之间的CTL交叉反应.这些结果表明,rVV-RL42gag具有良好的免疫原性,可进一步构建表达HIV B′亚型中国流行株RL42的Gag蛋白的重组痘苗病毒作为候选疫苗.     

羧基末端亚单位肽疫苗KLH—Aβ24-42诱导正常BALB／c小鼠制备抗Aβ42抗体

目的：探讨亚单位肽疫苗KLH—Aβ24-42接种小鼠后特异性抗Aβ42抗体的产生情况。方法：将Aβ24-42羧基端与载体蛋白KLH结合制成亚单位肽疫苗免疫BALB／c小鼠。间接ELISA法检测其血清和脑匀浆上清液中的抗体滴度,HE染色对小鼠脑、肝、脾、心、肺和肾行形态学观察抗体毒性。结果：第2次接种后各实验组开始有血清抗体产生,抗体滴度随接种次数的增多而增高;但脑匀浆上清液中未检测到抗体;小鼠各主要脏器均未见病理性变化。结论：亚单位肽疫苗KLH—Aβ24-42免疫BALB／c小鼠后能产生抗Aβ42抗体,观察未见抗体对各重要脏器的毒性病理。     

A型肉毒毒素表位多肽免疫和人源噬茵体单链抗体文库的构建

采用表位合成多肽免疫获得编码人源抗体的基因材料,抗体轻重链可变区基因通过剪接重叠延伸(SOE)技术进行组装后,亚克隆入噬菌体粒中构建免疫库。以重组制备的A型肉毒毒素保护性抗原为配体筛选结合子,ELISA鉴定,获得具有较高抗原结合力的噬菌体克隆,进行基因测序和家族定位分析。结果显示,表位合成多肽免疫,成功构建了库容大于10^8的重组抗体库。体外3轮免疫淘筛,筛选到人源A型肉毒抗毒素克隆,基因结构分析表明,其中ScFvB17全长750bp,可编码250个氨基酸残基：VH属于VH4家族,369bp,编码123个氨基酸残基;Vκ属于κ链Ⅱ家族,336bp,编码112个氨基酸残基。基因的同源分析表明,这是一株特异的单链抗体新基因。     

靶向β淀粉样蛋白的阿尔茨海默病疫苗研究进展

阿尔茨海默病(AD)是一种以认知功能障碍和记忆减退为主要临床特征的神经退行性疾病。目前,β淀粉样蛋白(Aβ)被认为是AD免疫治疗的关键靶标,其疫苗研究包括多肽疫苗、DNA表位疫苗及病毒载体疫苗等。我们简要地对近年来AD疫苗研究进展进行了综述。     

丙型肝炎病毒复合高变区1模拟表位蛋白的免疫原性分析

将丙型肝炎病毒高变区1(HVR1)模拟表位融合基因插入原核表达载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,经亲和层析和凝胶过滤层析获得HCVHVR1模拟表位融合蛋白。用Westernblot和ELISA检测融合蛋白与HCV抗体阳性血清的结合情况。皮下注射免疫BALB/c小鼠,用ELISA检测小鼠血清中的抗HCV抗体水平及其与天然HCV高变区1合成肽的交叉反应。结果表明融合蛋白能与HCV抗体阳性血清特异结合,融合蛋白与HCV抗体阳性血清的结合频率为71.6%(25/35)。融合蛋白免疫小鼠后能有效诱导免疫应答,其诱生的特异性抗体最高滴度达104(免疫后第8周),且该抗体能同2条天然HCVHVR1合成肽发生交叉反应。本研究提示,HCV复合HVR1模拟表位融合蛋白在丙型肝炎疫苗的研发中可能具有潜在应用价值。     

β淀粉样蛋白人源性抗体的制备

目的:应用噬菌体展示及抗体库技术,制备并鉴定β淀粉样蛋白(Aβ)人源性抗体。方法:应用固相筛选方法,以人工合成的Aβ1-15肽为靶标分子,在大容量全合成人源性噬菌体抗体库中筛选抗Aβ人源性抗体,并进行特异性鉴定。结果:经过3轮筛选,单克隆鉴定获得噬菌体抗体F11,竞争性ELISA表明抗体对Aβ1-42的结合位点位于1～15氨基酸残基内,ELISA结果证实抗体特异性良好。结论:以Aβ1-15肽为靶标分子获得了特异性良好的人源性抗体。     

高致病性禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和表位模拟肽的筛选与鉴定

以H5N1型禽流感病毒HA蛋白广谱中和单抗8H5为基础,利用噬菌体展示肽库技术及类病毒颗粒融合表达技术研究HA模拟表位。ELISA检测结果显示:筛选获得模拟HA表位的模拟肽123,进行类病毒颗粒融合蛋白表达后,仍具有与8H5单抗特异结合的能力。免疫荧光检测结果说明,类病毒颗粒免疫小鼠后产生了能与HA交叉反应的抗体。禽流感病毒HA模拟表位的研究与性质的分析及类病毒颗粒融合蛋白的表达与活性分析、免疫原性分析,都为研制禽流感通用表位疫苗奠定了基础。     

以Aβ4-11为免疫原制备Aβ1-42多克隆抗体

β淀粉样蛋白1-42(βamyloid 1-42,Aβ1-42)是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的主要致病蛋白,其抗体一直处于研发当中。现以Aβ4-11耦联KLH免疫2月龄雌兔,ELISA检测雌兔免疫血清中所产生的抗Aβ4-11 IgG滴度,Protein G-琼脂糖亲和层析纯化IgG,Bradford方法进行IgG蛋白含量测定,SDS-PAGE进行IgG纯度测定,最后运用所制备的多克隆抗体采用免疫组化的方法分别对正常小鼠和9月龄APP转基因小鼠进行老年斑的检测,以鉴定此抗体对Aβ1-42的特异性及亲和力。结果显示Aβ4-11具有良好的体液免疫原性,而且以其为免疫原制备的抗体对Aβ1-42表现出良好的特异性及亲和力。结果表明,以Aβ4-11亚单位片段为免疫原制备的Aβ1-42多克隆抗体,可以作为AD的一种有效研究工具,同时也为AD的诊断和治疗提供了一种新的可能。     

基于B细胞表位制备抗肝细胞生成素的抗体

目的：基于B细胞表位制备抗肝细胞生成素（HPO）的抗体。方法：根据HPO的空间结构选择了2个候选B细胞表位,展示在T7噬菌体的表面,将提取的重组噬菌体免疫动物,采用ELISA法检测抗血清的效价,通过杂交瘤技术制备针对HPOC端表位的单克隆抗体。结果：2个候选B细胞表位KDGSCD和DGWKDGSC均能诱导抗相应表位多肽的多克隆抗体的产生,免疫6周后血清中抗体效价均达到1∶103,产生的抗体还能够特异识别HPO全蛋白;针对HPOC端表位KDGSCD的单克隆抗体也能识别HPO全蛋白,且具有良好的特异性。结论：基于T7噬菌体展示的B细胞表位可作为免疫原用于制备识别该B细胞表位来源的全蛋白质的抗体。