羟基脲诱导前后HEL细胞内GATA转录因子与人β—类珠蛋白基因调控元件的结合模式分析

HEL细胞是一株人红白血病细胞株,其中成年型β-珠蛋白基因不能表达。我们以往的试验证明,羟基脲诱导以后,能使HEL细胞内成年型β-珠蛋白基因表达。本文以此为模型,探索了β-珠蛋白基因在HEL细胞内诱导表达的分子机制。结果表明,羟基脲诱导之后,与人β-珠蛋白基因5’远侧端DNaseⅠ超敏感点2核心DNA序列以及近侧端启动子DNA序列相结合的GATA-1蛋白因子量明显增多,而GATA-2蛋白因子量明显减少。结果显示,GATA蛋白家族各成员在HEL细胞分化及珠蛋白基因表达的过程中扮演着不同的角色。推测GATA-1可能有促进β-珠蛋白基因的表达,使HEL细胞趋向终末分化的作用,GATA-2则可能与胚胎型珠蛋白基因表达有关,并有抑制红细胞向终末分化的功能。     

与人体β-珠蛋白基因5'旁侧正调控区(PCR)相结合的调控因子(简报)

β-珠蛋白基因簇是研究真核基因表达时空秩序性的理想模型,在它的5个结构基因(ε,~Aγ,~Gγ,δ和β)中,成年型的β-珠蛋白基因主要在出生后人的骨髓中表达。过去的研究表明,在β-珠蛋白基因的5′旁侧序列内至少存在三个调控元件,即两个负调控区     

2型腺相关病毒载体介导正常人β珠蛋白基因在重型地贫流产胎儿造血细胞中的表达

目的:探讨2型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus 2,rAAV2)载体介导人β-珠蛋白基因转染地贫患者造血细胞治疗β-地中海贫血的可行性.方法:分离β 41-42/β 654杂合子型重型β-地贫流产胎儿造血细胞,经rAAV2-β-globin病毒转染(MOI=50)后移植入经X射线照射的BALB/c裸小鼠体内,分别于移植后14d、21d处死受体小鼠,RT-PCR及等位基因特异性PCR法检测人珠蛋白基因在受体小鼠体内的表达.结果:RT-PCR方法于3只受体小鼠骨髓样本中成功检测到人β-actin和人β-珠蛋白基因的表达,而21d处死的转染与对照小鼠外周血样本中未检测到人β-珠蛋白基因表达;等位基因特异性PCR方法在所有受体鼠体内同时检测到β 41-42和β 654突变基因,以及正常β-珠蛋白基因的表达,但rAAV2-β-globin转染组小鼠体内正常人β-珠蛋白基因表达水平明显高于对照组.结论:rAAV2可有效转染β 41-42/β 654杂合子型重型地中海贫血患者造血细胞,并通过exvivo途径介导β-珠蛋白转基因的体内表达,提高红系细胞内正常β-珠蛋白基因的表达水平.     

γ-珠蛋白基因表达调控机制与临床应用

成人体内的血红蛋白是由2个 α-珠蛋白和2个β-珠蛋白组成的四聚体,负责氧气的运输。珠蛋白基因在基因组中成簇分布,其表达受到多种顺式作用元件和反式作用因子的共同调控,具有高度的组织特异性和发育时序性。β-地中海贫血和镰刀型细胞贫血是两种最常见的由于β-珠蛋白基因突变引起的常染色体隐性遗传病。γ-珠蛋白是一种主要在胎儿时期表达的类β-珠蛋白,同样具有载氧功能,但编码该蛋白的基因在上述贫血患者中却保持完好。因此,临床上优选的治疗方案之一是重新激活患者体内沉默的γ-珠蛋白基因的表达来弥补缺损的β-珠蛋白,从而缓解临床症状。目前已有多种能提高γ-珠蛋白基因表达的药物,在临床上用于治疗β-地中海贫血和镰刀型细胞贫血。随着基因组编辑技术的发展,针对这两种贫血的精准基因治疗研究也在进行中。本文着重介绍了参与γ-珠蛋白基因调控的转录因子和表观遗传修饰分子,以及目前相关的β-地中海贫血和镰刀型细胞贫血的临床治疗药物和手段,以期为深入阐明γ-珠蛋白基因的转录表达分子调控机制提供参考。     

一个α,β地中海贫血复合家系β珠蛋白基因的进一步研究

 前文~[1]曾报道广西一个α,β地中海贫血复合家系的血红蛋白组成及α珠蛋白基因分析结果,并讨论了各成员可能的β珠蛋白基因结构情况。本文利用先进的PCR即基因扩增技术,结合特异寡核苷酸探针斑点杂交及扩增后直接测定DNA序列的技术,进一步研究并彻底搞请了该家系各成员的β珠蛋白基因结构情况。结果显示:母亲及两个弟弟都是编码子41—42TTCT四个碱基缺失造成框架位移所致β地中海贫血的杂合子。父亲与先证者的β基因均属正常。前三个成员均为α地贫复合β地贫,其α与β珠蛋白链合成的不均衡状态得到改善,贫血症状也明显轻。     

β地中海贫血基因治疗的研究进展

基因治疗是根治β地中海贫血研究的重点方向。位点控制（LCR）的发现以及新型基因转移系统不断开发研制,结导入正常β珠蛋白基因以实现基因治疗的设想带来了希望但同时也产生了新课题;与此同时,分别从DNA和RNA水平对受损的β珠蛋白基因进行修正治疗的研究也在开展当中。随着珠蛋白基因表达调控机制研究不断深入,同时开发出安全高效的新型病毒载体,有可能最终实现β地中海贫血基因治疗。     

羟基脲对人红白血病细胞株中球蛋白基因表达和细胞分化的影响

人红白血病细胞株（ＨＥＬ细胞）中珠蛋白基因表达具有自己的特点。即只表达胚胎型的γ－珠蛋白基因而不表达成人型的β－珠蛋白基因。羟基脲是一种抑制ＤＮＡ的小分子有机化合物。它在临床上被用来治疗地中海盆血和镰刀型贫血。我们的实验结果表明：胡羟基脲浓度增加ＨＥＬ细胞增殖速度减慢。用常规ＲＴ－ＰＣＲ方法和定量ＰＣＲ分析证明,用羟基脲诱导ＨＥＬ细胞后,β－珠蛋白基因表达增加,α－珠蛋白基因表达减少,而γ－珠蛋白     

羟基脲(Hydroxyurea)对细胞周期与珠蛋白基因表达的影响(简报)

已有许多证据表明羟基脲能增加镰状细胞贫血及β-地贫病人的胎儿型血红蛋白(HbF)的合成。最近,有人报道羟基脲也能使一些患有β-地贫病人的β-珠蛋白基因表达增加。K562细胞是人红白血病细胞株,它只能表达胚胎型(ε-)与胎儿型(γ-)珠蛋白基因,而不能表达成年型(β-)珠蛋白基因。因此,K562     

羟基脲对人红白血病细胞株中珠蛋白基因表达和细胞分化的影响

人红白血病细胞株(HEL细胞)中珠蛋白基因表达具有自己的特点。即只表达胚胎型的γ-珠蛋白基因而不表达成人型的β-珠蛋白基因。羟基脲(Hydroxyurea)是一种抑制DNA合成的小分子有机化合物。它在临床上被用来治疗地中海贫血和镰刀型贫血。我们的实验结果表明:随羟基脲浓度增加HEL细胞的增殖速度减慢。用常规RT-PCR方法和定量PCR分析证明;用羟基脲诱导HEL细胞后,β-珠蛋白基因表达增加,α-珠蛋白基因表达减少,而γ-珠蛋白基因表达变化不明显。对参与珠蛋白表达的转录因子GATA-1和NF-E2的定量PCR分析发现:这两种转录因子的表达均增加3倍以上。因此,羟基脲可能通过某些信号传递途径促进β-珠蛋白基因表达,从而使HEL细胞趋向终末分化。     

IL—3对人红白血病细胞株珠蛋白基因表达的影响

运用ＲＴ－ＰＣＲ等方法研究了白细胞介素－３（ＩＬ－３）对人类红白血病细胞株（Ｋ５６２细胞）内珠蛋白基因表达的影响,结果显示,Ｋ５６２细胞在诱导前,不能表达β－珠蛋白基因,用ＩＬ－３５０ｕ／ｍｌ诱导Ｋ５６２细胞３ｄ和５ｄ后,可检测到β珠蛋白基因的转录产物,而α珠蛋白基因和γ－珠蛋白基因在诱导前后无明显变化,同时,用苯肼当色细胞的方法检测到：Ｋ５６２细胞在诱导前蓝染细胞数极少,ＩＬ－３诱导Ｋ５６２细胞     

导致血红蛋白P-Nilotic的β-δ杂合基因的研究

本文通过基因克隆和测定DNA顺序,证明导致血红蛋白变异体P-Nilotic的β-δ杂合基因的不等交换发生在β珠蛋白基因第275位碱基与330位碱基之间长54bp的DNA片段上。即第31与50编码子之间。因此,该杂合基因的第一外显子和第一内含子源于β基因,而第二、三外显子和第二内含子源于δ基因。这些结果支持关于第二个内含子影响β珠蛋白基因表达水平的观察。     

利用进化比较的方法确定β珠蛋白基因簇调控的顺式元件

利用进化比较的方法对我、兔子和灵长类Ｇａｌａｇｏ的β珠蛋白基因以及所在的β珠蛋白基因簇进行分析,确定了可能的基因调控的顺式元件,并与一些实验结果进行比较,发现利用进行比较的方法确定基因调控的顺式元件是一种简单可行的方法。     

人胎儿γ-珠蛋白基因的再活化及在β血红蛋白病治疗中的

在个体发育过程中,人β类珠蛋白基因的表达存在从胎儿（γ）到成人（β）珠蛋白基因的表达转换（或称开关）.β-地中海贫血和镰刀型贫血症是两种最为常见的严重危害人类健康的单基因遗传病,通过诱导胎儿期血红蛋白（HbF,α2γ2）在成人期表达对该病的治疗是一种有效的策略.一些活化γ珠蛋白基因表达的转录因子和辅助因子已经被鉴定,一些可以增加胎儿血红蛋白在成人红细胞中表达的药物也已被鉴别和实验,它们的作用机制被部分揭示,这些研究为发展通过活化γ-珠蛋白基因治疗镰刀形细胞贫血和重型β-地中海贫血的方法提供了重要线索和实验依据.     

遗传工程的新成就— 猴肾细胞内合成了兔β-珠蛋白

1979年的《Nature》第277卷5692期上发 表了斯坦福大学医学中心Mulligan, R. C.等人 的工作。他们将兔β珠蛋白m RNA的。DNA 插人SV40 DNA，建成了SV40β一珠蛋白重组基 因组— SVGT-5-RaβG。这个重组基因组在 猴肾细胞转录了含有β-珠蛋日rnRNA的polyAmRNA 杂种分子。这些细胞合成了大量的兔β- 珠蛋白多肪，也即兔β-珠蛋白基因在猴肾细胞 中实现了表达。     

人体β-珠蛋白基因5’旁侧调控元件与不同发育时期调控因子的相互作用

人β-珠蛋白基因主要在成年期的骨髓中表达,在胎儿肝,成年肝和K 562细胞中则处于关闭状态。凝胶电泳阻抑法分析发现,在人胎儿肝,成年肝及K 562细胞的核蛋白抽提物中存在着不同的与β-珠蛋白基因5'旁侧调控元件(-372到-194 bp)相结合的红系组织特异性的调控因子。竟争试验的结果表明,成年肝和K 562细胞中的调控因子与β-珠蛋白基因5'旁侧调控元件相互作用的方式具有一定的相似性,这两种细胞的调控因子既结合于负调控区(NCR 2)也结合于正调控区,说明两种细胞中β-珠蛋白基因的关闭机制可能是相似的。胎儿肝的核蛋白因子只结合于负调控区,推测在胎儿期存在独特的关闭机制。     

影响β-地中海贫血表型的遗传修饰作用

β-地中海贫血(β-地贫)是一种可致死、致残的遗传性血液病,临床上具有较宽泛的表型变异谱,在致病基因型相同或类似的情况下,患者的临床表型严重程度有很大的差异。探索影响β-地贫表型的遗传修饰因素是当前血液病及遗传病领域的研究热点和重点。本文从α-珠蛋白基因型和胎儿血红蛋白(Hb F)数量性状位点两个方面阐述了可加重或缓解β-地贫表型的遗传修饰因素,并着重介绍了调控?-珠蛋白基因重激活的转录因子变异,以及β-珠蛋白基因簇顺式元件变异。最后,本文举例介绍了β-地贫遗传修饰的临床应用以及未来发展前景。     

人体β—珠蛋白基因5‘旁侧调控元件与不同发育时期调控因子的…

人β－珠蛋白基因主要在成年期的骨髓中表达,在胎儿肝,成年肟和Ｋ５６２细胞中则处于关闭状态,凝胶电泳阻抑法分析发现,在人和肝,成年肝及Ｋ５６２细胞的核蛋白抽提物中存在着不同的与β－珠蛋白基因５旁侧调控元件（－３７２到－１９４ｂｐ）相结合的红系组织特生的调控因子。竞争试验的结果表明,成年肝和Ｋ５６２细胞中的调控因子与β－珠蛋白基因５旁侧调控元件相互作用的方式具有一定的相惟性,这两各细胞的调控因子既结合     

β地中海贫血的分子缺陷

一、前言地中海贫血(简称地贫)是常见的遗传性疾病,在地中海沿岸国家及我国南方携带地貧基因者比例很高。地贫基因主要有α和β两类。β地贫又包括β~+和β~0等主要类型,前者表现为红细胞中β珠蛋白链合成减少(为正常的5—30％),后者β链完全不能合成,但二者的β珠蛋白基因是完整的(除极少数病例外),其分子基础涉及到特异性分子缺陷,从而导致基因表达的异常或失能。现在已知,β地贫分子缺     

2型腺相关病毒转导人胎肝造血细胞及其介导的β珠蛋白基因的表达

β地中海贫血是一种因β珠蛋白基因缺陷导致的遗传性贫血性疾病,基因治疗是唯一有望治愈该病的方法.2型腺相关病毒(adeno-associated virustype2,AAV2)是一种非致病性病毒,作为一种基因治疗载体,其应用潜力日益受到关注.目前还未见AAV2转导人早期胎肝造血细胞及其介导β珠蛋白基因在动物体内表达的实验报道.有研究表明,AAV2转导人造血干细胞的效率,因各实验室包装和纯化rAAV2的方法不同而存在差异,其中辅助病毒的污染被认为是一重要原因.制备了无辅助病毒污染的rAAV2,经体外检测其滴度,纯度及功能后,再转导人早期胎肝造血细胞,将被转导的胎肝造血细胞移植入受亚致死量剂量照射的8只BALB/C裸鼠体内,检测rAAV2介导的β珠蛋白基因在裸鼠体内的表达.结果显示:制备的无辅助病毒污染的rAAV2具有较高的滴度、纯度,并能够在体外介导β基因的表达;在8只受试BALB/C裸鼠中,RT-PCR在2只BALB/C裸鼠骨髓中检测到β珠蛋白基因的表达.提示,rAAV2能够转导人早期胎肝细胞并介导β珠蛋白基因的表达,但同时也存在表达量较低的缺点,应用于β地中海贫血的基因治疗还需要对AAV2生物学特性做深入的研究.     

高原世居藏族α、β珠蛋白编码基因的克隆与测序

目的:通过对高原世居藏族α、β珠蛋白编码基因的分析,探讨藏族Hb高氧亲合力的分子机制.方法:高原现场采集健康成年男性藏族人骨髓样品,提取总RNA,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得人α和β珠蛋白的cDNA,与PGEM-T Easy质粒连接后,将α和β珠蛋白的cDNA转化JM109大肠杆菌中扩增培养,经酶切鉴定后测序,结果与NCBI数据库进行同源性比较.结果:藏族人α珠蛋白的cDNA与NCBI数据库登录的人cDNA序列相同,没有突变位点.一例藏族人β珠蛋白143位密码子发生了氧亲和力增高的碱基突变(CAC-＞CGC),其对应的氨基酸由His变为Arg(即Hb Abruzzo).结论:藏族人高氧亲和力变种的发现,为今后高原低氧适应相关基因的研究提供了线索.