基因组YAC文库构建方法的几点改进

以pJS97、pJS98为载体, 对中国人基因组YAC文库的构建进行了尝试.建立了一种对小片段DNA“原位电泳筛除”的方案, 采用多胺溶液处理以减少大片段DNA的降解, 使整个建库工作更加简便、有效. 此外, 改进了转化子的挑取和保存的方法, 既简化了操作, 又减少了杂菌污染和交叉污染. 这些改进的方案, 可以推广到其他高等生物基因组YAC文库的构建和应用工作.     

人基因组百万碱基级巨型YAC的构建

人基因组百万碱基级巨型ＹＡＣ的构建戴长虹,柴建华（复旦大学遗传学研究所,上海２００４３３）关键词人基因组;酵母人工染色体（ＹＡＣ）;百万碱基;巨型ＹＡＣ人类的全部遗传信息包含在３ｘ１０＇核着酸对（ｈｐ）中,共编码５００００～１０００００个基因。人类基...     

YAC克隆的筛选及鉴定分析技术

人工酵母染色体（ＹＡＣ）技术是人类基因组分极及疾病相关基因的分离、克隆中的关键技术。在基因组ＹＡＣ文库基础上特定目的基因的分离克隆涉及ＹＡＣ克隆的筛选,嵌合体、缺失体和共转染克隆的检测与处理,插入片段的分离及及其结构特征的分析,亚克隆的快速构建等等。近年来,有关技术取得了重要进展,已趋于成熟,并正得到了广泛应用。     

人基因组YAC分子克隆库的构建及DMD基因YAC克隆的筛选

以pYAC4为载体,以正常人白细胞和含4条X染色体的细胞株GM1414为DNA源构建成人基因组YAC(Yeast Artificial Chromosome,酵母人工染色体)分子克隆库,已得到原始克隆近2万个,插入DNA片段长度在400—1000kb,从其中选出一组YAC克隆,它们含有DMD基因全部DNA顺序。     

YAC克隆的筛选及鉴定分析技术

人工酵母染色体（ＹＡＣ）技术是人类基因组分析及疾病相关基因的分离、克隆中的关键技术。在基因组ＹＡＣ文库基础上特定目的基因的分离克隆涉及ＹＡＣ克隆的筛选,嵌合体、缺失体和共转染克隆的检测与处理,插入片段的分离及其结构特征的分析,亚克隆的快速构建等等。近年来,有关技术取得了重要进展,已趋于成熟,并正得到广泛应用 。     

水稻核基因组DNA的YAC克隆和鉴定

将EcoRI部分消化的水稻(Oryza sativa L.)细胞核高分子量DNA电泳分部,回收大于200kb的片段,与内切酶消化过的酵母人工染色体(YAC)双质粒载体pJs97。pJS98DNA连接,转化酵母YPH252感受态原生质球,用ura^-,TrP^-双选择培养基直接筛选转化子,已获得2 000多个克隆。转化子DNA的southern杂交显示插入片段在200～820kb范围。     

人基因组YAC克隆DNA的Alu—PCR反应条件的系统研究

在人基因组ＹＡＣ克隆的Ａｌｕ－ＰＣＲ指纹分析中要求ＤＮＡ扩增带具有ＹＡＣ特征性;在Ａｌｕ－ＰＣＲ方法对ＹＡＣ克隆中的人类基因组ＤＮＡ片段进行特异的同位素标记时则要求被增标记的ＤＮＡ序列在插入片段中具有一定弥散性,我们建立了两种不同的Ａｌｕ－ＰＣＲ反应体系以满足这一不同要求,并已得到较为满意的结果,根据不同条件下的Ａｌｕ－ＰＣＲ结果,分析了多引发位点ＰＣＲ中的一些现象,并作了解释。     

YAC介导的天蚕丝素基因向家蚕的转移 ——天蚕丝素基因—YAC克隆在家蚕的表达

本文为天蚕Antheraea yamamai丝素基因在家蚕Bombyx mori成功表达的首次报道。     

人基因组YAC克隆DNA的Alu－PCR反应条件的系统研究

在人基因组ＹＡＣ克隆的Ａｌｕ－ＰＣＲ指纹分析中要求ＤＮＡ且扩增带具有ＹＡＣ特征性;在用ＡｌＵ－ＰＣＲ方法对ＹＡＣ克隆中的人类基因组ＤＮＡ片段进行特异的同位素标记时则要求被扩增标记的ＤＮＡ序列在插入片段中具有一定的弥散性。我们建立了两种不同的Ａｌｕ－ＰＣＲ反应体系以满足这一不同要求,并已得到较为满意的结果。根据不同条件下的Ａｌｕ－ＰＣＲ结果,分析了多引发位点ＰＣＲ中的一些现象,并作出了解释。     

用万能引物PCR法从YAC中分离制备荧光原位杂交探针的研究

报道了一种从微量且未知碱基顺序的YAC DNA中制备FISH探针的新方法——万能引物PCR(UP PCR),即把复性后的UP-Linker连接于PFGE分离后经Alu Ⅰ酶切的YAC DNA上,再用UP对其进行PCR扩增和标记。由于Alu Ⅰ的广谱性和UP与Linker长度不同等,使该法能根据PCR效率调节扩增产物的广泛性向特异性的转变,且产物能覆盖YAC嵌入DNA的全长。此法制备的人21号染色体FISH探针,特异性强,杂交信号明亮,21号染色体的检出率高。该法稳定简便。     

kar交配法转移YACs至新宿主的研究

利用改进的ｋａｒ交配法,将一个含有３４０ｋｂ人基因组ＤＮＡ的ＹＡＧ片段的供体酵母菌株ＹＡＣ２３与受体菌株ＹＬＢ５０４进行交本,以选择平板对所形成的侯选ＹＡＣ导入菌进行筛选,经ＰＣＲ分析,候选ＹＡＣ导入菌在４０４ｂｐ处有一个扩增带,即具有受体菌株的交配型（ＭＡＴα）。地一步用脉冲电沪进行核型鉴定。     

YAC介导的天蚕丝素基因向家蚕的转移──天蚕丝素基因-YAC克隆在家蚕的表达

本文为天蚕Antheraeyamamai丝素基因在家蚕Bombyxmori成功表达的首次报道。我们构建了天蚕丝素基因的YAC克隆,然后把含有该克隆的DNA溶液导入家蚕受精卵。分子杂交实验证明天蚕丝素基因已整合到家蚕基因组中。通过丝心蛋白氨基酸组分分析以及茧丝的溶解性比较,发现有部分转基因家委表达了天蚕丝素基因。F2代的转基因家蚕蛾的染色体DNA中同时还存在YAC序列,说明YAC对丝素基因具有介导作用。天蚕丝素基因以单拷贝形式存在于转基因家蚕中。     

优良水稻品种“明恢63”BAC文库的构建

“明恢６３”是我国许多重要的水稻杂交组合中的恢复系。为了对其进行深入的遗传学研究以及克隆控制重要农艺性状的基因,以细菌人工染色体（ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１）为载体,克隆经限制性内切酶消化后部分收集的“明恢６３”基因组ＤＮＡ,将连接混合物转化细菌ＤＨ１０Ｂ,构建了细菌人工染色体（ＢＡＣ）文库。该文库共有２６０００个转化子,插入片段为９０～２４０ｋｂ,平均大小为１５０ｋｂ。经计算该文库覆盖９倍水稻基因组。该文库正在用于构建几个基因所在区段的物理图谱,为图位克隆打下基础     

第21人类染色体长臂DNA的YAC克隆及重叠排序

人类基因组的研究已在全世界主要发达国家展开。由于YAC(YeastArtificialChromosome)克隆技术的建立及广泛采用,已使人类及其他生物基因组的研究迈出了成功的第一步。以DanielCohen(CEPH,Paris)为首,联合法国、西班牙、美国和日本12家实验室的35名 合作者,已完成了人类第21染色体长臂DNA的YNC克隆及重叠排序(Nature359,380-387,1992)。     

细菌人工染色体文库的构建及应用

细菌人工染色体（BAC）是第二代大片段DNA的克隆载体系统,具有容量大、嵌合率低、遗传特性稳定、转化效率高、插入片段易回收、操作简便等优点,因而被广泛应用于基因组较大的真核生物基因组研究中,并发挥着前所未有的重要作用。本文综述了BAC的发展,利用此载体构建基因组文库的程序和鉴定方法,及其在物理图谱构建、图位克隆、基因组测序、转基因技术等研究中的应用。     

高覆盖率水稻ＢＡＣ库的构建及抗病基因相关克隆的筛选

利用含Ｘa4、xa5和xa13 3个水稻白叶枯病抗性基因的累加系ＩＲＢＢ５６构建了一个水稻细菌人工染色体文库,该文库包含５５２９６个克隆,平均插入升段为１３２kb。按水稻基因组为４５０Ｍb计,该文库覆盖１４倍基因组,筛选出任一水稻基因或序列的概率为９９．９９％。用均匀分布的３个叶绿体基因和４个线粒体基因克隆作探针筛选文库,结果显示该文库中含细菌器基因组ＤＮＡ同源序列的克隆数小于１％、用分布于水稻３条不同染色体、分别与Ｘa4、xa5和xa13连锁的ＤＮＡ标记筛选文库,分别检测出１１－１０６个阳性克隆,为克隆这些基因打下了基础。该文库对水稻基因组的高度覆盖率和较大的插入片段,非常适合于物理作图和基因的分离和克隆。