毛竹APX家族基因鉴定和表达分析

为了解毛竹(Phyllostachys edulis)抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)基因家族成员在不同组织和非生物胁迫下的表达模式,利用生物信息学方法从毛竹基因组数据库中鉴定得到7条APX同工酶基因(PeAPXs),根据亚细胞定位预测结果可分为3个亚类。各个基因启动子序列中存在低温、干旱以及光响应元件。毛竹PeAPXs在7个组织中的表达丰度不同,具有组织特异性。qRT-PCR结果表明,在干旱、盐和低温胁迫下各基因的表达模式存在着较大差异,其中PeAPX2在3种胁迫下均维持着较高的表达水平;低温胁迫对PeAPXs有诱导作用,其表达量均呈上调趋势;干旱胁迫下,PeAPX1的表达量下调,未检测到PeAPX3、PeAPX6、PeAPX7表达;盐胁迫下,除PeAPX3和PeAPX6外,其余基因表达量上调。因此,毛竹APX基因可能参与到不同的非生物胁迫过程并在毛竹的生长发育阶段发挥着重要的作用。     

橡胶草APX基因家族的全基因组鉴定及表达分析

该研究利用生物信息学方法,在橡胶草(Taraxacum kok-saghyz)全基因组中鉴定出7个TkAPXs基因家族成员,进一步分析发现7个成员中有1对是复制基因(TkAPX4/TkAPX6)。进化分析结果显示,7个基因可分为4个亚组;染色体定位分析表明,TkAPX基因家族成员分布广泛,7个TkAPXs基因位于7条不同的染色体上;亚细胞定位结果表明,TkAPX1、TkAPX3、TkAPX5和TkAPX7定位于细胞质,TkAPX4和TkAPX6定位于质膜,TkAPX2定位于叶绿体。启动子区域顺式作用元件分析结果显示,橡胶草APX基因含有大量的应激反应元件,推测APX基因可能对各种外界刺激和胁迫存在灵敏的应激反应机制。实时荧光定量PCR分析表明,橡胶草7个TkAPXs基因家族成员在花萼、花瓣、花梗中表达量均较低,大多数TkAPXs在根茎叶中的表达水平大于花及胶乳,其中TkAPX1在根和茎中的表达水平最高,推测TkAPX1基因可能在橡胶草生长发育过程中起重要作用。进一步对TkAPXs基因家族在逆境胁迫(冷、热、盐、旱)和激素(乙烯、茉莉酸甲酯)处理下的表达分析显示,TkAPX3在根及叶中的表达水平均较对照有大幅度升高,推测TkAPX3基因可能在橡胶草应答逆境胁迫和激素处理反应过程中起重要作用。     

金针菇几丁质合成酶基因家族鉴定及其表达分析

【背景】几丁质是真菌细胞壁的重要成分,由几丁质合成酶（chitin synthase,CS）催化合成。几丁质合成酶编码基因在大型食用真菌金针菇中的数量及表达规律尚不明确。【目的】探究几丁质合成酶基因在金针菇中存在的数量及其在子实体不同发育时期的表达规律,为其在大型真菌子实体生长发育过程中的功能研究提供基础。【方法】基于已有的金针菇菌株L11基因组数据,结合NCBI其他真菌CS序列鉴定金针菇中几丁质合成酶编码基因的数量,并对其进行生物信息学分析。进一步根据金针菇F19转录组数据以及实时荧光定量PCR （RT-qPCR）技术分析金针菇CS基因家族的表达规律。【结果】在金针菇单核体菌株L11的基因组中鉴定到9个几丁质合成酶基因,系统发育分析表明它们在子实体发育过程中的表达模式可分为4类（皮尔森相关系数=0.85）。【结论】金针菇CS基因家族表达模式在金针菇不同生长发育时期均存在差异,可能参与了子实体发育不同时期和组织的形态建成。     

斑节对虾α-淀粉酶基因的克隆及其表达分析

为了研究斑节对虾α-淀粉酶基因的结构和生物学功能, 根据原实验室构建的斑节对虾(Penaeus monodon) cDNA文库得到的EST序列, 利用RACE技术获得了斑节对虾α-淀粉酶基因(PmAmy)的cDNA全长序列。该基因序列全长2465 bp, 包括2175 bp的开放阅读框, 编码724个氨基酸, 分子总量为78.9 kD, 理论等电点为4.66。PmAmy包含一个α-淀粉酶家族保守的A结构域(Thr34-Ser410)和一个C结构域(Glu420-Ala496)。PmAmy氨基酸序列与其他物种的相似性为47%—99%, 利用PmAmy构建的进化树显示斑节对虾和凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的亲缘关系最近。基因表达结果显示PmAmy在肝胰腺组织中的表达量显著高于其他组织(P<0.05)。斑节对虾PmAmy基因在卵巢发育的过程中均有表达, 表达量有所变化, 虽然没有发现显著性的差异(P=0.09)。斑节对虾PmAmy在整个生长阶段的检测中都有表达, 其中幼体发育过程中存在显著性差异, 糠虾时期PmAmy表达量显著高于无节幼体、溞状幼体和仔虾时期(P<0.05)。以上实验结果初步说明了PmAmy可能与斑节对虾的幼体发育相关。     

淀粉酶产生菌的筛选、鉴定及其发酵条件优化

[背景]淀粉酶可以水解淀粉,在淀粉制糖、白酒、黄酒、啤酒和食醋等食品发酵行业有着广泛的应用.[目的]从高温酒曲中筛选获得产淀粉酶的芽孢杆菌属菌株,并对其进行分类鉴定和产淀粉酶发酵条件优化,为发酵过程提供优良的淀粉酶资源.[方法]取高温酒曲,经过富集培养和可溶性淀粉平板筛选培养基初筛,摇瓶复筛得到高产淀粉酶的菌株;通过菌...     

金针菇光受体隐花色素Ffcry基因的鉴定及其表达模式

光照对金针菇生长发育及形态建成有重要作用。光受体隐花色素(cryptochrome)是响应光信号的主要受体之一。本研究首先鉴定了黄色金针菇FL19隐花色素基因Ffcry的基因和蛋白结构,并对其启动子中的顺式作用元件进行预测,其中包含有3个光响应元件。进一步对Ffcry基因在不同光照条件下的表达模式进行了系统研究,结果显示Ffcry基因在蓝光下表达量显著高于黑暗以及其他波长的光照条件;蓝光强度则在光通量为10 μmol/(m²·s)时Ffcry表达量最高,且Ffcry在蓝光照射20 min后逐渐上调表达,在180 min后表达量趋于稳定。最后,检测金针菇子实体不同发育时期发现,Ffcry基因在幼菇期菌盖中表达量最高,其次是伸长期菌盖和成熟期菌盖。该研究为后续研究隐花色素的分子功能以及深入揭示金针菇的光形态建成奠定了基础。     

链霉菌Streptom yces olivaceusFXJ7.023多功能葡糖淀粉酶SoGA的克隆、表达及鉴定

根据海洋来源链霉菌Streptomyces olivaceus FXJ7.023基因组测序结果设计特异引物,通过PCR扩增获得1条全长为1 788 bp的糖苷水解酶15家族蛋白新成员完全编码区DNA片段,该片段编码1个595个氨基酸残基、分子量为66.2 k D的预测蛋白。利用基因工程技术将该片段重组入原核表达质粒p ET32a并转化宿主菌BL21(DE3)ply Ss,IPTG诱导融合蛋白表达,表达的包涵体融合蛋白经纯化、复性后利用DNS法测定其在不同温度、p H条件下催化不同底物产生还原糖的活性。结果表明,该酶能够水解纤维素、淀粉等多种底物产生还原糖活性,且对不同底物表现不同的最适p H和最适反应温度。     

耐高温α—淀粉酶基因在马铃薯中的表达

The thermostable alpha-amylase gene cloned from Bacillus lichemiformis was reconstructed into an expression vector pAMY721M under the CaMV35S promoter. The vector was transferred into A. tumerfaciens ABI. The thermostable alpha-amylase gene was transferred into Solanum tuberosum L. via Agrobacterium mediation according to the revised method of ZHAO Shu Juan et al (1997) and YANG Mei Zhu et al (1992). Shoots were induced and regenerated on MS medium with 2 mg/L ZT, 0.1 mg/L IAA and 100 mg/L kanamycin. Putative transformants were selected with kanamycin and roots induced on MS medium with 0.15 mg/L IAA. PCR analysis and thermostable alpha-amylase activity assay were done to identify the transgenic plantlets. Among them, 102,001, 102,607, and 110,402 were showed to have a higher alpha-amylase activity than untransformed control.     

辣椒ARF基因家族的鉴定与表达分析

为进一步研究辣椒ARF(Auxin Response Factor)基因家族在其生长发育及逆境胁迫中的作用,利用生物信息学方法从辣椒基因组中鉴定出20个ARF基因,这些基因不均匀地分布在辣椒12条染色体上。进化关系显示辣椒ARF基因可分为ClassⅠ和Ⅱ两大类,进一步可细分为Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd、Ⅰe、Ⅱa和Ⅱb等7个亚类。基因结构图表明,该基因家族由1~15个外显子构成,且各基因在不同发育时期不同组织中的表达量不同,具有一定的特异性。qRT-PCR结果表明,高盐胁迫可以明显激活或抑制ARF基因家族的表达。     

黄瓜AHP基因家族的鉴定及其非生物胁迫表达分析

组氨酸磷酸转运蛋白(AHP)是细胞分裂素信号转导途径中重要蛋白之一,在植物生长发育和抵御系列非生物胁迫过程中发挥着重要作用。探讨黄瓜AHP的分子特征与表达模式,可为进一步探究黄瓜AHP基因功能和提高植物的非生物胁迫耐受性提供理论依据。通过对黄瓜AHP基因家族成员的数量、进化关系、顺式作用元件、基因结构、发育及非生物胁迫下基因表达模式进行分析。结果表明,黄瓜AHP基因家族有7个成员,不均匀分布在6条染色体上;系统进化分析发现黄瓜AHP基因家族成员与冬瓜和甜瓜亲缘关系较近;其启动子序列主要含有光响应、低温响应、干旱响应、激素响应和防御应激等顺式作用元件;基因表达谱分析发现CsAHP1、CsAHP3和CsAHP4在非生物胁迫下显著上调或下调,且CsAHP1在开花当天表达量最高;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,CsAHP1和CsAHP3均在干旱、高温胁迫下显著上调表达,CsAHP1、CsAHP2和CsAHP5在低温弱光胁迫下显著上调表达。黄瓜AHP基因家族可能与植物发育和非生物胁迫响应有着密切的关系。     

金针菇酶促褐变的区域分布及调控

金针菇的多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性在全株中呈现区域化分布。菌盖的酶活性最低,菌柄上部酶活性稍高,菌柄中部较高,菌柄下部活性最高。用硫脲、亚硫酸盐、CaCl₂、低CO₂、低温等方法处理金针菇,对以上三种酶的活性均有抑制作用。高0₂、H₂O₂和温度的提高均促进三种酶活性。高N₂(减压后充N₂)不能抑制三种酶活性。     

金针菇免疫调节蛋白基因fip-fve在毕赤酵母GS115中诱导型和组成型表达

为获得稳定来源并且具有生物学活性的重组金针菇免疫调节蛋白(Fip-fve),将fip-fve基因转至毕赤酵母GS115中进行诱导型和组成型表达。用PCR方法从金针菇子实体基因组DNA中扩增fip-fve基因,连接至pPIC9构建诱导型表达载体pPIC9-FIP-fve,从毕赤酵母基因组DNA中扩增三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pgap),替换pPIC9-FIP-fve上乙醇氧化酶启动子(paox1)构建组成型表达载体pPIC9-PGAP-FIP-fve。将线性化的两种表达载体用PEG法转化毕赤酵母GS115,经组氨酸缺失培养基筛选和酵母菌落PCR鉴定后进行表达。结果表明,重组Fip-fve在以甲醇(1%,V/V)为碳源进行诱导型表达4 d达到最高,粗蛋白表达量为158.2 mg/L,在以葡萄糖(10%)和甘油(1%,V/V)为碳源进行组成型分别在表达第4天和第5天达到最高,粗蛋白分别为46.3 mg/L和29.5 mg/L。SDS-PAGE及Western blotting证明重组Fip-fve已正确表达,血细胞凝集活性检测初步证明重组Fip-fve具有良好生物学活性。     

金针菇固体发酵菌丝体次级代谢产物分离鉴定

采用硅胶柱色谱、ODS柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、HPLC等分离方法对金针菇大米发酵乙酸乙酯提取物进行分离,根据理化性质和波谱数据鉴定化合物结构：鉴定了4个倍半萜,包括1个新的桉叶烷型倍半萜,3个侧柏烷型倍半萜,分别是flamvelutpenol A(1),aquaticol(2),enokipodin C(3),limacellone(4)。并通过与Rh2(OCOCF3)4络合的方法确定了新化合物flamvelutpenol A(1)和limacellone(4)的绝对构型。其中化合物3具有较好的抗菌活性,对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的MIC值分别为12.5mg/L,25mg/L。且化合物1－4均是首次从该种真菌中分离得到。     

金针菇基因组测序及萜类合成关键基因分析

金针菇是我国一种重要的食药用真菌,具有较高的营养和药用价值,尤其是从金针菇中分离得到了多种麦角甾醇、倍半萜等萜类,具有抗菌、抗肿瘤和降血脂等功效。以往关于金针菇的研究多集中在营养成分、栽培和市场开发等方面,而很少报道有关生物活性成分的合成和代谢研究。从福建省金针菇主要栽培品种中获得原生质体单核化L11菌株,我们进行了金针菇基因组测序与初步分析,并利用生物信息学手段,研究了其主要的生物活性成分——萜类合成途径中的关键基因。结果显示,金针菇单孢全基因组序列长度为34.75Mb。通过分析萜类合成途径中的相关基因,确定了4个萜类合成关键基因的基因结构,并且表明其蛋白结构具有稳定性,该类基因还含有多个信号肽和跨膜结构。金针菇基因组测序的完成,为下一步功能基因的筛选、分析等研究工作奠定了基础。     

金针菇菌丝体的深层培养及多糖制取

从２０株金针菇菌株中筛选出适于液体发酵的９４Ｂ２株。该菌种适宜的摇瓶培养条件：培养温度２３～２４℃,ｐＨ６．５,接液体种量１０％,装液量≤５０ｍｌ／５００ｍｌ瓶;不同的间歇振荡形式对菌丝球产量和形态有显著影响。深层发酵工艺相似于抗生素发酵。发酵期间发酵液ｐＨ变化幅度很小,总糖、还原糖、氨基氮与菌丝生长量有一定的相关性。发酵酵的菌丝产量可达４７．５ｇ（湿重）／１００ｍｌ、胞外多糖达１７４．７ｋｇ／１００ｍｌ发酵液上清、胞内多糖达３３８．１ｍｇ／１００ｇ湿菌丝体。     

金针菇HMG-box转录因子鉴定及一个候选基因的差异表达分析

食用菌的原基形成受到环境因子和内源基因的共同调控,转录因子在其生长发育过程中能够起到关键作用。本研究在已测序金针菇单核菌株L11全基因组中鉴定到29个高速泳动蛋白（high-mobility-group box,HMG-box）转录因子编码基因。基于金针菇双核菌株H1123各发育时期转录组数据,筛选到一个与金针菇原基形成相关的HMG-box转录因子基因Fv-hmg。通过同源比对发现Fv-hmg的DNA序列在6个不同金针菇菌株中十分保守,一致性为98.38%,有92个SNP位点。克隆分析表明,该基因长度为1 517bp,含有一个内含子。该基因编码489个氨基酸残基的蛋白序列,含有一个HMG-box结构域。通过实时荧光定量PCR和转录组测序共同分析表明,该基因在金针菇原基时期的表达量比双核菌丝时期高达4倍以上,具有显著性差异（P<0.01）,由此推测该转录因子参与调控金针菇的原基形成。HMG-box转录因子Fv-Hmg在金针菇原基形成过程中的作用仍需进一步研究。     

Cloning and sequencing analysis of Trp1 gene of Flammulina velutipes

The genomic TRP1 gene from basidiomycete Flammulina velutipes was cloned by complementation of yeast Saccharomyces cerevisiae trp1 mutation. Sequencing analysis revealed that the TRP1 gene encoded a single protein consisting of three catalytic functional domains; glutamine amidotransferase, indole-3-glycerol phosphate synthase ) and N-(5'-phosphoribosyl) anthranilate isomerase, in order of NH2-glutamine amidotransferase-indole-3-glycerol phosphate synthase N-(5'-phosphoribosyl) anthranilate isomerase-COOH. The coding sequence of the TRP1 gene was interrupted by a single intron of 48 bases, the position and flanking sequences of which were highly homologous to those of basidiomycete Phanerochaete chrysosporium trpC.     

金针菇子实体有机溶剂提取物的生物活性

分别对金针菇子实体醇提物的5个萃取分部（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分部和剩余分部）进行化学成分的定性检验,以及体外抗肿瘤活性和降血糖活性的筛选。定性检验结果表明,金针菇子实体的石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取分部中含有生物碱类、有机酸类、甾类（或三萜）、黄酮类和蒽醌类物质,正丁醇萃取分部中含有氨基酸和蛋白类、糖类、甾类（或三萜）、有机酸类和黄酮类物质,剩余分部中含有氨基酸和蛋白类、糖类、甾类（或三萜）化合物。通过药理筛选发现,金针菇子实体的石油醚、正丁醇以及剩余分部具有体外抗肿瘤作用的潜力,而氯仿和乙酸乙酯分部则具有一定的细胞毒性;各萃取分部对DPP-IV活性均具有一定的抑制作用,其中氯仿和乙酸乙酯分部的抑制作用较强。     

金针菇优良品种液体发酵的研究

采用杂交育种的手段,获得了６个性能优良的金针菇杂交种。经液体发酵及菌丝体的营养分析,最终确定４０６号菌株为最优良的品种。