痢疾杆菌大质粒的快速分离与检测

质粒是细菌染色体外小的共价闭环DNA(cccDNA)。质粒的分离与检测是微生物遗传学、基因工程等研究中的基本手段之一。Kopecko叙述了痢疾杆菌大质粒的分离方法,但过程较繁。国内分离痢疾杆菌大质粒并检测其分子量的工作尚未见报道。     

驱除痢疾杆菌侵袭大质粒的新方法

用质粒不相容性原理驱除痢疾杆菌福氏 2a 2 4 5 7T和宋内S7的侵袭大质粒 ,先从福氏2a侵袭大质粒分别扩增ori和inc基因 ,将它们克隆至 pMD18 T载体 ,得重组质粒pMDori和 pMDinc ,然后转化 2 4 5 7T和S7,不管是pMDori还是 pMDinc都能竞争驱除痢疾杆菌福氏 2a 2 4 5 7T和宋内S7的侵袭大质粒。     

双向BN/SDS-PAGE分离鉴定痢疾杆菌福氏5型M90T株毒力相关膜蛋白复合物

通过蓝色非变性凝胶电泳(BN-PAGE)比较痢疾杆菌福氏5型野生株M90T和大质粒缺失株M90T△T的膜蛋白复合物,发现一个野生株特有的复合物,其分子量的为290 kD,命名为M90T-290.通过第二向SDS-PAGE分离M90T-290得到6个蛋白亚基,质谱鉴定为:一个由大质粒编码的毒力蛋白Apyrase(ATP-二磷酸水解酶)和5个染色体编码的蛋白,这些蛋白可能以膜复合物的形式影响毒力蛋白IcsA的单极性分布和痢疾杆菌在细胞间的扩散.这个新发现的毒力相关膜复合物在痢疾杆菌的致病过程中可能发挥重要作用.     

质粒在志贺氏Ⅰ型菌中与毒力相关属性及O抗原表达上的作用

<正>最近,我们曾报道过从广范围不同地理位置所分离到的志贺氏I型菌株中,绝大多数携带着四种质粒(140,6;4和2Mdal)。这一发现提示这些质粒可能在该群痢疾杆菌的某些毒力相关属性上起着某种作用。我们也分离到了仅含一种上述质粒的一些突变株。     

黄芩对去污染小鼠体内痢疾杆菌R质粒消除试验研究

本文以去污染的瑞士小白鼠为模型用黄苓对福氏痢疾杆菌F13株的R质粒进行了体内消除试验。选用红霉素、四环素和利福平对小鼠肠道进行去污染,降低其定居阻力,然后用福氏痢疾杆菌F13株经口感染,同时利用四环素造成一种选择压力,以利于对四环素耐药的F13株菌生长繁殖。利用小鼠肠道菌群重建的间隙,进行R质粒的消除试验。结果表明,黄芩对福氏痢疾杆菌F13菌株R质粒在体内具有一定的消除作用。     

巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62的质粒及nifHDK基因的定位

对从北京郊区玉米根际分离到的巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilente)Yu 62的质粒进行了分离和检测,发现检测方法不同,得到的质粒数目也不同,用Kado法只发现一个大质粒,以pABm 1表示,其分子量约为1 20 Md;而用改良的Eckhardt方法,则发现有5个大质粒,分别以p&Bm l、pABm 2、pABm 3、pABm 4和pABm 5表示,它们的分子量分别约为120 Md、330 Md、360 Md、480 Md和900 Md,部是巨型质粒,用多种方法检测均未发现小质粒。应用生物素标记的孩酸杂交技术制备了Biotin-nifHDK探针,并对Yu62菌株的质粒及染色体片段进行了Southern印迹杂交和斑点杂交,杂交结果表明nifHDK基因定位于染色体上。     

生物固氮与固氮菌质粒以及大质粒的分离(续)

五、质粒的检测和分离 1、大质粒的处理 采用通常使用于分离肠道细菌中质粒的“清亮裂解物(cleared lysate)法或类似方法从一些根瘤菌(Rhicobium)和兰细菌中获取到一些质粒。然而,它们的功能尚未查明,而且其分子量大都在70Md以下。目前已有可能分离到分子量超过300Md的质粒,而且除根瘤菌外,在固氮菌(Azotobacter)和拜叶林克氏菌(Beijerinckia)亦见到有质     

倒转停顿电场电泳在大质粒检测中的应用

利用带有电脑控制器的能周期性倒转并停顿电场的电泳检测了13株细菌的质粒。结果表明,该方法分辨率高、分离范围广(30Md—600Md),而且重现性好。应用该方法,在根隔农杆菌C58和A136菌株中检测到一条未见报道的巨大质粒,分子量>600Md;在紫云英根瘤菌S52菌株中,检测到常规电泳不能分离开的、分子量非常接近的两条大质粒。     

24株产不同抗生素的放线菌质粒的分离和鉴定

分离鉴定了中国微生物菌种保藏管理委员会保藏的24株产不同抗生素的放线菌的质粒。按改进的Kado和Liu快速法提取质粒DNA,经电泳、电镜的检测,在24株检测菌中的7株菌里分离出10个质粒,携带质粒的菌株约占检测菌株的29％。质粒DNA的分子量约为1.8—61.6 kb。通过消除质粒试验和致死接合(Ltz)反应,研究了质粒和抗生素产生的关系。     

细菌大质粒的快速分离

早期用于分离质粒DNA的方法大多数不适用于大质粒的分离。近几年来,随着遗传学实验方法的改进,从事分子生物学研究的科学家相继开发出多种快速、简便的大质粒分离技术,从很多不同种属的细菌中分离到许多大质粒,为分子遗传学的发展做出了贡献。 Eckardt报道了一种分离方法,首先将细菌细胞在Ficoll-溶菌酶混合液中初步软化,再将样品加到琼脂糖凝胶的加样孔中,用SDS裂解,然后进行电泳分离。     

黄芩甙对痢疾杆菌R质粒体外消除作用的实验研究

以携带R质粒的痢疾杆菌F_(13)株为靶细菌,以黄芩甙作为R质粒消除剂,进行R质粒体外消除试验。实验组R质粒的消除率为0.3%,对照组中SDS的消除率为0.6%,吖啶橙的消除率0.42%。琼脂糖凝胶电泳结果显示,消除子都丢失了相应的质粒带。     

细菌抗药质粒中抗性基因的易位作用

我们从临床分离的二株大肠杆菌与二株痢疾杆菌中,分别分离出带有抗药质粒ER275、ER396(所带的抗性基因为:Tc~r、Cm~r、Sm~r、Ap~r、Su~r),与DR233、DR416(所带的抗性基因为:rc~r、Cm~r、Sm~r、Su~r)。把这些抗药菌株(为了实验方便,将DR233与DR416转移到大肠杆菌C_(600)~(Rif)~r)与大肠杆菌J5-3/R144drd3(Km~r)配对,使R144drd3质粒进入上述菌株,组成二种质粒共存的菌株。在此菌株的细胞中,ER275与ER396质粒中的Ap抗     

水稻植物内生链霉菌中线型和环型质粒的检测

以广东番禺和五山地区水稻植株中分离到的内生链霉菌为对象,调查可能存在的内源质粒.利用脉冲电泳技术从8个菌株中检测到大小在60 kb～410 kb的线型质粒,其中4个菌株的线型质粒可能有保守的端粒复制基因.该结果与土壤链霉菌中检测到线型质粒和具有保守端粒复制基因的比例相似,表明水稻植物组织内部的独特环境不会造成链霉菌线型质粒的多样性分布产生大的变化.此外,从13个菌株中检测到6 kb～60 kb的环型质粒.     

氧化硫硫杆菌质粒的分离

用碱法对分离到的7株氧化硫硫杆菌进行质粒检测,在6株中分离到了18个质粒,质粒DNA的分子量为1.3×10~4-98×10~6。     

杭州地区发酵乳制品中乳酸菌发生耐药传播的安全性研究

目的对杭州地区市售发酵乳制品中分离鉴定的乳酸菌进行耐药传播的安全性分析,旨在揭示发酵乳制品中是否存在可传递耐药基因的超级耐药菌。方法自行分离鉴定的耐药乳酸菌,提取质粒并电泳分析是否存在质粒;以耐受叠氮化钠的大肠埃希菌J53作为受体菌进行质粒接合试验;若乳酸菌存在耐药现象,发现存在耐药质粒,且耐药性可通过质粒传播,评定为3级。乳酸菌存在耐药现象,发现存在耐药质粒,但接合试验未能证明耐药性可通过质粒传播,评定为2级。乳酸菌存在耐药现象,但未检测出耐药质粒,评定为1级。结果美丽健产品中分离的双歧杆菌（MLJ-G-2）和乳杆菌（MLJ-G-1）检测出含有质粒,但不会发生耐药转移,三种菌耐药危害等级分别为2、2、1。伊利产品中分离的双歧杆菌（YL-G-3）、乳杆菌（YL-G-1）、嗜热链球菌（YL-Q）检测出含有质粒,但不会发生耐药转移,四种菌耐药危害等级分别为2、2、1、2。味全产品中分离的双歧杆菌（WQ-G-3）、乳杆菌（WQ-G-1）、乳杆菌（WQ-G-2）、嗜热链球菌（WQ-Q）均检测出含有质粒,其中乳杆菌（WQ-G-1）、乳杆菌（WQ-G-2）会发生耐药转移,四种菌耐药危害等级分别为2、3、3、2。光明产品中分离的乳杆菌（GM-G-2）、乳杆菌（GM-G-3）、嗜热链球菌（GMQ）检测出含有质粒,乳杆菌（GM-G-2）会发生耐药转移,四种菌耐药危害等级分别为2、1、3、2。蒙牛产品中只分离的嗜热链球菌（MN-Q）检测出含有质粒,不会发生耐药转移,耐药危害等级为2。结论发酵乳制品中分离所得的乳酸菌81.2%的菌能检测出质粒,耐药性可能与质粒相关,存在潜在的生物安全威胁;18.8%的菌的耐药性可通过质粒接合发生传播,存在直接的生物安全威胁。     

痢疾杆菌酸抗性系统相关基因缺失突变体的构建

依赖于谷氨酸脱羧酶的酸抗性系统对痢疾杆菌在宿主细胞内的生存和繁殖至关重要,hdeA、hdeB、yhiE和yhiF是其中几个重要的酸抗性基因。借助Red系统的重组功能,PCR扩增两翼与目的基因上下游同源的抗性基因片段,电击转化痢疾杆菌2457T,对筛选到的阳性转化子再导入编码FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20以去除抗性基因。结果成功的敲除了hdeA、hdeB、yhiE和yhiF等4个酸抗性系统相关基因,为深入研究痢疾杆菌酸抗性基因的调控网络奠定了基础.     

来自海南等地的17个Bt分离株质粒多样性分析

本研究采用琼脂糖凝胶电泳对分离白海南岛的12个Bt菌株与分离自广西、黑龙江的5株Bt菌株及2株Bt模式菌株进行质粒数量、大小等特征分析.19个供试菌株可区分为16种独特的质粒电泳图谱,充分显示出不同来源bt菌株的质粒多样性.进一步选择了其中的10个菌株,利用包埋法制备琼脂块进行脉冲场凝胶电泳(PFGE),结果表明苏云金芽孢杆菌大质粒组成特征也具有丰富多样性.但是供试菌株的质粒电泳图谱并未体现与地理和生态特征相关联的特征差异.研究结果初步证实海南分离株S3078-1是一株无内生质粒的Bt菌株,而S3031-1和S3073-1两个分离株仅有一个大质粒存在,这三个分离株将为进一步研究质粒功能提供初始菌株.本研究进一步暗示将琼脂糖凝胶电泳和脉冲场凝胶电泳结合起来研究质粒特征提高了结果的可靠性.     

基因芯片技术检测3种肠道病原微生物方法的建立

目的:建立一种运用多重PCR和基因芯片技术检测和鉴定伤寒沙门氏菌、痢疾杆菌和单核细胞增生利斯特菌的方法。方法:分别选取伤寒沙门氏菌染色体ViaB区域中编码调控Vi抗原表达的基因(vipR)、痢疾杆菌编码侵袭质粒抗原H基因(ipaH)和单核细胞增生利斯特菌溶血素基因(hlyA)设计引物和探针,探针3'端进行氨基修饰,下游引物标记荧光素Cy3。在优化的PCR和杂交反应条件下,进行三重PCR扩增,产物与包括3种致病菌特异性探针的基因芯片杂交。在评价基因芯片的特异性和灵敏度之后,对临床样本进行检测。结果:只有3种目的致病菌的PCR产物在相应探针位置出现特异性信号,其他阴性细菌均无信号出现;3种致病菌的检测灵敏度均可达到103CFU/mL;检测30例临床样本的结果与常规细菌学培养结果一致。结论:所建立的可同时检测伤寒沙门氏菌、痢疾杆菌和单核细胞增生利斯特菌的基因芯片方法快速、准确,特异性高,重复性好,为3种肠道致病菌的快速检测和鉴定提供了新方法和新思路。     

尼泊尔马桑根瘤内生菌纯培养物的质粒检测

采用胶内裂解法快速检测了21株马桑根瘤内生菌纯培养物和4株弗兰克氏菌参考菌株的质粒,其中有5株马桑分离菌株和1株参考菌株含有质粒。除马桑菌株和参考菌株各有1株携带2个质粒外,其它菌株均只含有1个质粒。这些质粒的分子量约为13～20kb。根据所含质粒的大小和数目,将21株马桑分离菌株划分成4个质粒类群。实验还对菌丝体生长,细胞酶解和裂解等条件对质粒检测效果的影响进行了探讨。     

链霉菌质粒的复制与进化

近年来, 随着大质粒提取和检测技术的发展, 尤其是高通量DNA测序技术的应用, 使得链霉菌大的环型质粒和线型质粒的研究取得了较快的进展。相比于研究透彻的细菌Theta型复制的质粒, 链霉菌Theta型质粒在复制区的结构、复制蛋白和调控蛋白作用的分子机理等方面具有多样性和新颖性。新鉴定的许多线型质粒的中心复制区表明中心复制的起始可以靠近端粒, 一个质粒也可以有2个以上的复制区。新分离的端粒序列显示端粒“折返”不是必需的, 而形成二级结构对于端粒复制是重要的。链霉菌环型和线型质粒的测序分析显示它们之间存在亲缘关系。环型质粒可以与噬菌体共整合, 实验证明它们在一定条件下可以相互转换。这些研究结果表明, 链霉菌环型、线型质粒和噬菌体从结构到功能到进化具有多样性、新颖性和亲缘关系。