用RAPD技术对罗非鱼遗传变异的研究及应用

应用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术检测了一个奥利亚罗非鱼（au）和湘湖（nx)、美国（nm)、沙市（np）三个尼罗罗非鱼养殖群体（Table1)。在20外引物（Table2）中筛选到12个引物,它们的扩增物显示了罗非鱼和尼罗罗非鱼二者在群体内或群体间存在遗传差异。其中（Fig.1),OPZ06、OPZ16、OPZ12和OPZ19四个引物分别有一个扩增片段具有种的特异性。它们的大小分别是900、1500、1700和730bp。可以作为鉴别罗非鱼和尼罗罗非鱼二者的分子遗传标记,湘湖（nx）、美国（nm）和沙市（np）三个尼罗罗非鱼群体都保留了较高水平的遗传变异。而奥利亚罗非鱼（au）的群体内遗传变异最小。奥利亚罗非鱼（au）与湘湖（nx）、美国（nm)、沙市（np）三个尼罗罗非鱼群体之间的遗传距离分别是0．285、0．262和0．344（Table3）,说明奥利亚罗非鱼（au）和沙市尼罗罗非鱼（np）杂交将可能产生较强的杂种优势。     

应用RAPD技术分析奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼的基因多态性(英文)

以随机扩增多态ＤＮＡ技术（ＲＡＰＤ）分析了奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼两个养殖群体的群体内及群体间遗传关系,并探讨了该技术在种群鉴定中的应用。ＲＡＰＤ引物筛选结果表明,所测试的２０个随机引物中（Ｔａｂｌｅ　１）,除一个引物未扩增出任何片段外,其余１９个引物均扩增出１～１１个大小不等的片段,长度大部分在５００～３０００ｂｐ之间,共扩增出２２０个片段,平均每个引物产生５．５个片段。两群体间共有片段７０条,大部分引物的扩增产物具有种间多态性,种群间相似系数为０．７２７。以筛选的引物对两种群不同个体（Ｆｉｇ．１,Ｔａｂｌｅ２）及种群混合样品（Ｆｉｇ．２,Ｔａｂｌｅ３）进行ＲＡＰＤ分析。结果表明,不同引物在扩增图谱上表现很大差异。奥利亚罗非鱼不同个体间表现为一致的扩增图谱,种内相似系数达１０００,显示了其种群内遗传变异的缺乏;尼罗罗非鱼种内相似系数为０．８２７,个体间存在不同程度的多态性;两个种群间的相似系数分别为０．７６７和０．７４２,表明种间有较高的同源性,遗传距离为０．２３５,略低于国外的报道、此外,两个养殖群体间的扩增图谱比较也暗示了遗传渐渗现象的存在。实验表明,ＲＡＰＤ标记可以作为一种可靠的遗传标记,用于不同鱼     

应用RAPD技术分析奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼的基因多态性

以随机扩增多态DNA技术(RAPD）分析了奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼两个养殖群体的群体内及群体间遗传关系,并探讨了该技术在种群鉴定中的应用。RAPD引物筛选结果表明,所测试的20个随机引物中(Table 1),除一个引物未扩增出任何片段外,其余19个引物均扩增出1～11个大小不等的片段,长度大部分在500—3000bp之间,共扩增出220个片段,平均每个引物产生55个片段。两群体间共有片段70条,大部分引物的扩增产物具有种间多态性,种群间相似系数为0.727。以筛选的引物对两种群不同个体(Fig．1,Table 2)及种群混合样品(Fig.2,Table 3)进行RAPD分析。结果表明,不同引物在扩增图谱上表现很大差异：奥利亚罗非鱼不同个体间表现为一致的扩增图谱,种内相似系数达1000,显示了其种群内遗传变异的缺乏;尼罗罗非鱼种内相似系数为0．827,个体间存在不同程度的多态性;两个种群间的相似系数分别为0．767和0.742,表明种间有较高的同源性,遗传距离为0．235,略低于国外的报道．此外,两个养殖群体间的扩增图谱比较也暗示了遗传渐渗现象的存在。实验表明,RAPD标记可以作为一种可靠的遗传标记,用于不同鱼类种群的鉴定,RAPD分析方法是一种快速,简便且行之有鼓的鉴定鱼类种群的方法。     

四个奥利亚罗非鱼群体的微卫星分析

应用筛选到的19对微卫星引物,对四个不同来源的奥利亚罗非鱼（Oreochromis aureus）群体（奥利亚罗非鱼83系、奥利亚罗非鱼02系、奥利亚罗非鱼05系和红色奥利亚罗非鱼）的基因组DNA进行PCR扩增,分析其群体遗传结构和亲缘关系。根据几个群体在19个位点上的PCR扩增图谱,统计计算各群体的遗传多样性指数。四个群体的平均观测遗传杂合度值在0．154—0．391间;平均预期杂合度在0．181—0．428间;平均多态信息含量值在0．1513—0．3882间,说明它们的遗传多样性水平较低。遗传偏离指数D的评估结果显示这4个群体有多个位点存在不同程度的Hardy—Weinberg遗传平衡偏离。运用MicroChecker软件进行零等位基因预测,结果显示除红色奥利亚罗非鱼群体外,其他3个群体中均可能存在零等位基因位点。各群体零等位基因的位点数分别为：83系1个,02系3个,05系7个,红奥群体为0。零等位基因位点的存在可能是导致位点发生Hardy—Weinberg遗传平衡偏离的原因之一。4个群体中,05系群体与83系群体间的遗传相似性系数最高（0．9422）,遗传距离最小（0．0596）,说明两者亲缘关系最近;83系群体与红奥群体的遗传相似性系数最低（0．6977）,遗传距离最大（0．3599）,可推断两者亲缘关系最远。根据群体间的遗传距离采用UPGMA法进行聚类,结果表明：83系首先与05系聚类为一支,然后与02系群体聚类,最后与红奥群体聚类。聚类结果说明红奥群体与其他三个群体亲缘关系最远;83系群体与05系群体亲缘关系最近,与02系群体次之。     

吉丽罗非鱼(尼罗罗非鱼♀×萨罗罗非鱼♂)及其两亲本遗传变异的微卫星分析

吉丽罗非鱼是由耐盐性较强的萨罗罗非鱼做父本与生长速度较快的尼罗罗非鱼做母本进行杂交、杂交后代自交产生,2009年全国水产原良种审定委员会审定为养殖新品种。为了分析吉丽罗非鱼及其两亲本遗传特性,选择有代表性的6对微卫星引物,对这3种罗非鱼遗传变异进行研究分析。研究结果表明:(1)6对微卫星引物扩增产物片段大小为180～350bp,共发现21个等位基因,鱼类群体间、微卫星座位间及等位基因间都存在极显著差异。(2)有效等位基因数(Ne)、Nei's基因多样指数(H)和多态信息含量(PIC)值等群体遗传多样性指标都是吉丽罗非鱼>尼罗罗非鱼>萨罗罗非鱼,吉丽罗非鱼PIC值达到了0.657,属于高度多态性。(3)吉丽罗非鱼与萨罗罗非鱼的遗传距离要比与尼罗罗非鱼的近,萨罗罗非鱼对吉丽罗非鱼的遗传影响要大于尼罗罗非鱼。     

微卫星标记分析罗非鱼群体的遗传潜力

利用25个微卫星标记,对奥利亚罗非鱼2个群体["夏奥1号"(ZA)、广西群体(GA)]和尼罗罗非鱼4个群体[埃及品系(ZN)、88品系(XN)、广西群体(GN)、美国品系(MN)]进行检测。共检测到7 775个扩增片段,长度在100~400 bp;等位基因数3~8个不等,共计143个等位基因;平均每个基因座扩增得到5.72个等位基因。各群体平均观测杂合度(H o)在0.7253~0.8160之间,平均期望杂合度(He)在0.5146~0.6834之间,平均多态信息含量(PIC)在0.4212~0.6105之间,平均有效等位基因数(A e)在2.20~3.23之间。ZA与GA遗传相似系数最高(0.9130),ZA与ZN遗传相似系数最低(0.4352)。总的说来,4个尼罗罗非鱼群体的遗传潜力较高,2个奥利亚罗非鱼群体的遗传潜力适中。     

奥利亚罗非鱼DMRT1,DMO基因片段的克隆及序列分析

根据其他鱼类DMRT基因中的保守序列设计了一对简并引物,利用RT-PCR扩增了雌雄奥利亚罗非鱼的DMRT基因,并对其扩增产物进行了克隆与测序。结果在雌雄奥利亚罗非鱼个体中获得了两个不同的片段,分别命名为DMO,DMRT1基因。序列同源性分析表明,奥利亚罗非鱼DMRT1,DMO cNA系列的同源性为61.78%,氨基酸同源性为86%,说明了DMRT基因存在性别差异。与尼罗罗非鱼、红鳍东方豚、虹鳟、青鱼将等鱼类DM保守区相比,氨基酸序列同源性为86%-100%,这充分显示了DM-RT基因在进化上的高度保守性。     

布氏罗非鱼微卫星位点筛选和群体遗传多样性分析

为阐明布氏罗非(Tilapia buttikoferi)群体遗传变异和遗传结构状况,采用50个尼罗罗非鱼特异性的微卫星分子标记对45个布氏罗非鱼个体进行遗传检测.结果有27对引物能获得稳定的特异性条带,占总数的54%,其中16个多态性微卫星座位共检测出52个等位基因.每个座位的等位基因数为2～6之间,平均每个座位为3.24;平均观测杂合度(Ho)为0.5266,平均期望杂合度(He)为0.5237,平均多态信息含量为0.4652,表明布氏罗非鱼群体遗传多样性较丰富,种群结构处于合理状态.     

五个红罗非鱼群体的遗传多样性分析

实验采用微卫星标记技术,选用22对微卫星引物对5个红罗非鱼群体进行遗传多样性分析。经PCR扩增,16个微卫星位点扩增产物在关岛红罗非鱼（GD）、珍珠白红罗非鱼（ZZ）、佛罗里达红罗非鱼（FL）、明月红罗非鱼（MY）、马来西亚红罗非鱼（ML）中均获得了清晰稳定的条带。分析结果显示:16个微卫星标记共检测到146个等位基因。5个群体的平均等位基因数（N_a）在6.5625-8.5625,平均有效等位基因数（N_e）在4.1495-6.1330,平均杂合度（H_e）在0.7491-0.8247,平均多态信息含量（PIC）在0.6939-0.7840,说明它们的遗传多态性丰富。卡方检验表明5个红罗非鱼群体的大部分位点偏离Hardy-Weinberg平衡。在5个群体中,关岛红罗非鱼（GD）与珍珠白红罗非鱼（ZZ）遗传相似系数（0.6171）最小,遗传距离（0.4827）最大,说明两者亲缘关系最远;佛罗里达红罗非鱼（FL）与马来西亚红罗非鱼（ML）遗传相似系数（0.9069）最大,遗传距离（0.0977）最小,可推断两者亲缘关系最近。采用UPGMA进行聚类分析,结果表明:佛罗里达与马来西亚先聚成一支,二者再与珍珠白聚在一起,接着三者与明月聚在一起,最后,四者与关岛聚到一起。聚类结果说明关岛群体与其他4个群体亲缘关系最远;佛罗里达与马来西亚亲缘关系最近,珍珠白群体次之,明月群体再次之。以上结果可推断5个红罗非鱼群体遗传多态性丰富,具有较大的选育潜力。     

奥利亚罗非鱼与尼罗罗非鱼rDNA内转录间隔区序列特征

核糖体DNA内转录间隔区(internal transcribed spacers,ITS)是经常被用作种和种群水平系统研究的分子序列.本文分离了奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)、尼罗罗非鱼(O.niloticus)内转录间隔区,包括部分185序列,ITS1、5.8S、ITS2全序列及部分28S序列.4尾奥利亚罗非鱼的10个克隆序列分析表明,其存在长度不同的a、b两种类型ITS1.a型长为536 bp,GC含量为69.96%;b型长为520 bp,GC含量为69.04%～69.42%.4尾尼罗罗非鱼的10个克隆序列分析表明,其只存在a型ITS1,长为536～540 bp,GC含量为69.42%～70.19%.与b型ITS1相比,a型ITS1在16～31 nt有16 bp片段(GGCCCGCCTCGGCGC)的插入.奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼共20条ITS序列中,5.8S长度均为157 bp,GC含量为56.69%～57.96%;ITS2为408 bp,GC含量为72.79%～74.26%.奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼ITS区序列相似性高达98.2%,表明这两种罗非鱼亲缘关系很近.此外,本文对14尾奥利亚罗非鱼、15尾尼罗罗非鱼以及15尾奥尼罗非鱼[O.aureus(♂)×O.niloticus(♀)]ITS1的扩增结果显示,奥利亚罗非鱼均有a、b两种类型ITS1;15尾尼罗罗非鱼中1尾为a、b两类型ITS1,14尾为a型ITS1;15尾奥尼罗非鱼中则有6尾具有a、b两类型ITS1,9尾为单一的a型ITS1.分析表明,奥利亚罗非鱼在ITS1这个位点一致性高,但尼罗罗非鱼中有1尾混杂了奥利亚罗非鱼的基因,同时也说明分子生物学手段应用于种质鉴定比形态学手段更为精确.     

遗传改良"新吉富" (NEW GIFT)尼罗罗非鱼RAPD-SCAR标记开发及其在品系鉴别中的应用

“新吉富”(NEW GIFT)尼罗罗非鱼是以1994年引进的 “吉富”(GIFT)品系尼罗罗非鱼为基础群体,经过14年9代系统选育后获得的新品种,该品种已被国家审定为良种,已在全国推广,迫切需要有效的分子遗传标记来鉴别该新品种并实施科学管理。该研究对良种群体开展了RAPD分析,并进一步将特异性的RAPD标记转化成了稳定的SCAR标记。 通过对“新吉富”群体的RAPD分析,找到了两个品种特异性的RAPD条带（S₃₀₄^{624 bp}和S₃₆^{568 bp}）。对品种特异性的RAPD条带进行了胶回收、克隆和序列测定。根据测序结果设计了两对位点特异性引物来扩增这两个品种特异性条带（简称SCAR标记Ⅰ和Ⅱ）,检测这两个SCAR标记在“新吉富”、“吉富”以及国内外7个养殖品系中的出现频率。SCAR标记Ⅰ（553 bp）在“新吉富”群体中的出现频率为85.7%,而在其基础群体（“吉富”）中的出现频率仅为16.7%;SCAR标记Ⅱ（558 bp）在“新吉富”群体中的出现频率达到91.4%,但在其它7个养殖品系中的出现频率仅在0%～70%之间。为验证这两个标记的可靠性,检测了这两个标记在一个埃及罗非鱼野生群体中的出现频率,发现SCAR标记Ⅰ和SCAR标记Ⅱ的出现频率分别为10%和70%,远低于在“新吉富”群体中的出现频率。这两个SCAR标记在“新吉富”良种群体中的高出现频率,预示它们可能与生长性能相关QTL位点间存在连锁关系,显示SCAR标记技术对选育世代间的纵向追溯、以及选育良种群体与其它养殖品系间的横向鉴别有较好应用前景。     

我国新引进吉富品系尼罗罗非鱼群体的遗传多样性分析

选取罗非鱼(Oreochromis spp.)第二代遗传连锁图谱中的26个微卫星位点,对淡水渔业研究中心引进的、由60个家系组成的吉富品系尼罗罗非鱼(O.niloticus)群体进行遗传结构分析。结果显示,26个微卫星位点在吉富罗非鱼群体中共检测到124个等位基因,各位点的等位基因数为3～7个,平均4.8个。片段长度104～322 bp,平均杂合度观测值为0.622 1,平均杂合度期望值为0.642 3,平均多态信息含量(PIC)为0.633 4。所检测的26个位点中,有25个位点属于高度多态位点(PIC0.5),占所检测位点的96.15%;1个位点属于中度多态位点。结果表明,该吉富罗非鱼群体多态信息含量丰富,遗传多样性水平较高。因而该群体仍然具有较大的选育潜力,可以作为选育的基础群体开展进一步的选育工作。     

Copy Number Variations in Tilapia Genomes

Discovering the nature and pattern of genome variation is fundamental in understanding phenotypic diversity among populations. Although several millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) have been discovered in tilapia, the genome-wide characterization of larger structural variants, such as copy number variation (CNV) regions has not been carried out yet. We conducted a genome-wide scan for CNVs in 47 individuals from three tilapia populations. Based on 254 Gb of high-quality paired-end sequencing reads, we identified 4642 distinct high-confidence CNVs. These CNVs account for 1.9% (12.411 Mb) of the used Nile tilapia reference genome. A total of 1100 predicted CNVs were found overlapping with exon regions of protein genes. Further association analysis based on linear model regression found 85 CNVs ranging between 300 and 27,000 base pairs significantly associated to population types (R ² > 0.9 and P > 0.001). Our study sheds first insights on genome-wide CNVs in tilapia. These CNVs among and within tilapia populations may have functional effects on phenotypes and specific adaptation to particular environments.     

奥利亚罗非鱼Piwi基因的克隆与生物信息学分析

Piwi基因是影响鱼类生殖细胞发育的重要因子。通过设计特异引物,以奥利亚罗非鱼的精巢RNA为模板,通过PCR扩增和克隆测序,获得了两种基因序列,分别长2 571 bp和3 204 bp。通过生物信息学分析,表明这两个片段与尼罗罗非鱼的Piwil-1和Piwil-2相似性都达到99%。通过翻译,Piwil-1和Piwil-2的蛋白序列具有典型的PAZ和Piwi结构域。因此,这两个基因为奥利亚罗非鱼的Piwil-1和Piwil-2基因。另外,生物信息学分析也表明Piwil-1和Piwil-2在一级结构和二级结构上十分相似,说明在奥利亚罗非鱼基因组中这两个基因分化时间则较短。本研究为后续研究鱼类生殖机理和罗非鱼进化研究奠定了基础。     

Assessing the genetic diversity of farmed and wild Rufiji tilapia (Oreochromis urolepis urolepis) populations using ddRAD sequencing

Rufiji tilapia (Oreochromis urolepis urolepis) is an endemic cichlid in Tanzania. In addition to its importance for biodiversity conservation, Rufiji tilapia is also attractive for farming due to its high growth rate, salinity tolerance, and the production of all‐male hybrids when crossed with Nile tilapia (Oreochromis niloticus). The aim of the current study was to assess the genetic diversity and population structure of both wild and farmed Rufiji tilapia populations in order to inform conservation and aquaculture practices. Double‐digest restriction‐site‐associated DNA (ddRAD) libraries were constructed from 195 animals originating from eight wild (Nyamisati, Utete, Mansi, Mindu, Wami, Ruaha, Kibasira, and Kilola) and two farmed (Bwawani and Chemchem) populations. The identified single nucleotide polymorphisms (SNPs; n = 2,182) were used to investigate the genetic variation within and among the studied populations. Genetic distance estimates (F_st) were low among populations from neighboring locations, with the exception of Utete and Chemchem populations (F_st = 0.34). Isolation‐by‐distance (IBD) analysis among the wild populations did not detect any significant correlation signal (r = .05; p‐value = .4) between the genetic distance and the sampling (Euclidean distance) locations. Population structure and putative ancestry were further investigated using both Bayesian (Structure) and multivariate approaches (discriminant analysis of principal components). Both analysis indicated the existence of three distinct genetic clusters. Two cross‐validation scenarios were conducted in order to test the efficiency of the SNP dataset for discriminating between farmed and wild animals or predicting the population of origin. Approximately 95% of the test dataset was correctly classified in the first scenario, while in the case of predicting for the population of origin 68% of the test dataset was correctly classified. Overall, our results provide novel insights regarding the population structure of Rufiji tilapia and a new database of informative SNP markers for both conservation management and aquaculture activities.     

The impacts of invasive Nile tilapia (Oreochromis niloticus) on the fisheries in the main rivers of Guangdong Province,China

Nile tilapia (Oreochromis niloticus) is one of the most widespread invasive fish species, and this species has successfully established populations in the major rivers of Guangdong Province, China. Field surveys and manipulative experiments were conducted to assess the impacts of Nile tilapia on fisheries. We determined that the increase of Nile tilapia in these rivers not only affects the CPUE (catch-per-unit-per-effort) of the fish community and native fish species but also reduces the income of fishermen. In the manipulative experiments, we observed that the growth of native mud carp decreased in the presence of Nile tilapia. Our results suggest that the invasion of Nile tilapia negatively affected the fishery economy and native fish species, and suitable control measurements should be taken.     

尼罗罗非鱼ghrelin基因的多态性及其与生长性状相关SNP位点的筛选

为了研究尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)生长激素促分泌素基因(ghrelin)的多态性及其与生长的相关性, 研究以两个尼罗罗非鱼群体(快长群体和基础群体)的DNA样本各40份为模板, 通过PCR扩增和测序获得ghrelin基因序列。通过Dnasp v5和MEGA 5.0分析序列多态性、筛选有效SNP 位点; 采用Snapshot法对两个群体子代ghrelin基因中SNP位点进行基因分型, 然后分析SNP位点基因型与生长性状的相关性。结果表明, 快长群体ghrelin基因中的单核苷酸变异位点数(S)比基础群体要少, 而核苷酸多态性(Pi)和平均核苷酸差异数(K)要略高于基础群体。共筛得3个有效SNP 位点(S1、S2和S3), 均分布于第1个内含子中。遗传结构分析表明, 3个SNP 位点在两个群体的子代中均为低度多态性位点(PIC0.25), 但处于Hardy-Weinberg平衡(P0.05);快长群体子代中3个SNP 位点的观测杂合度、期望杂合度和多态信息含量等遗传多样性参数均小于基础群体子代的相应值, 3个SNP 位点的遗传多样性参数、基因型和基因频率在同一群体中高度一致, SNP 位点之间完全连锁。两个群体子代中3个SNP 位点处的优势基因型相同, 但快长群体子代中优势基因型频率要明显大于基础群体子代中相应基因型频率。对两个群体子代的生长性状与SNP基因型进行关联性分析的结果表明,尼罗罗非鱼个体的多项生长指标(体重、体长、体高、头长和尾柄高等)在不同基因型中存在显著差异(S1:GG AG, S2:TT AT, S3:AA AT)(P0.05)。D1双倍型(S1:GG, S2:TT, S3:AA)所对应的尼罗罗非鱼个体的多项生长指标(体重、体长、体高、头长和尾柄高等)显著高于D2双倍型(S1:AG, S2:AT, S3:AT)。以上结果表明, 尼罗罗非鱼ghrelin基因3个SNP 位点完全连锁, D1双倍型与快长性状密切相关, 可作为尼罗罗非鱼分子标记辅助育种的候选标记。     

Circadian Rhythms of Locomotor Activity in the Nile Tilapia Oreochromis niloticus

Behavioral rhythms of the Nile tilapia were investigated to better characterize its circadian system. To do so, the locomotor activity patterns of both male and female tilapia reared under a 12:12 h light-dark (LD) cycle were studied, as well as in males the existence of endogenous rhythmicity under free-running conditions (DD and 45 min LD pulses). When exposed to an LD cycle, the daily pattern of activity differed between individuals: some fish were diurnal, some nocturnal, and a few displayed an arrhythmic pattern. This variability would be typical of the plastic circadian system of fish. Moreover, reproductive events clearly affected the behavioral rhythms of female tilapia, a mouth-brooder teleost species. Under DD, 50% (6 of 12) of male fish showed circadian rhythms with an average period (τ) of 24.1±0.2 h, whereas under the 45 min LD pulses, 58% (7 of 12) of the fish exhibited free-running activity rhythms with an average τ of 23.9±0.5 h. However, interestingly in this case, activity was always confined to the dark phase. Furthermore, when the LD cycle was reversed, a third of the fish showed gradual resynchronization to the new phase, taking 7–10 days to be completely re-entrained. Taken together, these results suggest the existence of an endogenous circadian oscillator that controls the expression of locomotor activity rhythms in the Nile tilapia, although its anatomical localization remains unknown.