代谢工程改造大肠杆菌一碳模块高效合成L-甲硫氨酸

L-甲硫氨酸又名L-蛋氨酸,是人体必需8种氨基酸之一,在饲料、医药、食品领域具有重要应用。以实验室前期构建的M2(Escherichia coli W3110?IJAHFEBC/PAM)为出发菌株,以模块化代谢工程策略构建了一株L-甲硫氨酸高产菌株。首先通过过表达亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MetF)和筛选不同来源的丝氨酸羟甲基转移酶(hydroxymethyltransferase,GlyA),增强了一碳模块甲基供体的生成,优化了一碳模块。随后针对一碳模块的前体供应,过表达了胱醚裂解酶(cysteamine lyase,MalY)和半胱氨酸内运基因(fliY),有效地提高了L-高半胱氨酸和L-半胱氨酸的供应。最终摇瓶发酵L-甲硫氨酸的产量由2.8 g/L提高至4.05 g/L,5 L发酵罐中达到18.26 g/L。研究结果表明,一碳模块对L-甲硫氨酸的生物合成具有十分重要的影响,在细胞内通过优化一碳模块,可以实现L-甲硫氨酸的高效生物合成。本研究为进一步提高微生物发酵生产L-甲硫氨酸的水平奠定了基础。     

微生物发酵法生产L-丝氨酸及L-半胱氨酸研究进展

L-丝氨酸及L-半胱氨酸在食品、医药和化妆品等行业有着广泛的应用,在植物和微生物中两者从头合成的前体物均为3-磷酸甘油酸。微生物发酵生产这两种氨基酸以其社会、经济及环境效益展现出良好的前景。针对近年来微生物发酵法生产L-丝氨酸及L-半胱氨酸的研究成果,本文综述了当前国内外学者在该领域研究的热点,即代谢途径及其调节、相关氨基酸的转运及运输、菌种及菌株改造、新菌种的开发等。最后结合当前生物技术的新发展,对今后的研究方向进行了展望。     

微生物酶法转化生产L-半胱氨酸的工艺研究

L-半胱氨酸(Cys)侧链巯基是构成蛋白质活性基团的重要氨基酸,在生物化学、医药、食品、饲料、化妆品等行业具有广泛的用途,国内外的需求量逐年增长.然而,Cys难以通过单纯的微生物发酵来进行生产;由于化学合成的步骤繁多,也很难进行化学合成.传统生产方法沿用毛发酸解制取L-半胱氨酸,收率低,能耗高,水解过程产生难闻气体及大量废酸,环境污染严重.     

代谢过程中相关氨基酸对高密度发酵生产腺苷蛋氨酸的影响

对清酒酵母高密度发酵生产S-腺苷-L-蛋氨酸（SAM）代谢过程中的相关氨基酸进行了考察。分别考察了十二种氨基酸对生物量和SAM产量的影响。实验发现L-胱氨酸、L-半胱氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸和L-蛋氨酸对SAM的积累有利,其中L-赖氨酸和L-组氨酸可以提高生物量,进而提高SAM的产量;L-胱氨酸、L-半胱氨酸和L-蛋氨酸可以提高SAM的含量,但是会抑制生物量的增长。通过3种补加方式的比较,得到最优的补加方式为：L-赖氨酸和L-组氨酸在培养基中加入,L-胱氨酸,L-半胱氨酸和L-蛋氨酸采取在发酵过程前24h流加。通过正交实验确定补加量为：L-赖氨酸为1g／L,L-组氨酸为1g／L,L-胱氨酸为1．5g／L,L-半胱氨酸为1g／L,L-蛋氨酸为1g／L。将此结果应用于5L发酵罐培养,SAM最高产量为5．53g/L,生物量为128g／L。     

五种食用菌氨基酸含量的测定及营养评价

研究测定了五种食用菌中氨基酸的含量,并利用五种非生物学指标对蛋白质的营养价值进行评价。五种食用菌氨基酸种类齐全,必需氨基酸占氨基酸总量的百分比分别达到45.94%、37.62%、42.45%、41.54%、35.98%。茶树菇和姬松茸的限制性氨基酸为半胱氨酸和甲硫氨酸,鸡腿菇、香菇和黑木耳的限制性氨基酸是缬氨酸。不同的评价指标对蛋白质进行营养评价,评价结果会有所差异。     

甲硫氨酸γ-裂解酶基因在大肠杆菌中的高效表达和活性

【背景】为了开发海洋蕴藏的新型微生物资源,本研究团队采用不依赖培养的宏基因组技术,构建了深海宏基因组文库,并对其中的重要基因进行后续研究。【目的】使用来自深海宏基因组文库中的甲硫氨酸γ-裂解酶基因(mgl)在大肠杆菌中高效表达并对其活性进行检测。【方法】将mgl基因克隆到表达载体pET-28a(+)并转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,并对表达条件进行优化,获得甲硫氨酸γ-裂解酶(Methionine-lyase,r MGL)的大量表达。亲和层析纯化重组蛋白后对酶的活性进行研究。【结果】亲和纯化后获得大量表达蛋白r MGL,大小与预测的46 kD相符合,并具有很高的裂解L-甲硫氨酸的活性。r MGL能催化L-甲硫氨酸和DL-同型半胱氨酸的裂解,但几乎不作用于L-半胱氨酸和L-胱氨酸,其中对DL-同型半胱氨酸的催化效率比对L-甲硫氨酸的催化效率高,相对活性约为对L-甲硫氨酸催化效率的1.4倍。【结论】来自深海宏基因组文库中的mgl基因能够利用p ET-28a(+)/BL21(DE3)高效表达r MGL。     

基于碳硫模块平衡策略的大肠杆菌高产L-半胱氨酸菌株构建

l-半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸,因其多样的生理功能,l-半胱氨酸在医药、化妆品和食品工业中有着广泛的应用。模块化代谢工程策略在细胞工厂的构建中具有极大的潜力。本研究利用碳硫模块协同表达策略进行大肠杆菌的l-半胱氨酸合成途径构建,构建了一株l-半胱氨酸合成基因工程菌。首先,通过增强l-半胱氨酸前体物质l-丝氨酸(serA^f、serB和serC^Cg)的生物合成以及转录调控因子CysB的表达,l-半胱氨酸的产量由0提高到(0.38±0.02)g/L。然后,通过促进l-半胱氨酸转运和无机硫源的吸收同化、减弱l-半胱氨酸和l-丝氨酸的降解以及异源表达cysE^f和cysB^St,l-半胱氨酸的产量提升至(3.82±0.01)g/L。最后,为了优化碳模块和硫模块的代谢通量,协同表达硫酸盐同化途径与硫代硫酸盐同化途径的基因cysM、nrdH、cysK以及cysIJ,得到l-半胱氨酸高产菌株。在500mL摇瓶和2L发酵罐中分别实现了(4.17±0.07)g/L和(11.94±0.1)g/L的l-半胱氨酸积累。研究结果表明,在细胞内通过对硫碳模块间代谢通量的协调控制,可以实现l-半胱氨酸的高效生物合成。研究结果为微生物发酵生产l-半胱氨酸的产业化奠定了基础。     

含硫氨基酸对猪生长性能及肠道功能的影响机制

含硫氨基酸包括甲硫氨酸(又名蛋氨酸)、胱氨酸和半胱氨酸,其中蛋氨酸是动物的含硫必需氨基酸,是猪必不可少的营养元素。研究表明,科学地添加含硫氨基酸对猪的摄食、生长、免疫等方面有着重要的作用。肠道是消化、吸收营养物质最主要的场所,含硫氨基酸的主要代谢产物谷胱甘肽可促进肠道屏障功能的恢复,牛磺酸能参与抗氧化反应、渗透调节等生理过程。因此,添加适量的含硫氨基酸有助于提高猪的生长性能,维持猪的肠道健康。     

氨基酸对于Monascus ruber生物合成Monacolin K影响的研究

在Monacolin K发酵中添加氨基酸后发现较高质量浓度的氨基酸高度抑制了Monacolin K的产量。0.1 g.L-1的D-甲硫氨酸在发酵第4 d添加可以提高产量30%以上,而L-甲硫氨酸则没有此功能,D,L-甲硫氨酸因D-甲硫氨酸的关系也有一定的增产效果。以甲硫氨酸代替蛋白胨作为主要氮源,则抑制了polyketide途径的前期步骤,因此严重抑制了色素及Monacolin K的生产。另外,发现1 g.L-1的L-苯丙氨酸的添加时间越早越有利于Monacolin K的生产,在起始时添加发酵单位可达135.9 mg.L-1,可能是因为L-苯丙氨酸经过脱氨后,可以进入polyketide途径从而促进了Monacolin K的生产。     

电解还原法制备L-半胱氨酸盐酸盐

L-半胱氨酸盐酸盐被广泛地用于生物化学和营养学的研究以及组织培养基的制备。因为它的—SH基易被氧化因而被用作还原剂。在医药上可用作肝炎,肝中毒,锑剂中毒,放射性药物中毒等的解毒剂。五十年代末已有人用L-胱氨酸电解还原法制得L-半胱氨酸盐酸盐。我们根据本厂设备条件,建立了L-半胱氨酸盐酸盐的电解还原法制备工艺,并生产了纯度较高的L-半胱氨酸盐酸盐,现介绍如下: 一、原理     

用酪氨酸苯酚裂合酶催化苯酚和 S-(O-硝基苯)-L-半胱氨酸合成 L-酪氨酸

近年来生物技术学家对酶法合成氨基酸具有浓厚的兴趣。我们对弗氏柠檬酸细菌(ATCC29063)酪氨酸苯酚裂合酶催化高Vmax,低Km 基质S(O—硝基苯)-L-半胱氨酸和苯酚,合成L 酪氨酸进行了研究。用可溶性S(o-硝基苯)-L-半胱氨酸反应迅速,2小时或更短时间反应达到完全,约70%苯酚转化为L-酪氨酸,反应底物所剩无几。这一反应的最适pH 值范围广泛,从6.8到9以上。由于S-(O硝基苯)-L-半胱氨酸易用L-半胱氨酸和对一氟硝基苯制备,所以采用这一反应合成L-酪氨酸及其衍生物具有潜在价值。     

天然氨基酸诱导野油菜黄单胞菌降解DSF-家族群体感应信号活性分析

【背景】野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv. campestris,Xcc)是十字花科植物黑腐病的致病菌。Xcc中DSF (Diffusible signal factor)信号依赖的群体感应系统和RpfB介导的群体感应退出机制均与其致病性密切相关。【目的】分别检测18种氨基酸对DSF-家族群体感应信号分子合成的影响,为研发新型生物防治方法提供思路。【方法】添加不同浓度的氨基酸到ΔrpfC菌株XYS培养体系中,接种后不同时间点取样提取DSF信号分子,利用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)分析DSF和BDSF浓度。【结果】18种氨基酸中,甲硫氨酸、色氨酸和胱氨酸能有效降低ΔrpfC菌株培养体系中DSF和BDSF水平,抑制效果与氨基酸浓度密切相关;3种氨基酸对DSF信号分子的抑制作用存在叠加效应;甲硫氨酸、色氨酸或胱氨酸不影响ΔrpfCΔrpfB双突变体菌株中DSF和BDSF水平。【结论】首次发现了甲硫氨酸、色氨酸和胱氨酸通过RpfB诱导Xcc退出群体感应状态。     

牛磺酸的营养价值及牛磺酸营养强化食品的应用前景

<正> 牛磺酸(Taurine,Tau),学名:2—氨基乙磺酸,又名:牛胆素,牛胆碱。分子式:H_2NC—H_2CH_2SO_3H。分子量:125.1。性能:白色针状结晶或或结晶粉末,无臭,味微酸,易溶于热水,不溶于醇,在稀溶液中呈中性,对热稳定。牛磺酸是含硫氨基酸的一种,为体内一种β氨基酸,属于非蛋白氨基酸。牛磺酸可由L-半胱氨酸代谢转变而来,L-半胱氨     

肿瘤中甲硫氨酸代谢及其相关基因的表达调控

甲硫氨酸(methionine)作为人体必需氨基酸,生理功能多样,在肿瘤代谢重编程过程中具有重要意义。研究发现,多种肿瘤细胞对外源性甲硫氨酸存在依赖性,该效应被称为Hoffman效应。在人体内,甲硫氨酸经甲硫氨酸循环代谢,参与一碳单位代谢、叶酸循环,以及多胺、谷胱甘肽、半胱氨酸和核苷酸等多种物质的合成。肿瘤中常出现甲硫氨酸代谢的改变,并伴随甲硫氨酸代谢相关酶基因表达的异常,其中以甲硫氨酸腺苷转移酶(methionine adenosyltransferase, MAT)相关基因表达改变及甲硫腺苷磷酸化酶(methylthioadenosine phosphorylase,MTAP)基因的缺失最为常见,二者可分别引起甲硫氨酸循环及甲硫氨酸补救合成途径的异常,进而导致甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)的生成减少和甲硫腺苷(methylthioadenosine, MTA)的堆积,其与肿瘤的发生、发展和转移等活动密切相关。由甲硫氨酸的代谢改变和代谢酶的基因表达异常,分别衍生出2种不同的治疗策略,即甲硫氨酸限制疗法和靶向治疗。本文将从甲硫氨酸代谢出发,阐述肿瘤中甲硫氨酸依懒性、肿瘤细胞MAT和MTAP相关基因的表达调控,并概述甲硫氨酸相关肿瘤治疗方案的新进展与新问题,为肿瘤治疗方案的进一步探索提供新思路。     

我国大麦条纹花叶病毒的研究III．外壳蛋白氨基酸组成和N末端

将大麦条纹花叶病毒新疆分离物(BSMV-XJ),用CaCl2降解得到纯化的外壳蛋白。氨基酸组份分析表明,BSMV-XJ蛋白含16种氨基酸,其中天门冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸和精氨酸含量较高。不含胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸。用10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定BSMV—XJ蛋白分子量为23×103o DNS-Cl法铡定其N端,证明是封闭的。     

假单胞菌生物合成L-半胱氨酸途径中脱巯基酶的研究

通过PCR方法扩增得到假单胞菌TS1138L-半胱氨酸脱巯基酶基因（cd）,将其克隆至pBlueseript SKII载体,测定了含有L-半胱氨酸脱巯基酶基因的1．2kbDNA片段序列,并与其它菌株的脱巯基酶基因进行了同源性比较;同时,将其克隆至表达载体pET-21a（＋）,IPTG诱导表达,表达产物经Ni-NTA柱亲合层析后,得到纯化的重组蛋白。利用脱巯基酶的活性染色方法对重组表达的L-半胱氨酸脱巯基酶进行了鉴定,并探讨了L-半胱氨酸脱巯基酶的酶学性质,以及在生物转化合成L-半胱氨酸途径中的关键作用。     

L-脯氨酸的制备研究

<正> 一前言 L-脯氨酸(L-proline)是蛋白质组成成分之一。它是一种有一亚胺基的氨基酸,是骨胶原、麸朊、玉米朊的一种较重要的成分。 L-脯氨酸,随着医药科学的发展,在复合结晶氨酸基输液的制备和医药合成工业中用途日趋广泛。在我国,目前由L-脯氨酸配伍其它氨基酸组成的用于抢救病人的十四种、十八种氨基酸大输液,已开始用于临床试验;由L-脯氨酸配伍其它氨基酸组成的用于治疗肝病的十五种氨基酸大输液正在准备进行试验;由L-脯氨酸与其它氨基酸等合成的“催产     

L-脯氨酸的制备研究

<正> 一前言 L-脯氨酸(L-proline)是蛋白质组成成分之一。它是一种有一亚胺基的氨基酸,是骨胶原、麸朊、玉米朊的一种较重要的成分。 L-脯氨酸,随着医药科学的发展,在复合结晶氨酸基输液的制备和医药合成工业中用途日趋广泛。在我国,目前由L-脯氨酸配伍其它氨基酸组成的用于抢救病人的十四种、十八种氨基酸大输液,已开始用于临床试验;由L-脯氨酸配伍其它氨基酸组成的用于治疗肝病的十五种氨基酸大输液正在准备进行试验;由L-脯氨酸与其它氨基酸等合成的“催产     

我国小品种氨基酸研究与生产取得重大突破

<正>在我国生物发酵产业中,氨基酸生产占重要地位,L-谷氨酸、L-赖氨酸及L-精氨酸等大宗氨基酸产品的生产规模及生产水平已达到世界先进水平,而小品种氨基酸诸如:L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸及L-异亮氨酸等无论在生产规模还是在生产水平上,均与国外有较大的差距。近年来,福建省麦丹生物集团有限公司及其福州研究院在中国生物发酵产业协会石维忱理事长的关心和指导下,在国家