microRNA在乙型肝炎病毒感染及相关疾病中的作用

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是一种嗜肝性DNA病毒,感染后可导致急性和慢性肝炎,而慢性感染是导致肝硬化、肝癌和肝衰竭的主要病因。在乙型肝炎病毒复制、转录和相关疾病进程中,microRNA(miRNA)扮演着重要的角色。乙型肝炎病毒感染肝细胞后能引起细胞内microRNA表达谱的改变:一方面,microRNA能促进乙型肝炎病毒的转录和诱导宿主细胞向肿瘤细胞转化;另一方面,microRNA也能抑制乙型肝炎病毒包装和复制。重要的是,乙型肝炎病毒的感染能影响宿主血清microRNA的表达。因此,这类特殊的microRNA今后可成为乙型肝炎病毒相关疾病诊断的潜在生物标记物。将对乙型肝炎病毒与宿主microRNA之间相互作用及其相关生物学效应作一综述。     

ANXA1促进Ⅰ型干扰素表达抑制口蹄疫病毒的复制

【目的】研究膜联蛋白A1(Annexin A1,ANXA1)对Ⅰ型干扰素(I-IFN)表达及口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响。【方法】开展过表达及Knockdown实验,检测ANXA1对FMDV复制的影响。利用双荧光素酶报告系统检测ANXA1对ISRE和IFN-β启动子元件活化的影响。双荧光素酶报告系统鉴定ANXA1调控Ⅰ-IFN通路活化靶分子。Western blotting检测ANXA1对干扰素调解因子3(IRF3)磷酸化的影响。Real-time PCR检测ANXA1对干扰素刺激基因(ISGs)的影响。【结果】过表达ANXA1显著抑制FMDV的复制;下调ANXA1表达促进FMDV复制(P0.01或P0.05);ANXA1促Ⅰ型干扰素通路活化,呈现剂量依赖性(P0.01)。ANXA1显著增强IRF3的磷酸化,促进ISGs的表达(P0.01或P0.05)。【结论】ANXA1促进Ⅰ-IFN表达,抑制FMDV的复制。     

HBx抑制IGFBP3转录的机制

【目的】在细胞水平上研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)转录的影响并对具体机制进行初步探索。【方法】首先采用RNA-Deep-Sequencing技术分析HepG2和乙型肝炎病毒(HBV)转基因细胞HepG2-4D14中表达差异的基因,然后通过实时定量PCR对相关基因进行验证;利用启动子报告基因分析,研究HBx对相关基因IGFBP3转录的调控;通过染色质免疫共沉淀方法,分析HBx抑制IGFBP3启动子活性的机制。【结果】RNA-Deep-Sequencing的结果表明IGFBP3在HBV转基因细胞HepG2-4D14中水平显著下调,实时定量PCR结果与RNA-Deep-Sequencing一致。进一步研究表明HBx能明显抑制IGFBP3的转录,通过实时定量PCR发现HBx对IGFBP3转录的抑制作用依赖于p53;染色质免疫共沉淀实验结果表明HBx能够通过抑制p53与IGFBP3启动子的结合,从而抑制IGFBP3的转录。IGFBP3是一种细胞周期负调控蛋白,我们推测HBx对IGFBP3水平的下调是其促进细胞增殖的途径之一。【结论】HBV能显著下调IGFBP3的转录,机制研究揭示HBV HBx通过干扰p53与IGFBP3启动子的结合进而抑制IGFBP3的转录。     

替换基因片段对流感病毒生长的影响

摘要:【目的】探索流感病毒内部基因对病毒滴度的影响,构建高产流感疫苗种子病毒。【方法】将A/chicken/ZJ/China/2013(H5N1) (ZJ)病毒的6个内部基因或点突变体或聚合酶复合物基因逐个替换鸡胚高度适应的A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)病毒(PR8)的相同基因,构建重组病毒,通过血凝试验比较重组病毒在鸡胚上的增殖滴度。【结果】PB2基因影响最大,替换后未能产生重组病毒;PB1、PA、M基因替换后,重组病毒滴度分别下降了3.7、3.4、3.0个滴度(log2);NS基因替换后基本没有影响;聚合酶复合体基因替换后,病毒滴度稍有下降(7.6 log2),没有提供像完全来自PR8的聚合酶复合体相同的生长特性(8.4 log2);PR8 PB2基因627位点替换成谷氨酸(E)后,病毒滴度从8.4 log2上升到8.7 log2。【结论】合适优化的基因组合可以通过病毒RNA与蛋白之间、蛋白与蛋白之间的相互作用促进病毒复制,从而筛选出能在鸡胚中高效复制的重组体,为高产流感疫苗的生产奠定基础。     

乙型肝炎病毒的逆转录过程

在1985年5月冷泉港乙型肝炎分子生物学会议上,几个实验室小组报告了对乙型肝炎病毒及同族的动物肝炎病毒转录、复制中逆转录过程的研究进展。 1982年,Summer和Mason首先证实了鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的基因组在复制中经由RNA中介(RNA intermediate)的过程。此后,一些实验室相继证实了,能够引起人类乙型肝炎和一些动物肝炎的病毒——包括地松鼠肝炎病毒(GSHV),土拨鼠肝炎病毒(WHV),鸭乙型肝炎病毒(DHBV)和     

乙型肝炎病毒基因分型的研究进展

对乙型肝炎病毒的研究发现,病毒变异导致的不同基因型具有不同的临床意义。病毒基因型间的氨基酸差异可导致病毒复制水平的不同,会影响患者的抗病毒治疗效果以及耐药现象的产生,故及时检测患者感染的病毒基因型对指导临床工作、预测感染的结果尤为重要。乙型肝炎病毒基因分型技术已成为迫切需要进行研究和普及的重要内容;     

PIAS1对PRRSV N蛋白SUMO化修饰及病毒复制的影响

【目的】猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种危害全球养猪业的重要病原。SUMO(Small ubiquitin-like modifier)化修饰作为一种可逆的翻译后修饰在调节病毒复制方面发挥着重要功能。PIAS1(Protein inhibitor of activated STAT1)是SUMO E3连接酶PIAS家族的一员,可以促进靶蛋白的SUMO化修饰,进而影响靶蛋白的功能,参与基因转录调控过程。探究PIAS1与PRRSV N蛋白相互作用的机制及其对N蛋白SUMO化修饰和病毒复制的影响,为进一步阐明PRRSV复制调控和致病的分子机制提供科学依据。【方法】利用酵母回复杂交、免疫共沉淀和激光共聚焦技术验证N蛋白与PIAS1的相互作用;以递增剂量外源性转染PIAS1观察其是否介导N蛋白SUMO化修饰;采用RNA干扰和慢病毒转导技术测定PIAS1对PRRSV复制的影响。【结果】PIAS1能与N蛋白相互作用,而且两者主要共定位于胞浆中;外源转染PIAS1并未增加N蛋白SUMO化修饰水平;在MARC-145细胞中,PIAS1的表达有利于PRRSV的复制。【结论】PIAS1可促进PRRSV的复制。     

miR-34b调控肠道病毒71型在人横纹肌肉瘤细胞中的复制及机制

【背景】研究发现microRNAs(miRNAs)可以参与调控病毒在宿主细胞内感染和复制的过程。【目的】研究miR-34b对肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)在宿主细胞内的复制及其可能机制。【方法】在人横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma,RD)细胞中转染miR-34b mimics和Inhibitor,通过Western blot和Real-time PCR实验检验EV71病毒的复制和表达情况。随后利用双荧光素酶报告系统验证miR-34b与潜在靶点eIF4E的相互作用,并检测miR-34b对RD细胞中eIF4E mRNA表达水平的影响。【结果】miR-34b可以促进病毒在RD细胞中的复制和表达,而miR-34b抑制剂有抑制病毒复制的作用,细胞内miR-34b可以通过作用于靶基因eIF4E调控EV71在宿主细胞中的复制过程。【结论】揭示了miR-34b在EV71病毒复制过程中的调控作用及机制,研究EV71病毒与宿主miRNAs的相互作用机制为进一步阐明EV71病毒感染与复制机理奠定了基础。     

前S1蛋白作为慢性乙型肝炎患者病毒复制标志物的价值

目的 探讨乙型肝炎患者病毒血清前S1蛋白(PreS1)作为慢性乙型肝炎病毒复制标志物的价值.方法 对210例慢性乙型肝炎患者和67例健康体检者进行HBV-DNA、PreS1、HBeAg测定;采用荧光定量-多聚酶链反应技术(FQ-PCR)对HBV-DNA进行定量检测,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对PreS1和HBeAg进行检测.结果 210例慢性乙型肝炎患者中,以HBV-DNA＞1×103拷贝/ml作为HBV复制的金标准,PreS1和HBeAg与HBV-DNA的总符合率为74.8%和57.6%.177例HBV-DNA阳性患者中,PreS1阳性135例,HBeAg阳性88例,2种检验标志物间差异存在显著性(x2=26.8,P＜0.01).PreS1、HBeAg和PreS1/HBeAg联合检测作为病毒复制标志的敏感性分别为76.3%、49.7%和87.6%,特异性分别为66.7%、100%和66.7%,准确性分别为74.8%、57.6%和84.3%,阳性预测值分别为92.5%、100%和93.4%,阴性预测值分别为33.3%、100%和50%.结论 PreS1与乙型肝炎病毒的复制密切相关,PreS1作为乙型肝炎病毒复制的标志物优于HBeAg.PreS1和HBeAg联合检测更能较好反映HBV病毒感染和复制状态,有利于乙肝病情监测和疗效评估.     

miR432*调控柯萨奇病毒A16型在人横纹肌肉瘤细胞中的复制

【目的】研究发现microRNAs(miRNAs)可以参与调控病毒在宿主细胞内感染和复制的过程。作者研究了miRNAs对柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16,CA16)在宿主细胞内复制的影响。【方法】构建miRNAs靶基因筛选系统,在双荧光素酶报告体系的pMIR载体插入病毒基因,如果插入的基因序列能被细胞内的miRNAs靶向调控,报告基因的表达将发生变化。通过实验,发现CA16病毒5'-UTR基因可能是miRNAs的作用靶标。随后利用miRNAs在线分析软件,预测可能作用于5'-UTR基因片段的miRNAs,检测miRNAs对5'-UTR基因片段的作用。为了研究miRNAs分子对5'-UTR基因的调控作用是否可以体现在CA16病毒的复制过程中,在人横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma,RD)细胞中转染miRNAs mimics和inhibitors,利用Western blot和real-time PCR实验检验CA16病毒的复制和表达情况。【结果】实验结果表明,miR432*可以促进病毒在RD细胞中的复制和表达。反之,miR432*inhibitor有抑制病毒复制的作用。【结论】细胞内miR432*可以调控CA16在宿主细胞中的复制过程,本研究首次报导miR432*在CA16病毒复制过程中的调控作用。研究CA16病毒与宿主miRNAs的相互作用机制为进一步阐明CA16病毒感染与复制机理奠定了基础。