抗乙型肝炎病毒e抗原和核心抗原双特异性单克隆抗体的建立与应用

用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达的乙型肝炎病毒核心抗原(内含高滴度的e抗原)免疫Balb/C小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(Sp2/0)融合,获得两株分泌高滴度既抗-HBe又抗-HBc的双特异性杂交瘤细胞系。细胞培养上清液中抗体滴度为100～1000以上;免疫腹水中的抗体滴度为8万至10万以上,均属IgG2a亚类。细胞在实验室连续传代二年多,仍保持高效分泌抗体能力。此单克隆抗体与HBeAg或HBcAg的结合可被抗-HBc或抗-HBc阳性血清所抑制,竞争抑制率在85.9％～96.8％之间。用此单克隆抗体与HBe的β型单克隆抗体和抗HBc的α型单克隆抗体配对,可组装成检测HBeAg/抗-HBe和抗-HBc的诊断试剂,具有重要的应用价值。     

抗HBeAg单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及快速检测试剂盒的制备

乙型肝炎病毒(HBV)是乙型肝炎的病原体,在我国感染率很高。检测血清中的e抗原(HBeAg)和和抗-HBe,在临床诊断、预后、母婴垂直传播的观察方面均具有重要意义,极须研制质量稳定、特异和敏感的快速诊断试剂。由於HBeAg的分子量小,免疫原性差,且与血清球蛋白及白蛋白有非特异性结合,不易将其分离以制备抗体,故我们采用SDS和2-ME两种变性剂,将大肠杆菌高效表达的基因工程HBcAg转变成HBeAg,转变后HBeAg的ELISA滴度可达1600以上,而HBcAg则不能测出。用此抗原免疫     

大肠杆菌合成的HBcAg转化为HBeAg的研究及其应用

37℃用1％β-巯基乙醇处理大肠杆菌HBcAg2小时,可使其全部转化成HBeAg。以常规ELISA方法不能检出HBcAg活性。该制品能被抗-HBe阳性血清特异中和。4℃以液体形式存放稳定,-20℃经过冻融活性下降。HBcAg转化成HBeAg后聚丙烯酰胺凝胶电泳行为有所改变。分别用转化的大肠杆菌HBeAg和血浆HBeAg作为酶联反应的诊断试剂,检测35份HBsAg阳性乙肝病人血清标本的抗-HBe,符合率为91.4％。同用Abbott-HBe(RIA)试剂盒测定的17份HBsAg阳性血清标本的试验结果比较,符合率为100％。说明转化的大肠杆菌HBeAg可代替血浆HBeAg作为检测抗-HBe的诊断试剂应用。     

应用转化细胞分泌的乙型肝炎病毒e抗原检测人血清中的乙型肝炎病毒e抗体

应用乙型肝炎病毒核心抗原基因转化的小鼠L细胞分泌的乙型肝炎病毒e抗原,采用ELISA法与Abbott公司抗-HBe EIA诊断盒平行比较,检测了31份抗-HBe阳性和19份抗-HBe阴性的人血清,结果完全相符。经多次重复试验,本法的OD490nm值的误差不超过8％。OD490nm值与血清稀释度之间呈直线关系。细胞培养液不经纯化即可应用,一般做1:4稀释。细胞分泌的抗原无感染性,价格低廉,不会因结合人血清蛋白而产生非特异性反应。因此比一般诊断盒中所用的人血清HBeAg有很大的优越性。     

利用基因工程表达核心抗原转化的E抗原制备抗HBeAg单克隆抗体

采用两种变性剂将大肠杆菌基因工程高效表达的乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)转化成为E抗原(HBeAg),其ELISA滴度达1:1000以上,而核心抗原滴度为零。用此抗原免疫小鼠,一次融合即获十四株抗乙型肝炎病毒E抗原的单克隆抗体。细胞培养上清抗体滴度为1:10-1:1000以上,腹水滴度为1:1000-1:100,000以上。十三株IgG、一株IgM。其中十株为抗HBeAg(b)决定簇,四株抗(a)决定簇。它们的敏感性及特异性与日本用血清E抗原制备的单克隆抗体效果完全一致。这是国内外首次应用基因工程表达核心抗原转化E抗原成功 地建立分泌抗HBeAg单克隆抗体杂交瘤细胞株。     

重组人类T淋巴细胞白血病病毒抗原及双抗原夹心法ELISA抗体诊断试剂盒的研制

为研制灵敏、特异的抗人类T淋巴细胞白血病病毒(HTLV)抗体诊断试剂,将一段HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱenv区嵌合基因在大肠杆菌中表达,获得的重组抗原具有良好活性.将该抗原作为酶标记抗原建立双抗原夹心法ELISA(dsELISA),对31份HTLV-Ⅰ型血清和19份HTLV-Ⅱ型血清均能100%检出,而在5 065份各种阴性血清中特异度为99.94%.用dsELISA试剂与进口间接法试剂(GeneLabs试剂)平行检测18份HTLV-Ⅰ参比血清、17份HTLV-Ⅱ参比血清和1 024份献血员血清,结果dsELISA试剂正确率为100%,对HTLV-Ⅰ型血清和HTLV-Ⅱ型血清的反应性基本相同,平均s/co值显著高于GeneLabs试剂.而GeneLabs试剂对HTLV-Ⅱ型血清的反应性显著弱于Ⅰ型,并有2份BBI参比血清中的Ⅱ型血清漏检.另外,GeneLabs试剂在献血员血清中出现9例假阳性,特异性显著低于dsELISA试剂.这些结果表明:所研制的dsELISA试剂可用于HTLV-Ⅰ型和Ⅱ型血清的检测,其灵敏度和特异度均优于进口间接法诊断试剂.     

抗HBsAg─抗HRP双特异单克隆抗体的鉴定及初步应用

应用本实验组建立的分泌抗ＨＢｓＡｇ─抗ＨＲＰ双特异单克隆抗体的杂交─杂交瘤细胞株注射Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠腹腔,诱生腹水。经用双亲和柱层析,获得较纯双特异单克隆抗体,检测结果表明该抗体具有特异性好、亲和力高等特性。用以建立单克隆抗体与双特异抗体夹心法ＥＬＩＳＡ,初步用于临床血清标本中ＨＢｓＡｇ检测,取得满意效果。并与上海实业科华生化制品有限公司乙肝ＨＢｓＡｇ诊断试剂（卫生部推荐使用试剂）比较,符合率为１００％。此双特异抗体诊断试剂有望广泛用于临床血清标本ＨＢｓＡｇ的检测,为乙型肝炎的诊断提供价廉、快速、特异而敏感的诊断试剂。     

丙型肝炎病毒核壳蛋白抗原的化学合成及其在血清学诊断中的应用

选取丙型肝炎病毒(HCV)核壳蛋白区两个可能含有优势抗原表位的19和16氨基酸的肽殴(C-19肽和C-16肽),利用固相多肽合成技术进行了化学合成。经用反相高压液相层析(HPLC)及脉冲液相多肽测序技术检定合成肽产品的纯度及序列后,以C-19和C-16肽作为包被抗原组装成检测HCV血清抗体的ELISA诊断试剂。用所组装的合成肽试剂检测中国药品生物制品检定所提供的HCV标准参比血清,并比较利用该试剂和美国Abbott实验室生产的HCV第二代EIA诊断试剂平行检测109份献血员血清的结果,表明C-19肽能够特异、重复、灵敏地检出HCV血清抗体,可以作为我国第一代HCV诊断试剂的合成肽抗原。     

人类免疫缺陷病毒1／2型抗体检测酶联免疫试剂盒的研制

采用二聚体合成肽（ＨＩＶ－１ｇｐ４１、ｇｐ１２０、ｐ２４和ＨＩＶ－２ｇｐ３６）包被酶标板条制备成固相抗原,与鼠抗人ＩｇＧ单克隆抗体酶标记物、底物ＴＭＢ及阴阳性参考血清配套制备成ＨＩＶ抗体ＥＩＡ试剂盒,专供检测人血清或血浆ＨＩＶ１／２抗体之用。以荷兰、韩国及万泰试剂作为对照,用该试剂盒对检定所的Ｐａｎｅｌ标准及献血员１５５５０例（其中ＨＣＶ抗体阳性１２８例,ＨＢｓＡｇ阳性４６例）进行检测,四种试剂对检定所Ｐａｎｅｌ标准的１３份阳性血清均呈阳性反应,２８份阴性血清均为阴性;献血员１５５５０例,四种试剂对其中１份血清均呈阳性反应,经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ试验证实为阴性,四种试剂的阴性检出率均为９９．９９％。连续制备三批试剂经中国药品生物制品检定所检定,所检项目全部合格;同时委托检定所进行临床考核,４７份阳性血清全部呈阳性反应,１５０份阴性血清全部为阴性。说明该试剂盒具有很好的敏感性和特异性。     

Epstein-Barr病毒旱期抗原P138和P54基因的重组与表达

应用基因重组技术,将EB病毒早期抗原(EA)P138两个抗原部位的基因片段和早期抗原P54的完整基因重组,构建成质粒pUC B,转化大肠杆菌JM109获得高效表达。其产物为分子量83kD的P83。经Western blot检验证实,P83能与鼠抗P138和鼠抗P54两种单克隆抗体产生特异性反应。用P83检测30份鼻咽癌病人血清IgA类抗体100％阳性,30份正常人血清全部阴性。     

HBV prec/c shRNA慢病毒真核表达载体的构建和鉴定

目的构建针对HBV prec/c区的shRNA真核表达载体psiHBV,感染HepG2 2.15细胞后观察其对HBeAg表达的抑制作用,为探讨防治HBV感染的新措施提供实验依据。方法针对HBV prec/c基因序列,构建shRNA表达载体psiHBV1、psiHBV2和无关序列psiHBVc。psiHBV与慢病毒辅助系统质粒共转染293T细胞组装慢病毒颗粒后,感染HepG2 2.15细胞,RT-PCR检测prec/c mRNA的转录,微粒子化学发光分析仪(MEIA)检测细胞上清和细胞裂解液中HBeAg表达。结果重组质粒双酶切和测序鉴定与预期结果相符合;组装慢病毒颗粒感染HepG2 2.15细胞后,prec/c mRNA转录降低;与对照组比较,HBeAg的表达水平也显著降低,病毒颗粒对HBeAg表达的抑制作用差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功构建针对HBVprec/c的慢病毒载体psiHBV1、siHBV2,慢病毒介导的RNA i能抑制HBV表达,为应用RNA干扰技术治疗乙型肝炎提供了实验依据。     

大肠杆菌合成的乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)转化为e抗原(HBeAg)的探索

本文以带有HBcAg基因重组质粒的大肠杆菌转化株Ecoli MM206所合成的HBcAg进行HBcAg转化为HBeAg的探索研究。菌经超声破碎获得的菌裂解液对生理盐水透析两天后,酶联检测发现抗原性部分转化为HBeAg。将菌裂解液或HBcAg精制品用2-巯基乙醇处理,可使抗原性发生进一步转化。但是分子筛层析证明抗原蛋白分子大小没有明显变化。这种制品有可能作为诊断试剂用以检测抗-HBe,而且实验结果表明HBeAg是由HBeAg衍变来的。为要提高HBeAg的稳定性,以碘乙酰胺处理,使还原的抗原蛋白通过羧甲基化反应封闭游离的巯基。经上述处理的HBeAg通过分子筛层析可与大部分细菌杂蛋白分开,制品只有HBeAg活性而测不到HBeAg活性,因而提高了抗原蛋白的稳定性与纯度。     

Adr亚型乙型肝炎病毒核心抗原基因的全顺序分析

采用定点克隆与随机克隆相结合的实验设计,用α~(35)S-dATP标记,以末端终止法测定了adr亚型乙型肝炎病毒DNA核心抗原基因的全顺序,包括终止密码子在内基因全长552核苷酸,编码由183氨基酸组成的多肽,计算分子量21000dlt。与日本及上海等实验室报道的adr亚型HBcAg基因比较,核苷酸点突变1.3—1.8％,由点突变导致的错义氨基酸突变有一处,占全部编码氨基酸的0.5％。与adw及ayw亚型比较,核苷酸点突变占全部核苷酸的9.8—10.9％,导致的错义突变占全部编码氨基酸的3.3—4.4％,并对eAg基因的定位进行了讨论。     

乙型肝炎病毒表面抗原在骨髓细胞中的存在及其与乙型肝炎病毒血清复制指标的关联

选择16例血清HBsAg阳性患者为实验组,19例血清HBsAg阴性患者为对照组,每一患者同时采取血清和骨髓涂片,用免疫细胞化学方法(PAP)检测骨髓涂片细胞中的HBsAg。结果,实验组3例骨髓细胞HBsAg阳性者,其血清中HBsAg滴度都很高,而且HBeAg均呈阳性。而在抗HBe阳性或HBeAg/HBeAb阴性者中均无骨髓细胞HBsAg阳性者。在5例血清HBV-DNA多聚酶阳性者中,骨髓细胞中HBsAg阳性者2例;6例多聚酶阴性者中,骨髓细胞中HBsAg阳性者仅1例。 本研究结果证明,HBV可在肝外组织细胞中测出,骨髓细胞HBsAg阳性的出现有集中于HBV高水平复制感染者中的倾向,同时更常见于HBV感染的较早时期。     

一种新型家蚕核多角体病毒Bac to Bac系统的构建

用家蚕核型多角体病毒的全基因组ＤＮＡ与Ａｃ－ＢａｃｉｍｉｄＤＮＡ共转染家蚕ＢｍＮ细胞,构建转座一穿梭载体Ｂｍ－Ｂａｃｍｉｄ。另一供体质粒以转座方式将乙肝病毒ｅ抗的基因ＨＢｅＡｇ整合到Ｂｍ－Ｂａｃｍｉｄ的ａｔｔＴｎ７位点上成为重组ｒＢｍＨＢｅ。结果表明Ｂｍ－Ｂａｃｍｉｄ既能在大肠杆菌中以质粒的形式复制,又能在家蚕ＢｍＮ细胞和草地夜蛾Ｓｆ９细胞中复制,形成感染性病毒粒子。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎ     

替比夫定联合阿德福韦酯与恩替卡韦治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者疗效比较

目的 评价替比夫定联合阿德福韦酯与恩替卡韦治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者的疗效及安全性.方法 138例患者单盲分组,替比夫定联合阿德福韦酯组69例,恩替卡韦组69例,比较两组患者在治疗的第4、8、12、24、52周时HBV-DNA转阴率、ALT复常率,12、24和52周HBeAg转阴及血清学转换率,及24、52周完全应答率.结果 与基线相比,两组患者治疗4、8、12、24和52周时的不同时间阶段HBV-DNA转阴率及ALT复常率差异无统计学意义(P＞0.05).治疗24、52周替比夫定联合阿德福韦酯组患者的HBeAg转阴率及血清学转换率均优于恩替卡韦组,差异有统计学意义(P＜0.05).总有效率在治疗第24、52周时进行两组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).两组安全性及耐受性均相似,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 替比夫定联合阿德福韦酯组与恩替卡韦组均具有强效的HBV-DNA抑制作用,在4、8、12、24和52周的不同时间阶段抗病毒疗效均相似.替比夫定联合阿德福韦酯组具有更显著的HBeAg转阴率及血清转换率和完全应答率,在治疗第24、52周尤为明显,两组ALT复常率相似,替比夫定联合阿德福韦酯和恩替卡韦均具有良好的安全性和耐受性.     

使用ELISA技术检测中草药抗HBeAg的实验研究

使用ＥＬＩＳＡ技术对２５０种中草药水提取物进行抗ＨＢｅＡｇ的实验研究,共筛出有效药物７种（占总数的２．８％）。若按５种不同剂量（０．３、０．６、１．２、２．５、５．０ｍｇ／１００μｌ）的药物、２种不同浓度的ＨＢｅＡｇ（１０．９２、１４．２６Ｐ／Ｎ值）与３种不同接触时间（立即、１ｈ、２ｈ）的１０项Ｐ／Ｎ值均数来综合评价药效指数时,７种有效药物的次序为丹参（１．５５）、皂夹（２．３４）、黄莲（２．８１     

不同DNA疫苗联合接种可有效增强免疫效果

造反乙型肝炎（乙肝）病毒核心抗原（ＨＢｃＡｇＡ）、ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）及单纯疱疹病毒ｇＤ抗原（ＨＳＶ－１－ｇＤ）基因为目的基因,进行ＤＮＡ疫苗联合免疫的研究。通过对不同基因片段的表达研究,选择了能在哺乳动物细胞中高效表达乙肝病毒核心抗原、ｅ抗原和单纯疱疹病毒ｇＤ抗原的质粒ＤＮＡ免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠。结果显示：表达乙肝病毒核心抗原和单纯疱毒ｇＤ抗原的ＤＨＡ疫苗单独免疫,能有效刺激机体产生体液免疫和细