骨髓基质干细胞的分离纯化及培养

目的 建立骨髓基质干细胞(MSCs)良好的分离纯化和培养方法。方法 将小鼠骨髓基质干细胞自殷骨中分离,应用贴壁选择法结合细胞克隆挑选法进行分离纯化,应用细胞生长因子(EGF和PDGF-BB)刺激法进行MSCs的体外培养和传代,倒置显微镜下观察分离培养的细胞并照像记录。结果,培养获得了纯化的呈梭形成纤雏样细胞的骨髓基质干细胞。在生长因子EGF和PDGF-BB的共同作用下,传代MSCs生长旺盛,形态均一。结论 该方法是简便高效的骨髓基质干细胞的分离纯化和培养方法。     

骨髓基质干细胞向成骨细胞的定向诱导分化

骨髓基质干细胞具有间充质干细胞的特性,表现为较强的增殖能力和向多种间充质细胞分化的潜能。目前已经建立了体外培养骨髓基质干细胞的方法,可定向诱导为成骨细胞。成骨细胞是骨组织形成过程中的一种重要细胞,在骨缺损的修复过程中起关键作用,特别对构建用于修复骨缺损的组织工程化骨组织来说尤其重要,但成骨分化的调控机制和应用值得进一步研究。     

髓芯减压联合自体骨髓间充质干细胞治疗45例股骨头无菌性坏死的临床疗效分析

目的：观察髓芯减压联合自体骨髓间充质干细胞治疗45例股骨头无菌性坏死的的临床效果及安全性。方法：采取随机原则对2011年11月至2012年3月期间在我院骨科住院治疗的54例患者分成两组,对照组接受髓芯减压治疗,治疗组接受髓芯减压联合自体骨髓间充质干细胞移植治疗治疗。结果：术后随访一年,治疗组的Harris评分为（86．78±9．48）分,对照组为（71．18±8．36）分,两组相互比较差异有统计学意义（P〈0．05）;治疗组的优良率为84．38％,对照组的优良率为55．17％,治疗组的优良率明显高于对照组,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：髓芯减压联合自体骨髓间充质干细胞移植治疗股骨头无菌性坏死效果显著,优于单纯髓芯减压治疗。     

猪骨髓基质干细胞低温生物学渗透特性的研究

以猪为材料利用细胞计数仪法研究了骨髓基质干细胞的渗透特性,包括细胞的等渗体积、低渗或高渗溶液中细胞的平衡体积及细胞的不可渗体积.结果表明,在等渗条件下,骨髓基质干细胞的平均体积为5248.4μm~3,相当直径d为21.6μm;细胞体积随溶液渗透压的变化规律符合Boyle van’t Hoff关系式,据此得到猪骨髓基质干细胞的不可渗体积V_b=0.36Vi,为1902.5μm~3.     

自体外周血干细胞移植联合髓芯减压治疗早中期股骨头缺血性坏死的临床研究

目的对比研究单纯股骨头髓芯减压与联合自体外周血干细胞移植治疗早中期股骨头缺血性坏死（ANFH）的临床疗效。方法 2004年10月至2012年3月期间就诊于福建省龙岩市第一医院,经影像学检查及术后病理检查确诊为ANFH的患者90例。A组采用单纯髓芯减压共34例,男22例,女12例,年龄22~62岁（中位年龄41.5岁）。B组采用髓芯减压联合自体外周血干细胞移植（用rhG-CSF皮下注射4 d进行外周血干细胞动员,第5天分离外周造血干细胞混悬液。在髓芯减压基础上沿减压隧道注入自体外周血干细胞10~15 ml）56例,男35例,女21例,年龄21~62岁（中位年龄39岁）。按世界骨髓循环研究学会（ARCO）国际骨坏死标准：A组：Ⅰ期7髋,Ⅱ期26髋,Ⅲ期17髋;B组：Ⅰ期10髋,Ⅱ期50髋,Ⅲ期29髋。术后及随访期间进行Harris评分和疼痛视觉模拟（VAS）评分,对X线片、CT及MRI检查结果进行评估。两组Harris评分和VAS评分比较用成组t检验。结果 A组34例,B组49例随访13~89个月,平均38.5个月。术后3、6、12个月与术前的Harris评分比较有明显提高,VAS评分有明显的下降;术前、术后3个月两时间点的A、B组Harris评分比较差异无统计学意义（t=0.342、0.628,P=0.781、0.516）;术后6、12个月的B组评分优于A组（t=2.991、7.753,P=0.009、0.001）。术后12个月A、B两组T1相低信号区所占股骨头体积的比例分别为（17.24±3.71）﹪和（12.11±3.14）﹪,差异有统计学意义（t=4.360,P=0.001）。结论髓芯减压联合自体外周血干细胞移植治疗早中期ANFH,可显著减轻关节疼痛,改善股骨头血液供应,明显恢复关节功能,加速病灶区骨组织修复,有效防止股骨头进一步塌陷。     

β2微球蛋白在骨髓基质干细胞的表达

通过流式细胞技术和激光共聚焦显微镜探索骨髓基质干细胞（bone mesenchymal stemcells,BMSCs）β2微球蛋白（beta 2 microglobulin,β2M）的表达情况。取第3代相同状态的SD大鼠骨髓基质干细胞,分为A、B两组,A组为未分化的BMSCs,B组为软骨诱导分化1周的BMSCs,两组均采用流式细胞技术和激光共聚焦显微镜分别从数量和细胞轮廓上检测β2M的表达。流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测结果均表明,未分化BMscs的β2M表达明显低于软骨诱导分化的BMSCs。结果表明,未分化的BMSCs免疫原性较低,处于软骨分化的BMSCs免疫原性明显增强。     

骨髓基质干细胞向心肌细胞诱导分化的实验研究

目的探讨大鼠骨髓基质干细胞在体外和体内向心肌细胞诱导分化的能力,为下一步的细胞移植治疗心肌梗死提供实验基础.方法体外诱导实验中,将不同浓度的5-氮胞苷作用于不同培养时间的骨髓基质干细胞,摸索5-氮胞苷的最佳诱导时机和浓度,观察诱导后细胞形态变化,并用免疫细胞化学染色检测心肌特异性肌钙蛋白T的表达;在体内实验中,培养扩增的骨髓基质干细胞经BrdU标记后,自体移植于正常心肌内,分别通过BrdU和心肌特异性肌钙蛋白T免疫组织化学染色检测移植细胞的存活和分化情况.结果体外诱导实验中,5-氮胞苷的诱导作用以10μmol/L的浓度对传代细胞进行两次诱导,效果最好,不仅能诱导出表达心肌特异蛋白的心肌样细胞,而且这些细胞在体外能够自发搏动.体内诱导实验中,移植的细胞在正常心肌微环境中能够存活并分化为心肌细胞.结论骨髓基质干细胞在体外化学诱导和体内心肌微环境诱导时均能分化为心肌细胞,可用于细胞移植治疗心肌梗死的实验.     

骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的探讨大鼠骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化后超微结构和细胞因子表达的变化,为下一步细胞移植治疗扩张型心肌病提供理论依据。方法在体外扩增、定向诱导骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化的基础上,电镜下观察骨髓基质干细胞诱导前后超微结构的改变,RT-PCR检测心肌特异性因子ANP、BNP、α-MHC、β-MHC的表达,并与原代培养的心肌细胞比较,观察二者之间的生物学异同。结果免疫组化法证实诱导后的骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化,电镜下胞浆内可见糖原颗粒,肌原纤维排列与原代培养的心肌细胞相似;RT-PCR证实诱导后的骨髓基质干细胞表达心肌特异性因子ANP、BNP、α-MHC、β-MHC。结论骨髓基质干细胞经5-氮胞苷定向诱导后在超微结构和细胞因子的表达上类似于心肌细胞,已向心肌样细胞分化。     

Nucleostemin在大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导分化中的研究

目的探讨Nucleostemin（NS）在大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导分化中的机制及作用。方法取4～6周龄雄性SD大鼠两侧股骨、胫骨骨髓基质细胞,原代及传代培养。取第3代骨髓间充质干细胞分别用普通和矿化培养基培养,通过相差倒置显微镜观察细胞生长、MTT法检测细胞增殖、碱性磷酸酶和茜素红钙染色了解成骨活性。免疫组化SABC法及免疫荧光法检测NS在细胞中的表达情况,比较NS分别在普通培养基和成骨细胞诱导培养基作用下的表达情况。结果大鼠骨髓间充质干细胞在矿化培养基诱导下其NS的表达较普通培养基培养下的表达明显减弱,且呈时间依赖性衰减。成骨细胞的NS表达则为阴性。在矿化液作用下,骨髓间充质干细胞可诱导为成骨细胞。MTT显示矿化液培养细胞生长潜伏期长,对数生长期较对照组延长。结论NS作为核干细胞因子,在干细胞中和某些肿瘤细胞中表达丰富。细胞分化后,其表达明显减少。因此,NS很可能作为大鼠基质干细胞是否具有潜在分化能力的标志性因子。     

阿司匹林对骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性脑卒中的影响研究进展

阿司匹林是缺血性脑卒中患者急性期治疗药物及卒中再发的二级预防常用药物,骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植是治疗缺血性脑血管疾病的新的新兴技术。已证实阿司匹林可抑制骨髓间充质干细胞的增殖及影响骨髓间充质干细胞的分化。本文就阿司匹林对骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性脑卒中的影响等进行综述。     

骨髓基质细胞在细胞移植与基因治疗中的应用

骨髓基质细胞是研究最广泛的成体干细胞,用于临床细胞移植与基因治疗有诸多优点,论述了具有多向分化潜能的骨髓基质细胞,应用于细胞移植与基因治疗中的研究现状及发展前景 。     

Glutathione Induces Neuronal Differentiation in Rat Bone Marrow Stromal Cells

It has been reported that rat bone marrow stromal cells (BMSCs) are differentiated into neuronal cells by administration of 2-mercaptoethanol [Woodbury et al (2000) J Neurosci Res 61:364–370]. In this study, we examined the effects of various sulfhydryl (SH) compounds on the differentiation of BMSCs obtained from rat femurs. Neuronal differentiation was detected morphologically and immunocytochemically. It was found that the cells treated with reduced glutathione (GSH) apparently differentiated into neurons, showing extensive processes, and expressing neuron-specific enolase and microtubule-associated protein 2. Glutathione monoethyl ester (GEE), which increased the cellular GSH content, showed no effect on the expression of neuronal markers. It is concluded that the neural differentiation of BMSCs occurs by the administration of GSH. It was suggested that extracellular and not intracellular GSH have effects on the induction of the neuronal differentiation of BMSCs.     

阿司匹林对体外培养骨髓基质细胞成骨性分化的影响

目的：探讨阿司匹林对骨髓基质细胞成骨性分化的影响。方法：培养SD大鼠骨髓基质细胞（BMSCs）,传代3次后进行成骨诱导分化,诱导培养基中加入不同浓度阿司匹林（0.5、1、2、5、10mmol/L）,同时设立对照组。采用cck-8法分析细胞增殖情况。比较阿司匹林组与对照组在细胞碱性磷酸酶（ALP）活性、骨钙素（OC）分泌量、钙结节染色等方面的成骨性差异。结果：阿司匹林无促进细胞增殖活性,而高浓度阿司匹林能够强烈抑制细胞增殖。0.5、1、2mmol/L浓度阿司匹林可促进BMSCs的成骨性分化,中低浓度组碱性磷酸酶含量、骨钙素分泌量在不同阶段显著高于对照组。14天茜素红染色可见中低浓度组钙结节数量高于对照组。结论：中低浓度阿司匹林作用于骨髓基质细胞可促进其成骨细胞特性表达,这表明阿司匹林有促进骨代谢合成的作用。     

阿司匹林对体外培养骨髓基质细胞成骨性分化的影响

目的:探讨阿司匹林对骨髓基质细胞成骨性分化的影响。方法:培养SD大鼠骨髓基质细胞(BMSCs),传代3次后进行成骨诱导分化,诱导培养基中加入不同浓度阿司匹林(0.5、1、2、5、10mmol/L),同时设立对照组。采用cck-8法分析细胞增殖情况。比较阿司匹林组与对照组在细胞碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素(OC)分泌量、钙结节染色等方面的成骨性差异。结果:阿司匹林无促进细胞增殖活性,而高浓度阿司匹林能够强烈抑制细胞增殖。0.5、1、2mmol/L浓度阿司匹林可促进BMSCs的成骨性分化,中低浓度组碱性磷酸酶含量、骨钙素分泌量在不同阶段显著高于对照组。14天茜素红染色可见中低浓度组钙结节数量高于对照组。结论:中低浓度阿司匹林作用于骨髓基质细胞可促进其成骨细胞特性表达,这表明阿司匹林有促进骨代谢合成的作用。     

罗非鱼鱼皮酶解液对体外培养大鼠骨髓基质细胞的影响

目的:观察两种罗非鱼鱼皮酶解液对大鼠骨髓基质细胞的影响。方法:用密度梯度离心和贴壁筛选的方法获得骨髓基质细胞,用碱性磷酸酶染色法观察是否成功诱导骨髓基质细胞向成骨细胞分化,并分别采用MTT法和PNPP法测定两种酶解液对骨髓基质细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响。结果:密度梯度离心和贴壁筛选可得到较为均一的骨髓基质细胞。这些骨髓基质细胞诱导后可以向成骨细胞分化。两种酶解液作用于骨髓基质细胞时,在浓度0.1mg·ml~(-1)均可以促进骨髓基质细胞增殖,在浓度0.1mg·ml~(-1)1,0.01mg·ml~(-1)均可以提高骨髓基质细胞碱性磷酸酶活力。实验用两种酶解液的三个浓度与成骨诱导液协同作用于骨髓基质细胞时,均没有促进细胞增殖和提高碱性磷酸酶活性的显著作用。结论:两种酶解液可以促进骨髓基质细胞增殖,提高细胞碱性磷酸酶活力;与成骨诱导液协同作用于骨髓基质细胞时,对细胞增殖和碱性磷酸酶活性没有显著促进及提高作用。     

人骨髓基质细胞体外分离及定向培养内皮细胞

用Ficoll(比重1.077 g/ml)从正常成人骨髓中分离骨髓基质细胞(BMSCs),DMEM-HG 培养基内含20?S、GM-CSF(100 u/ml)、VEGF(10 ng/ml)、FGF(5 ng/ml)、L-谷氨酰胺(2mmol/ L)、肝素(90 u/ml),以及抗生素液进行定向培养和扩增其中的内皮细胞(ECs),Ⅷ因子相关抗原的免疫组化法和透射电镜观察(TEM)鉴定其细胞的性质。结果5.0×105个BMSCs在体外经定向ECs 培养和扩增8代后,获得了6.0×109个ECs,扩增了约1.2×104倍。70%-80%的细胞对Ⅷ因子相关抗原免疫组化呈阳性反应;光镜下细胞呈典型的“鹅卵石”样;TEM下可观察到胞浆内有Weible- palade小体,证实为内皮细胞。实验表明,BMSCs在体外分离和定向培养的ECs,经扩增后可能是心血管组织工程所需种子细胞的又一个重要来源。     

EGF体外诱导骨髓基质干细胞增殖分化为成纤维细胞的实验研究

目的:研究表皮生长因子(EGF)在体外诱导兔骨髓基质干细胞(BMSCs)向成纤维细胞增殖分化,为韧带组织工程种子细胞提供可能的来源。方法:以EGF对体外培养的BMsCs进行诱导分化培养,相差显微镜观察细胞生长,MTT检测细胞的增殖,免疫组化半定量细胞的分化。结果:诱导后7d、14d时,诱导组呈现更均一的纤维细胞样的带有长突起的纺锤形细胞,呈束状排列,并且具有更高的细胞密度;诱导组在7d、14d细胞增殖均比对照组快;第10d时,诱导组、对照组胶原Ⅰ、Ⅲ染色均为阳性,但诱导组有更高的染色密度;诱导组、对照组胶原Ⅱ染色阴性。结论:BMSCs经。EGF。诱导后细胞增殖,并且能刺激细胞外基质的表达,基本符合肌腱和韧带组织工程的要求。     

Effects of Bone Marrow Stromal Cell-conditioned Medium on Primary Cultures of Peripheral Nerve Tissues and Cells

Implantation of bone marrow stromal cells (MSCs) produces an improved functional outcome of peripheral nerve repair. In this study, rat dorsal root ganglion (DRG) explants, rat DRG neurons, and rat Schwann cells (SCs) were treated with monkey MSC-conditioned medium, respectively, and then subjected to MTT assay, Bromodeoxyuridine/Hoechst 33342 double staining, flow cytometry, immunohistochemistry, real-time quantitative PCR, and Western blot analysis, respectively. The results showed that MSC-conditioned medium enhanced axon growth and neurogenesis in cultured DRG explants, augmented cell survival of and expression of NF and GAP-43 by cultured DRG neurons, promoted cell survival and proliferation of cultured SCs, and increased the expression of NGF, BDNF, and bFGF in cultured SCs. We also found that mitogen-activated protein kinase (MAPK)/extracellular signal-regulated kinase (Erk) 1/2 pathway was involved in the enhanced cell proliferation of SCs evoked by MSC-conditioned medium. The data of this study might help the understanding of MSCs-based treatment for peripheral nerve repair.     

人骨髓基质细胞中糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶DcDNA的克隆

为探讨人糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI PLD)cDNA的结构及功能 ,应用RT PCR从人骨髓基质细胞中克隆了长约 2 6kb的GPI PLDcDNA ,包含完整阅读框架 ,编码 2 3个氨基酸的信号肽及 817个氨基酸的成熟肽 .该cDNA与人胰腺GPI PLDcDNA几乎百分之百同源 ,与人肝脏GPI PLDcDNA同源性为 95 %,氨基酸同源性为 94 %,3者对应的结构基因只有 1个 ,位于人类第 6号染色体上 ,基因组序列长约 80kb ,包括 2 5个外显子 .构建克隆的GPI PLDcDNA的真核表达载体 ,通过脂质体转染能表达GPI锚定的胎盘型碱性磷酸酶 (PLAP)而无GPI PLD活性的G9细胞 ,同时设立对照组检测GPI PLDcDNA的功能 .结果显示 ,对照组细胞几乎检测不到GPI PLD活性 ,其表达的PLAP主要位于细胞膜上 ;而转染GPI PLDcDNA的G9细胞能检测到较高水平的GPI PLD活性 ,而且大部分酶活性存在于培养液中 ,其表达的PLAP也主要被释放入培养液 .结果证实 ,从人骨髓基质细胞中克隆的GPI PLDcDNA有生物学功能 ,它能释放细胞膜上GPI锚定蛋白质 .