五种基因克隆技术

经华中农业大学周国岭先生对国内外 6 4篇有关基因克隆技术的论文概括和分析 ,当前基因克隆技术主要有 5个类别 ,即体位克隆或状态克隆、转位或转ＤＮＡ标记法、同系位候选基因法、快捷顺序标记法、差接式快捷基因克隆法等。1　体位克隆或状态克隆首先将目的基因精确定位于分子标记连锁图上 ,用连锁标记筛选大片段ＹＡＣ ,ＢＡＣ ,ＴＡＣ ,ＰＡＣ或Ｃｏｓ ｍｉｄ等文库 ,构建含目的基因区的精细物理图谱 ,采用染色体操作法逐步接近目的基因 ,如拟南芥的ＷＩＧ ＧＵＭ基因克隆 ,人的ＮＰＣ1基因克隆。若侧翼标记与目的基因连锁非常紧密 ,就可…     

水稻功能基因图位克隆研究进展

图位克隆是建立在植物分子标记图谱之上的一种基因克隆技术。利用分子标记技术对目的基因进行精细定位,用与目的基因紧密连锁的分子标记筛查DNA文库,构建包含目的基因区域的物理图谱,通过染色体步移等方法找到包含目的基因的克隆,再通过遗传转化试验对目的基因进行功能验证。介绍了基因图位克隆的研究技术原理与技术环节,并对近年来水稻功能基因图位克隆研究进展进行了综述。     

限制酶介导的插入突变及其在丝状真菌中的应用

克隆基因的方法很多,通过突变是克隆基因的常用方法,如转座子标签法常用于克隆植物病原细菌致病相关基因及植物的抗病基因。尽管转座因子在丝状真菌中也普遍存在,但对它们的转座作用和功能了解不多,迄今转座子标签法还没有发展成为标记真菌突变体和基因克隆的常规技术。而一般的ＵＶ或化学突变方法又将使突变基因的鉴定和克隆遇到许多问题。用质粒ＤＮＡ转化真菌时,也会发生非同源随机插入真菌基因组而形成标记的突变体,但往往由于转化频率较低等因素而难以广泛应用。新近的研究发现,在限制酶介导下大多数真菌的质粒ＤＮＡ转化频率明…     

图位基因克隆

图位基因克隆是最近几十年中发展并逐步完善起来的基因分离及研究方法。紧密连锁分子标记的获得及ＤＮＡ大片段克隆文库的建立是顺利进行图位基因克隆的重要条件,而对于那些数量性状基因（ＱＴＬｓ）的克隆更显示了其优越性。     

microRNA微阵列研究中的核酸标记技术

寡核苷酸微阵列技术是检测细胞或组织中miRNA表达谱的有效方法。目前应用于微阵列分析的miRNA标记技术主要有直接标记法、加尾标记法、基于逆转录反应的标记方法和基于miRNA克隆扩增的标记方法。在实际应用中应根据各个方法的优缺点来选择最符合实验要求的标记方案。     

应用原位放射免疫技术检测目的基因克隆

遗传工程技术促进了基因结构和功能的分 析、生产具有经济效益的蛋白质的研究。在获 得大量的基因重组克隆中,如何检测和筛选出 含有目的基因的克隆,是遗传工程的重要技术 之一。目前常用的方法是利用DNA-DNA或 RNA-DNA杂交的基因探针检测目的基因, 但它必须获得特异的基因。在缺乏特异的基因 探针时,近几年来建立了免疫探针检测筛选 法[2-61,它是将目的基因编码的多肤抗原制备成 抗体,直接从基因克隆库中筛选能表达目的基 因的克隆。     

新基因克隆技术进展

新基因克隆是当今生物学最热点的领域之一。本文从技术原理、适应性及使用例证等方面,综述和评价了已有的及发展中的新基因克隆技术,包括克隆已有多肽分子的基因、同源家族基因克隆、功能性筛选、差异及减数筛选等,并着重介绍了ＲＤＡ、ＥＤＳ、ＲＬＣＳ等差异筛选技术。     

激活标记——一种有效的基因功能鉴定技术

激活标记技术是植物基因克隆与基因功能鉴定的一种重要的方法。已经在拟南芥、矮牵牛、杨树、番茄和水稻等多种植物中应用,并成功分离鉴定了一系列的功能基因。文章介绍了用激活标记方法克隆鉴定多个与植物生长发育相关的功能基因技术。     

稻瘟病分子生物学研究进展

稻瘟病分子生物学发展迅速,已分子标记定位的稻瘟病主效抗性基因１５个,微效抗性基因３个;水稻抗稻瘟病基因Ｐｉ－ｔａ和Ｐｉ－ｂ已成功克隆。稻瘟病菌系谱与致病型关系可分为简单与复杂两种类型。本文对水稻抗稻瘟病基因的定位和克隆,稻瘟病菌群体遗传结构,致病性遗传、基因组分析、无毒基因克隆、准性生殖等研究进展进行了评述。     

小麦抗赤霉病研究现状与展望

小麦是我国最重要的口粮作物之一。在小麦生产所面临的各种病害中,赤霉病的发生具有愈来愈严重的趋势,引起小麦产业界的高度关注。近几十年来,科研人员在小麦抗赤霉病遗传育种以及防控技术领域进行了持续不懈的努力,在赤霉病病原菌致病基因、小麦赤霉病抗性基因定位、克隆及功能研究以及抗赤霉病分子育种等方面取得了重大进展。本文主要从赤霉病抗性基因资源的发掘和鉴定、不同抗源遗传基础解析、小麦赤霉病抗性基因、抗赤霉病分子标记辅助选择育种与基因聚合以及小麦抗赤霉病基因的克隆和功能研究等方面进行了综述,分析了目前小麦抗赤霉病研究中存在的问题,并提出应加强基因克隆、功能分子标记开发以及应用单体型辅助选择(HAS)和标记组辅助选择(MSAS)等小麦抗赤霉病研究的相关建议。     

一种基于核酸外切酶Ⅲ的PCR产物克隆方法

基因克隆作为一种常规技术被广泛应用于DNA及蛋白质的研究。在传统的基因克隆中,一般利用限制性内切酶对DNA片段进行消化,然后使用DNA连接酶完成连接,因此这种方法受到插入片段和载体酶切位点的限制。一些ligase-free克隆技术虽然克服了酶切位点的限制,但费时费力,成本较高。为了弥补其他ligase-free技术的不足,文中介绍了一种新的利用核酸外切酶Ⅲ进行ligase-free克隆的方法,反应时间仅需要30 min,提高了克隆效率并有效降低经济成本,有利于大规模基因克隆的应用。     

全长cDNA的获得—RACE及其他方法进展

全长cDNA的获得是基因克隆的重要内容,也是基因组研究的重要内容之一。cDNA末端快速扩增技术（RACE）是获得全长cDNA的主要辅助手段之一,本文对RACE技术的原理、改进和近几年发展起来的新型RACE（包括RNA连接酶介导的RACE、oligo－capping等）作了综述。同时,对用干全长CDNA克隆的其他技术,如引物载体法、固相支持物法作了介绍。     

植物基因分离的图位克隆技术

DNA是遗传的物质基础。遗传的基本单元是以基因的形式包含在 DNA序列内。要想从分子基础上来理解遗传的本质 ,基因的分离是最基本的前提。现在分离和克隆植物基因的方法很多 ,如传统的功能克隆及近年来发展十分迅速的表型克隆。但大多数情况下 ,我们并不知道基因的表达产物 ,在未知基因的功能信息又无适宜的相对表型用于表型克隆时 ,最常用的基因克隆技术有转座子示踪法、随机实变体筛选法和图位克隆法。其中 ,转座子示踪法中的转座子受其种类、活性和数量的制约 ,随机突变体筛选法随机性较大且不能控制其失活基因的种类和数量 ,也限制了…     

基因克隆的方法进展

基因克隆一般分为定位克隆和表型克隆。表型克隆进展较快,主要有消减杂交、代表性差异分析法、mRNA差异显示、DNA转染法及抑制消减杂交法。抑制消减杂交法是1996年报道的一种表型克隆的新方法,是目前寻找差异表达基因的较有效方法,较过去的方法有许多先进之外。本文对此方法的原理及应用作一详细介绍,并与其他方法作简单比较。     

基于EST的新基因克隆策略

表达序列标签(expressed sequence tags, EST) 是从随机选择的cDNA 克隆进行单向测序获得的短的cDNA序列, 代表一个完整基因的一部分。随着生物信息学和基因定位的迅猛发展, EST已成为基因定位、基因克隆、基因表达分析的有力工具。近年来, 由于EST数据库的迅速扩张, 运用EST来克隆和定位基因, 使得新基因克隆的策略发生了革命性变革。尽管存在一些不足, 实践证明EST可大大加速新基因的发现与研究。本文将就EST技术尤其是它在新基因克隆中的应用策略作详细介绍。     

酵母异源功能互补在植物基因克隆中的应用

酵母作为研究高等真核生物的一种重要的模式生物,不仅在生物信息学方面发挥着重要的作用,其丰富的突变体在其他生物基因克隆和功能验证等方面也发挥着重要的作用。酵母异源互补方法是利用酵母突变体验证相应性状异源基因功能,或通过文库筛选克隆相应性状异源基因,为高等真核生物的基因克隆和功能验证提供了一种捷径。主要对酵母异源功能互补法在研究植物基因方面的进展做一概述。     

赤霉菌分子生物学研究进展

过去 1 0年中 ,由于基因克隆、遗传转化等分子生物学方法与技术的应用 ,对赤霉菌中赤霉素生物合成基因的克隆、鉴定、异源表达及其表达调控等分子生物学研究取得了很大进展。现从赤霉菌的转化系统、赤霉素生物合成基因克隆、合成机理及其基因表达调控等方面的研究进展进行综述     

化州柚查尔酮合成酶基因克隆与序列分析

利用CTAB-LiCl法提取高质量的化州柚总RNA,采用RT-PCR技术克隆查尔酮合成酶基因,获得广东道地药材化橘红资源化州柚的查尔酮合成酶基因。该基因编码区全长1176bp,编码391个氨基酸残基,与同样来源于柑橘属的查尔酮合成酶基因同源性高达98%。CTAB-LiCl法能提取高质量的化州柚总RNA,可以用于后续基因克隆和分析;克隆获得的查尔酮合成酶具有编码区,与同属植物相同基因具有高度序列同源性。     

水稻腊质基因的分子克隆

利用λEMBI3为载体构建了水稻寒丰6366的基因文库,重组噬菌体数日达4×lo。,超过了要求的理论值。用缺口平移法标记玉米Wx基因DNA片段作探针,从基因文库中筛选出阳性杂交克隆。对其中一个阳性克隆,λWx2的southern分析表明,它和玉米Wx基因编码区杂交。根据绘出的物理图,将杂交区内一个0．4kb的BS片段克隆到M13上,测定了DNA顺序。结果表明,该区域内水稻和玉米Wx基因外显子DNA同源性在80％以上。这说明我们确实得到了水稻Wx基因克隆,而且水稻和玉米的Wx基因是高度同源的。     

单、双标记基因筛选的转人乳铁蛋白基因供核细胞生产克隆山羊效率的比较

为比较两种筛选标记基因生产转人乳铁蛋白(hLF)基因克隆山羊的效率,利用单(新霉素抗性基因,Neor)、双(新霉素抗性和绿色荧光蛋白基因,Neor/GFP)标记基因筛选转基因的供核细胞,并制作体细胞核移植转基因山羊。山羊胎儿成纤维细胞电转染单标记基因表达载体(pBLC14)或双标记基因表达载体(pAPLM),分别有58.8%(20/34)和86.7%(26/30)的抗性细胞株检测到外源基因;转染pAPLM的细胞传代培养后,仅有20%(6/30)株细胞在传代中所有细胞均能观察到荧光;分别以pBLC14和pAPLM的细胞株作为供核细胞进行体细胞核移植,共获得806枚重构胚胎,胚胎移植受体后35 d、60 d妊娠率分别为53.8%、26.9%和39.1%、21.7%,最终分别产下5只(1.9%)和7只(1.4%)克隆山羊;经PCR及Southern blotting检测,所有出生山羊均整合有外源基因。结果显示,以单、双标记基因筛选供核细胞,其重构胚融合率、怀孕率和克隆动物出生率差异不显著(P>0.05),Neor/GFP双标记基因能准确、有效地用于转基因供核细胞筛选。同时,结果也表明Neor/GFP双标记基因转染的体细胞作为供核细胞对体细胞克隆效率未出现不利影响。