HMGB1/SREBP-1参与IFN-γ介导的小鼠肾小球系膜细胞内的脂质沉积

目的:探讨γ-干扰素(IFN-γ)诱导小鼠系膜细胞内脂质沉积的可能机制。方法:常规培养的小鼠系膜细胞(MMC)分为正常对照组、刺激组、刺激+空质粒组(sh-HMGB1)和刺激+质粒组(sh-SREBP-1);油红O染色观察细胞内脂质沉积;RT-PCR检测HMGB1、SREBP-1和脂肪酸合成酶(FAS)mRNA表达;Wesern blot检测蛋白表达。结果:油红O检测显示IFN-γ刺激组MMC细胞中出现明显脂滴;IFN-γ刺激能够上调HMGB、SREBP-1和FASmRNA及蛋白表达;沉默HMGB1能够降低IFN-γ诱导的SREBP-1和FAS上调,并减少细胞内脂质沉积;沉默SREBP-1能够减少HMGB诱导的MMC细胞内脂质沉积。结论:IFN-γ可能通过上调HMGB/SREBP-1/FAS的表达促进小鼠系膜细胞内脂滴沉积。     

高糖对原代培养人肾小球系膜细胞表达MMP-9、TIMP-1的影响

目的了解高糖对原代培养的人肾小球系膜细胞表达MMP-9、TIMP-1和MMP-9/TIMP-1的影响,进一步探讨糖尿病肾病的发病机制。方法取自愿水囊引产的胎儿肾,解剖取肾皮质剪碎,应用肾皮质组织块法合优生选择法对人肾小球系膜细胞进行原代培养。ELISA方法检测MMP-9、TIMP-1的表达变化。结果与正常组相比较,高糖组MMP-9在24h、48h、72h均显著降低（P〈0.01）,TIMP-1在24h、72h可显著升高（P〈0.05）,48h表达降低;MMP-9/TIMP-1的比值在24h、48h、72h均显著降低（P〈0.01）。结论高糖能够降低MMP-9/TIMP-1,与肾小球系膜细胞细胞外基质降解能力降低密切相关。     

缬沙坦对人肾小球系膜细胞糖基化终产物受体表达的影响

目的：本实验探讨缬沙坦对糖基化终产物诱导的人肾小球系膜细胞氧化应激水平及糖基化终产物受体（RAGE）表达的影响。方法：体外常规培养人肾小球系膜细胞,运用糖基化修饰的牛血清白蛋白（AGE-BSA）和缬沙坦进行干预,流式细胞术检测细胞内活性氧（ROS）,RT-PCR法检测NADPH氧化酶的亚基p47^phox的mRNA表达,RT-PCR和细胞免疫化学法检测RAGE的表达量。结果：缬沙坦干预组人肾小球系膜细胞的ROS产生量、NADPH氧化酶的亚基p47^phox mRNA表达量、RAGE表达量均低于AGE-BSA组（P〈0．05）,且缬沙坦的抑制作用呈浓度和时间依赖性。结论：缬沙坦可能通过降低氧化应激水平来抑制RAGE的表达。     

人肾小球系膜细胞葡萄糖转运蛋白的研究

本文采用了RT-PCR,细胞免疫荧光染色及流式细胞仪分析技术证实人肾小球系膜细胞有GLUT1(glucose transportorl)mRNA和蛋白质的表达。用2-Deoxy[~3H]-D-Glucose摄入法与根皮素抑制实验肯定了系膜细胞上GLUT1的功能及其在系膜细胞葡萄糖摄入中的作用。本项研究为进一步研究系膜细胞GLUT1在糖尿病肾病发病机理中的作用奠定了基础。     

Tolrestat对高糖所致肾小球系膜细胞肌动蛋白去组装的影响

研究了醛糖还原酶抑制剂Tolrestat对高浓度葡萄糖(HG)所致肾小球系膜细胞(MC)肌动蛋白(actin)组装的影响。结果证明,与正常浓度葡萄糖(NG)相比,在HG培养的MC,F-actin失去束状外观呈不规则网状,显示F-actin部分去组装;F-actin荧光强度降低,G-actin荧光强度升高和F-/G-actin荧光强度比值下降。Tolrestat加入培养后,明显防止HG引起的F-actin去组装及F-和G-actin荧光强度的变化。提示多元醇通路激活在HG引起的MCactin去组装改变中起一定作用。     

高糖刺激下大鼠肾小球系膜细胞CTGF和MT1-MMP的表达

目的观察高糖刺激的大鼠肾小球系膜细胞结缔组织生长因子(CTGF)和膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)的动态变化,探讨糖尿病肾病(DN)的发病机制。方法体外培养的大鼠HBZY-1肾小球系膜细胞分为正常糖对照组,高糖组和甘露醇高渗对照组,采用RT-PCR及Western印迹法分别检测CTGF和MT1-MMP的mRNA及蛋白的表达,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清中IV型胶原的含量。结果与对照组相比,高糖组各时间点系膜细胞CT-GF表达明显上调,IV型胶原的分泌增加,且二者随时间持续增高;而MT1-MMP的表达则随时间呈明显下降趋势。结论高糖可诱导肾小球系膜细胞CTGF表达增加,同时抑制MT1-MMP的表达,二者可能参与DN中细胞外基质(ECM)代谢失衡过程。     

大黄素对肾小球系膜细胞PCNA的影响

本文应用体外肾小球系膜细胞培养和免疫组化染色技术,以增殖细胞核抗原(PCNA)为标志抗原,观察了大黄素对肾小球系膜细胞周期调控的影响。发现大黄素能明显抑制系膜细胞从G_1期进入S期,同时对已进入S期细胞的进一步过渡也有影响。     

氧化低密度脂蛋白促进培养的人肾小球系膜细胞LOX-1表达

目的:研究氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)对人肾小球系膜细胞植物血凝素样受体(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor,LOX-1)表达。方法:不同浓度的Ox-LDL和培养的人肾小球系膜细胞共孵育,应用Real-time PCR和Western Blot方法检测Ox-LDL对人肾小球系膜细胞LOX-1表达的影响。结果:Ox-LDL剂量和时间依赖性促进人肾小球系膜细胞LOX-1mRNA和蛋白表达。Ox-LDL 40μg/mL刺激细胞0-24小时,于12小时达峰值。Ox-LDL 10、20、40、60μg/mL分别作用于细胞12小时,40μg/mL组达到峰值,为基础值的3.73倍。Ox-LDL 40μg/mL刺激细胞0-24小时,LOX-1蛋白24小时达高峰,Ox-LDL 10、20、40、60μg/mL分别作用细胞24小时,40μg/mL组细胞LOX-1蛋白达到峰值,为基础值的1.81倍。结论:Ox-LDL在一定浓度范围内剂量和时间依赖性促进人肾小球系膜细胞LOX-1表达。     

高脂喂养大鼠肾小管上皮细胞SREBP-1、TGF-β1、α-SMA的表达和细胞外基质沉积

目的:探讨高脂喂养对大鼠肾脏小管上皮细胞SREBP-1、TGF-β1、α-SMA表达和细胞外基质(ECM)的影响。方法:高脂饲料喂养大鼠12周后,油红O检测肾脏脂质沉积,Masson染色检测肾小管间质细胞外基质沉积,免疫组化、Western blot和原位杂交检测SREBP-1、TGF-β1、α-SMA和FN的表达。结果:高脂喂养后大鼠体重明显增加,血糖、甘油三酯和胰岛素均升高,油红O检测显示大鼠肾小管上皮细胞内出现明显脂滴。SREBP-1蛋白和mRNA在肾小管上皮细胞内表达,高脂组高于正常对照组,分别是正常组的1.88倍和1.85倍;TGF-β1和α-SMA也定位于肾小管上皮细胞胞浆并出现上调。Masson染色显示高脂喂养大鼠肾间质ECM沉积增多,纤维粘连蛋白FN检测也显示模型组表达强于对照组。结论:高脂饮食喂养可能通过上调肾脏小管上皮细胞SREBP-1表达使细胞内脂滴沉积,并进一步诱导TGF-β1、α-SMA合成而导致细胞外基质堆积。     

高糖对肾小管上皮细胞脂质代谢影响及罗格列酮的干预研究

目的探讨高糖环境中肾小管上皮细胞脂质代谢变化,以及罗格列酮对其干预作用。方法体外培养HKC细胞,随机分为正常糖组、高糖组、罗格列酮干预组,采用油红染色检测细胞内脂质,免疫细胞化学和WesternBlot检测固醇调节元件结合蛋白1(sterolregulatory element binding protein-1,SREBP-1)表达。结果与正常糖组比较,高糖培养的肾小管上皮细胞内出现明显脂滴;免疫细胞化学、WesternBlot检测发现固醇调节元件结合蛋白1表达于胞浆,12、24、48、72h固醇调节元件结合蛋白1前体和成熟体表达高糖组均高于正常对照组,差异有统计学意义,其中以48h表达量最大(前体2.334±0.045,成熟体1.082±0.040),罗格列酮组相对于高糖组,前体和成熟体表达均下降,脂滴形成有所减少。结论高糖可诱导肾小管上皮细胞固醇调节元件结合蛋白1前体和成熟体表达升高,进一步导致脂质合成增多;罗格列酮减少脂质合成可能是部分通过抑制固醇调节元件结合蛋白1表达而实现。     

SREBP-1基因过表达促进人肾小管上皮细胞甘油三酯形成

目的 SREBP-1重组质粒转染人肾小管上皮细胞(HKC)检测SREBP-1基因表达和细胞内脂滴的关系。方法体外培养人肾小管上皮细胞并随机分为空白对照组、pcDNA3.1空质粒对照组和pcDNA3.1-SC1重组质粒转染组,采用阳离子脂质体法将SREBP-1特异性质粒pcDNA3.1-SC1及pcDNA3.1空质粒转染到细胞内并培养48小时,半定量RT-PCR和Westernblot分析目标基因表达丰度的变化,并采用油红O染色检测细胞内脂滴。结果 pcDNA3.1-SC1重组质粒转染的细胞内SREBP-1mRNA表达呈现明显升高,扩增条带积分光密度值分别是空白对照组和阴性对照组的6.158倍和4.194倍,SREBP-1蛋白也出现明显上调,条带积分光密度值为3.092±0.254。空白对照组和pcDNA3.1阴性对照组细胞内均未见有红染脂滴颗粒,而pcDNA3.1-SC1重组质粒转染组中出现了清晰的红染颗粒。结论 SREBP-1表达可增加人肾小管上皮细胞脂肪合成证实HKC细胞中SREBP-1表达和脂滴形成之间存在有直接关系。     

球状脂联素在波动性高血糖诱导人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用

目的球状脂联素在波动性高血糖诱导人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用。方法在不同条件下体外培养人脐静脉内皮细胞,分别或联合加入球状脂联素(gAD)、单磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)的激活剂AICAR和AMPK的阻滞剂araA。采用MTT比色法测定细胞活性,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测AMPKα和磷酸化AMPKα蛋白表达。结果分别与对照组和恒定高血糖组比较,波动性高血糖显著抑制细胞活性和增加细胞凋亡率。gAD明显抑制波动性高血糖诱导的细胞凋亡。AICAR和gAD可明显激活AMPK的表达。araA可明显抑制gAD诱导的AMPK蛋白表达。结论波动性高血糖比恒定性高血糖更易促进内皮细胞凋亡,gAD明显抑制波动性高血糖诱导内皮细胞凋亡,其机制可能与激活AMPK有关。     

天然和氧化低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞VCAM-1表达的影响

目的探讨天然和氧化低密度脂蛋白(n-LDL,ox-LDL)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)VCAM-1表达的影响。方法将n-LDL,ox-LDL作用于培养的HUVEC,用细胞酶联免疫吸附试验(cellELISA)检测VCAM-1蛋白的表达,用原位分子杂交技术检测VCAM-1 mRNA的表达。结果正常培养的HUVEC可表达VCAM-1,n-LDL和ox-LDL均可增强培养的HUVEC表达VCAM-1,尤以ox-LDL作用更明显。结论n-LDL、ox-LDL可能通过促进血管内皮细胞表达VCAM-1而在动脉粥样硬化的早期事件中起作用。     

TGF-β1对AGS细胞上皮-间充质转化及体外侵袭的影响

目的观察转化生长因子-β1(TGF-β1)对人胃癌细胞株AGS发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)及体外侵袭的影响。方法将体外培养的AGS用TGF-β1干预后,倒置显微镜下观察细胞形态学的变化,MTT比色法检测TGF-β1对AGS增殖的影响,细胞划痕试验和Transwell侵袭试验检测细胞运动和侵袭力的改变;免疫荧光和Western blot检测snail、E-cadherin(上皮钙粘蛋白)、和N-cadherin(神经钙粘蛋白)表达的变化。结果TGF-β1诱导AGS向间充质细胞形态转化,低浓度促进细胞增殖,而高浓度时细胞增殖率逐步降低,且snail和间充质细胞表型N-cadherin表达上调,而上皮细胞表型E-cadherin表达下调,同时细胞运动和侵袭能力大大增强。结论TGF-β1可诱导AGS发生EMT,从而增加其侵袭、转移的能力。     

乙酰胆碱及其拮抗剂对人SK-N-SH细胞增殖及mAchRl表达的影响

用CCK-8比色法和流式细胞术,检测乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)及拮抗剂阿托品(at-ropine,Atro)对SK-N-SH细胞增殖活性和周期分布的调节作用;进一步用荧光定量PCR、免疫印迹和流式细胞间接免疫荧光技术,分析SK-N-SH细胞毒蕈碱受体亚型Ⅰ型(mAchR1)和c-fos的表达差异。结果表明,1mmol/LAch对SK-N-SH细胞有明显促增殖作用,而1mmol/LAtro阻滞细胞从S期向G_2/M期移行;1mmol/LAch与1mmol/LAtro均反馈调节mAchR1的蛋白水平,但mAchR1mRNA的表达不受影响;1mmol/LAch显著上调c-fosmRNA和Fos蛋白的表达,但这种作用可被Atro逆转。提示胆碱类受体参与配基对肿瘤细胞的促增殖作用。     

心肌营养素-1和结缔组织增长因子在糖尿病大鼠心肌中的表达及厄贝沙坦的干预作用

目的通过观察心肌营养素-1（CT—1）mRNA和结缔组织增长因子（CTGF）在糖尿病大鼠心肌中的动态表达以及厄贝沙坦干预的影响,探讨CT—1和CTGF在糖尿病心肌病（DMCM）发病机制中的作用。方法SD雄性大鼠78只,随机分为对照组和糖尿病组。用链脲佐菌素（STZ）一次性腹腔注射建立糖尿病模型后,糖尿病组再为厄贝沙坦治疗组及糖尿病未治疗组。治疗组以厄贝沙坦灌服12周。分别在病程2、4、6、8、10、12周处死各组大鼠。称量体重（BW）、全心重量（HW）、左室重量（LVW）,计算心体比（HW／BW）和左室重量指数（LVWI）。检测心肌CT—1 mRNA和CTGF的表达水平;心肌胶原（Col）和心肌血管紧张素（AngⅡ）含量。观察心肌超微结构病理改变。结果糖尿病组大鼠的HW／BW、LVWI明显高于正常对照组（P〈0．01）,厄贝沙坦治疗组大鼠的HW／BW、LVWI明显低于糖尿病组（P〈0．01）,但仍高于正常对照组（P〈0．01）。厄贝沙坦组心肌细胞变性、坏死程度和范围较糖尿病组明显减轻。糖尿病组大鼠CT—1 mRNA、CTGF表达明显卜调,随病程延长呈升高趋势（P〈0．01）,心肌col、AngⅡ含量较正常对照组明显升高（P〈0．01）。而厄贝沙坦治疗组大鼠的CTI mRNA、CTGF表达与糖尿病组相比较下调（P〈0．01）;心肌Col、AngⅡ含量明显低于糖尿病组（P〈0．05）。糖尿病组大鼠心室CT—1mRNA、CTGF和心室局部Col、AngⅡ含量呈明显正相关。结论糖尿病大鼠心肌CT—1mRNA、CTGF表达上调与心肌肥大、间质纤化密切相关,在糖尿病心肌病的心室重构中起重要作用。厄贝沙坦町减轻糖尿病心肌病的心室重构,其心肌保护作用机制可能与其下调CT—1和CTGF水平有关。     

乙酰胆碱及其拮抗剂对人SK-N-SH细胞增殖及mAchR1表达的影响

用CCK-8比色法和流式细胞术,检测乙酰胆碱（acetylcholine,Ach）及拮抗剂阿托品（atropine,Atro）对SK-N-SH细胞增殖活性和周期分布的调节作用;进一步用荧光定量PCR、免疫印迹和流式细胞间接免疫荧光技术,分析SK-N-SH细胞毒蕈碱受体亚型Ⅰ型（mAchR1）和c-fos的表达差异。结果表明,1mmol／L Ach对SK-N-SH细胞有明显促增殖作用,而1mmoL／L Atro阻滞细胞从S期向G2／M期移行;1mmol／L Ach与1mmol／L Atro均反馈调节mAchR1的蛋白水平。但mAchR1 mRNA的表达不受影响;1mmol／L Ach显著上调c-fos mRNA和Fos蛋白的表达,但这种作用可被Atro逆转。提示胆碱类受体参与配基对肿瘤细胞的促增殖作用。