几丁质酶、葡聚糖酶与萝卜抗真菌蛋白RS-AFP2基因三价表达载体的构建及农杆菌工程菌株的重组

利用基因工程技术构建了含有几丁质酶(Chitinase,Chi．)、β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-Glucanase,Glu．)、萝卜抗真菌蛋白(Raphanus sativus-antifingal protein,Rs-AFP2)的三价植物表达载体,并通过农杆菌直接转化法将三价植物表达载体转入农杆菌EHA105,分别为GC R／pCAMBIA1300／EHA105和RC G／pCAMBIAl300／EHA105,并采用PCR、DNA dot blotting技术对其进行了鉴定分析,证明获得了阳性的重组农杆菌工程菌株。     

大白菜orf224基因植物表达载体的构建及遗传转化

为了创制新的大白菜雄性不育材料,双酶切重组质粒pMD18-T-CMS7311-orf224和表达载体pWR306后,将CMS7311-orf224基因与线性表达载体pWR306进行定向连接,构建了细胞质雄性不育线粒体基因CMS7311-orf224的植物表达载体pWR-CMS7311-orf224,通过酶切和PCR验证pWR-CMS7311-orf224载体构建正确.采用快速冻融法,将表达载体导入农杆菌EHA105,转化大白菜材料06J28,对转化植株的GUS、PCR和RT-PCR检测表明,获得了2个大白菜转基因植株.     

几丁质酶基因与抗真菌蛋白基因、葡聚糖酶基因双价表达载体的构建及农杆菌工程菌株的重组

几丁质酶（Chitinase,Chi.)、β-1,3－葡聚糖酶（β－1,3－Glucanase,Glu.)和萝卜抗真菌蛋白（Rs-AFP2)是植物体内正常的表达产物,它们对防御植物的真菌病害具有重要的作用。基于它们在功能上具有协同作用,本研究利用基因工程技术构建了几丁质酶和抗真菌蛋白、几丁质酶和葡聚糖酶双价表达载体,通过农杆菌直接转化技术将双价表达载体转入农杆菌EHA105,最后采用PCR、DNA dot blotting技术对所获得的农杆菌工程菌株进行了鉴定分析。     

风疹病毒抗原基因E1植物表达载体的构建

目的:为了提高目的基因在番茄果实中的表达量,为进一步研究口服植物疫苗打下基础。方法:PCR扩增1.1kb番茄果实特异性启动子E8基因、460bp风疹病毒抗原E1基因、256bp NOS基因,将这些片段插入到pCAMBIA1301多克隆位点,得到植物表达载体pCAM1301E8-E1,经测序鉴定正确,将其转化至根癌农杆菌EHA105,然后进行酶切鉴定。结果:重组质粒酶切鉴定均得到预期片段,测序结果正确。结论:该实验成功构建番茄果实特异性启动子驱动风疹病毒E1基因的植物表达载体。     

西瓜GGPS基因果实特异性表达载体构建与遗传转化

[目的]将牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPS)基因转化西瓜。[方法]利用RT-PCR技术克隆西瓜果实GGPS基因CDS区;构建由果实特异性启动子AGPL1调控GGPS基因、以nptⅡ为筛选标记基因的植物表达载体,并转入农杆菌EHA105;通过农杆菌介导法对西瓜品种"红一号"进行遗传转化。[结果]经过卡那霉素筛选和PCR初步鉴定,获得4株转基因阳性植株。[结论]构建了GGPS基因果实特异性表达载体,并将其转入西瓜品种"红一号"中,转化效率为0.13%。     

金花茶查尔酮合成酶基因CnCHS的克隆及遗传转化研究

根据已发表的金花茶查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因(CnCHS)序列设计全长扩增引物,以金花茶花瓣总cDNA为模板进行PCR扩增,成功获得了该基因cDNA全长。将扩增所得全长产物连接PMD18-T载体后转化大肠杆菌E.coli DH5α,提取质粒后经酶切、测序鉴定后,将其与双元表达载体pCAMBIA1300连接,成功构建了CnCHS基因的正义表达载体pCAM-CnCHS。将该重组表达载体转化农杆菌EHA105后,利用农杆菌介导法将CnCHS基因转入烟草,获得转基因烟草18株。利用PCR法及Southern blotting对所获得的转基因植株进行鉴定,结果显示CnCHS基因成功整合到烟草基因组中,阳性率达67%,并获得了单拷贝转基因植株。这些结果表明本研究成功构建了金花茶CnCHS基因对烟草的遗传转化体系,为深入研究CnCHS基因的功能及其对花色的调控效应奠定了基础。     

黄连对羟基苯基丙酮酸双加氧酶基因的植物表达载体构建

目的:构建除草剂抗性基因黄连对羟基苯基丙酮酸双加氧酶的植物表达载体.方法:通过PCR从重组质粒pGWB2/Cjhppd中扩增出大小为1 300bp的目的片段,亚克隆到pGEM-T easy上.BamHⅠ和SpeⅠ双酶切pGEM-T Easy/Cjhppd和质粒pCambia1301,回收得到1 300bp的Cjhppd基因片段和开环质粒pCambia-1301-UbiN,用T4连接酶连接,得到重组质粒,利用三亲法将其导入农杆菌EHA105 中.结果:成功得到农杆菌EHA105的阳性菌落,菌落PCR扩增得到和预期大小一致的1 300bpDNA片段.结论:成功将具有除草剂抗性的Cjhppd构建到了含有玉米泛素启动子Ubi和选择性标记基因Hpt的植物表达载体pCambia-1301-UbiN/Cjhppd,并导入根癌农杆菌EHA105中,可以用于水稻等单子叶植物的遗传转化.     

灵芝-8基因的番茄果实特异性启动子植物表达载体的构建

构建含有灵芝-8（LZ-8）基因和番茄果实特异性E8启动子的重组载体,并将其转化到根瘤农杆菌中。通过PCR法获取LZ-8基因和E8启动子序列,将目的基因和E8启动子序列构建到植物表达载体pBI121中,获得果实特异性表达LZ-8蛋白的重组质粒。并采用PCR、限制性内切酶酶切和序列测定分析法,对重组质粒进行鉴定,将其转入根瘤农杆菌GV3101中。PCR法、限制性内切酶酶切图谱和序列测定分析均表明番茄果实特异性表达LZ-8蛋白的重组质粒构建成功。获得了含有LZ-8基因和E8启动子的重组质粒,并成功转化根瘤农杆菌,为下一步LZ-8蛋白在番茄果实中特异表达奠定基础。     

番木瓜β-Gal基因RNAi双T-DNA植物表达载体的构建及其遗传转化的初步研究

克隆了番木瓜(Carica papaya L.)果肉的细胞壁水解关键酶β-半乳糖苷酶(β-GAL)基因保守区,将其反向重复插入载体pKANNIBAL,构建RNAi中间表达载体pKAN/RG,将其上的发夹结构取代经改造的载体pCAMBIA 1300上hpt II基因,构建中间表达载体p1300~-/MFRG,分离单T-DNA区段,与载体pCAMBIA 2301构建RNAi双T-DNA植物表达载体p2301/TTRG.酶切分析和PCR检测表明,p2301/TTRG已被成功导入农杆菌EHA 105.通过遗传转化,初步获得了GUS染色呈阳性且具Kan抗性的番木瓜胚性愈伤组织.