化学发光法检测体外HBV复制

目的:建立化学发光法检测体外HBV复制水平的方法,研究其灵敏度和稳定性.方法:用HBV DNA重组质粒pCH9转染到人肝癌细胞株HepG2和Huh7中,5d后收集细胞并抽提其HBV复制中问体DNA,转印后以地高辛标记HBV DNA为探针进行杂交,用化学发光法检测杂交结果,同时进行探针灵敏度的检测.结果:转染后HepG2和Huh7细胞提取HBV DNA中检测出较强的复制中间体的信号,分别为松散环状DNA(rcDNA),双链线性DNA(dslDNA),单链DNA(ssDNA),探针检测的灵敏度可达到lpg,接近同位素法检测的灵敏度.整个实验重复3次获得同样结果.结论:成功建立了稳定的化学发光法检测体外HBV复制水平的方法.     

HPV16L1抗原表达肿瘤模型的建立

应用基因重组技术,构建pcDNA-L1真核表达载体,经限制性内切酶和序列分析,用脂质体转染技术将其转入B16细胞,G418稳定筛选后IFA法检测其表达,RT-PCR法检测HPV16L1 mRNA 的生成,并将转染细胞接种小鼠皮下,观察成瘤情况及RT-PCR法检测HPv16L1 mRNA的生成。结果,酶切鉴定证实重组质粒中插入的目的基因片段及载体大小、方向和插入位点均正确,在转染的 B16细胞中可见绿色荧光并检测到HPV16L1 mRNA的生成,接种的转染细胞在小鼠皮下可成瘤, 接种后1月在肿瘤组织中可检测到HPV16L1 mRNA的生成,B16细胞转染L1后其致瘤性与转染空载体组和野生型B16细胞组无明显差异。     

自制显示系统检测免疫印迹中的目的蛋白

目前蛋白免疫印迹显示系统有显色法和化学发光法,因化学发光法具有灵敏、快速、准确等特点而倍受科研工作者的青睐,但一般商品化的化学发光试剂盒价格颇为昂贵,为此,在参考文献的基础上作了一些改进,将Tris Cl的pH值从7.5提高到11.0,同时提高了对碘苯酚的浓度（从1mmol/L提高到2mmol/L）,得到了自制的化学发光试剂。首先用其检测了大肠杆菌中表达的2种不同分子量的蛋白（gam,13kDa;bet,30kDa）,发现当蛋白上样量为2~20ng时,各蛋白条带均清晰显示。随后的斑点免疫印迹实验表明：自制及进口化学发光试剂在检测酶标二抗效价方面有着同样高的敏感性。     

稳定转染Dicer基因对HELF细胞功能的影响

目的观察正常人胚肺成纤维细胞（HELF）在稳定转染Dicer基因后增殖能力及迁移能力的变化。方法应用脂质体介导方法转染Dicer基因表达载体于HELF细胞,G418筛选,PCR检测整合情况,RT-PCR检测表达情况,Western-blot检测蛋白表达水平,确定稳定转染细胞株,MTT方法检测细胞增值能力,Transwell方法检测细胞迁移能力。结果Dicer基因稳定转染HELF细胞系建立,用RT-PCR和Western-blot方法检测到Dicer基因mRNA和蛋白表达水平都明显增强。与转染空载体的HELF细胞相比,转染Dicer基因的HELF细胞48、72、96h的MTT光吸收值明显升高（P〈0.05）,并且穿过人工重构基底膜的细胞数明显增多。结论Dicer基因稳定转染HELF细胞后,HELF细胞增殖能力和迁移能力都明显增强。     

人内皮脂酶584C→T变异型真核稳定表达载体的构建及其对人脐静脉内皮细胞生长的影响

目的:构建人内皮脂酶(endothelial lipase,EL)野生型和584C→T变异型真核稳定表达载体及相应的转染细胞模型,为研究584C→T变异对内皮脂酶功能的影响奠定基础。方法:从pMIG/hEL及pMIG/hEL584C→T中双酶切分离出目标片段,与pCMV-N-his载体连接,凝胶电泳、双酶切电泳及测序鉴定构建的野生型和584C→T变异型内皮脂酶载体,而后以Lipofectamine LTXPLUS为转染试剂,将其转入人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),G418筛选出稳定表达细胞,荧光定量PCR法检测转染细胞的EL表达,同时观察细胞形态,并用CCK-8法检测转染对细胞生长及细胞倍增时间的影响。结果:凝胶电泳及双酶切电泳结果显示条带位置与预期符合,测序结果表明其序列与GenBank上序列一致。荧光定量PCR法及mRNA电泳均显示:野生型和584C→T变异型转染细胞的EL表达显著高于空载体转染细胞。进一步研究584C→T变异对HUVEC细胞生长的影响,结果表明空载体、野生型EL和584C→T变异型EL转染HUVEC细胞与正常细胞的形态基本一致,且生长曲线和细胞倍增时间也无显著差异。结论:本实验成功构建了人内皮脂酶野生型和584C→T变异型真核稳定表达载体及相应的转染内皮细胞模型。EL584C→T变异对HUVEC细胞生长无明显影响。     

重组抗HER2 ScFv/tBid 基因的表达对SGC7901胃癌细胞的促凋亡作用

目的：构建重组抗HER2 ScFv/tBid载体并观察其对胃癌SGC7901细胞的促凋亡作用。 方法： 将重组抗HER2 ScFv/tBid基因克隆入真核表达载体pCMV中,转染SGC7901细胞,用RT-PCR方法检测目的基因在mRNA水平的表达,间接免疫荧光法检测目的蛋白表达和细胞形态学变化,通过细胞计数检测转染目的基因后对细胞生长的影响,通过检测细胞周期来观察其促凋亡作用。 结果：转染SGC7901细胞后,检测出目的蛋白的表达。细胞计数发现细胞的增殖被明显抑制。细胞周期分析有明显的凋亡峰出现,说明重组抗HER2 ScFv/tBid表达后有促凋亡作用。 结论： 重组抗HER2 ScFv/tBid基因可以在转染的SGC7901细胞中表达,并且可抑制转染细胞的生长,诱导细胞发生凋亡。     

α1, 2-岩藻糖转移酶基因转导对人卵巢癌细胞RMG-I p38MAPK信号通路介导的凋亡的影响

以α1,2-岩藻糖转移酶基因转染前后卵巢癌细胞RMG-I、RMG-I-H为细胞模型,用细胞免疫荧光方法检测转染前后细胞p38MAPK和p-p38MAPK的细胞内定位,RT-PCR和Western blot方法从mRNA和蛋白质两个水平检测转染前后细胞p38MAPK表达的变化;以兔抗人IgG抗体处理组为对照,分别利用RT-PCR和Western blot方法检测Lewisy单克隆抗体处理前后RMG-I-H细胞p38MAPK mRNA和蛋白质表达水平的变化;以0.1%DMSO为对照,用流式细胞仪(FCM)检测p38MAPK特异性抑制剂SB203580处理后RMG-I-H凋亡比率的变化,并利用RT-PCR和Western blot方法检测caspase-3的mRNA和蛋白质水平的变化;用RT-PCR方法检测卡铂和SB203580处理后p38MAPK及caspase-3表达的变化.结果表明,RMG-I与RMG-I-H的p38MAPK蛋白主要定位在细胞质,p-p38MAPK蛋白定位在细胞核,转染后p38MAPK的mRNA水平明显高于转染前(P<0.05);Lewisy单克隆抗体处理后RMG-I-H细胞p38MAPK m...     

NLS-RARα蛋白在重组腺病毒Ad-NE感染的NB4中定位的验证

该实验主要验证重组腺病毒Ad．NE感染NB4细胞后,NLS-RARa蛋白的表达及其定位。用重组腺病毒Ad-NE感染NB4细胞,检测感染效率,分别用RT-PCR和Westernblot法在mRNA水平和蛋白水平验证转染成功：提取转染成功的NB4细胞的核蛋白,Westernblot法检测细胞核中NLS—RARα蛋白的表达;FITC—AnnexinV／DAPI双染色免疫荧光法检测转染成功的NB4细胞NLS-RARα的表达及定位;FITC—AnnexinV／PI双染色激光共聚焦法检测转染成功的NB4细胞中PNLS-RARα的表达及定位。结果显示,重组腺病毒Ad—NE和阴性对照腺病毒Ad-KZ对NB4细胞的感染效率可达70％～80％。RT-PCR和Westernblot结果显示,感染了重组腺病毒Ad—NLS-RAR的NB4细胞成功表龇基因和NE蛋白,且有NLS．RARa的蛋白表达。用细胞免疫荧光法、激光共聚焦法检测出已感染的NB4细胞中NLS—RARer蛋白的表达,并推测其主要定位于胞核。综上所述,该文成功用重组腺病毒Ad-NE感染NB4细胞,并用Westernblot法、免疫荧光法、激光共聚焦法验证了NLS-RARα蛋白的存在并推测其定位,为进一步研究急性早幼粒细胞白血病的早期诊断及复发监测提供了新的思路。     

Cdk-5过度表达对Tau蛋白磷酸化的影响

目的 实验旨在细胞水平研究cdk-5过度表达对微管相关蛋白tau的磷酸化的影响。方法 利用基因转染技术建立过度表达cdk-5的鼠成神经瘤细胞株(N2a细胞株),免疫沉淀及酶活性检测法检测cdk-5的酶活性,免疫荧光技术和免疫印迹技术检测细胞内tau蛋白的磷酸化状况。结果 在N2a细胞株转染组中,cdk-5表达增加,并使得抗体tau-1显色减弱,PHF-1显色增强,提示tau蛋白在Ser199/202,Ser396／404位点过度磷酸化。与此同时,cdk-5酶活性较未转染组提高3.5倍。结论 这些结果提示细胞水平的cdk-5的过度表达会导致cdk-5酶活性增加和tau蛋白过度磷酸化,而过度磷酸化的tau蛋白可能参与了AD的病理过程。     

ADAR1 shRNA对人胶质瘤U87细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究ADAR1 shRNA对人胶质瘤细胞U87细胞增殖和凋亡的影响。方法:通过构建ADAR1-shRNA的干扰质粒,经脂质体法转染胶质瘤U87细胞系,通过荧光倒置显微镜观察转染效率,选择转染效率最高的细胞系。取转染48h细胞,采用RT-PCR和Western-blot分别检测ADAR1 mRNA及蛋白的表达,流式细胞仪检测其细胞凋亡率,MTT法检测细胞增殖情况。结果:①经ADAR1-shRNA转染48h后的转染效率最高,此时U87细胞系中ADAR1 mRNA及蛋白的表达均被显著抑制,较阴性对照组及空白组均明显降低(P0.05)。②在转染ADAR1-shRNA后,细胞凋亡率为(28.14%±3.76%),明显高于阴性对照组(3.20%±1.57%)和空白组(2.80%±1.49%),细胞增殖率较阴性对照组及空白组明显下降(P0.05)。结论:通过shRNA抑制ADAR1的表达能明显促进人胶质瘤细胞U87细胞的凋亡和抑制其增殖,ADAR1基因可能成为治疗治疗胶质瘤的新靶点。     

Txnip基因siRNA慢病毒表达质粒构建及促进猪前体脂肪细胞分化

硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein, Txnip)是一种氧化还原调节蛋白质,与硫氧还蛋白结合并抑制其活性,调节细胞氧化还原状态,影响细胞多种生理过程,然而其在猪脂肪细胞分化中的作用尚不明确。本文设计合成3对靶向猪Txnip基因的shRNA寡核苷酸,分别连接于重组慢病毒载体pGLV_3/H_1/GFP+Puro构建siRNA表达质粒。测序验证后,与包装质粒共转染293T细胞,获得滴度1×10~8 pfu/mL的慢病毒干扰质粒。以MOI值100转染原代培养猪前体脂肪细胞,转染率均达80%以上,其中Txnip-shRNA-2转染细胞Txnip基因沉默率达75%。转染Txnip-shRNA-2的猪前体脂肪细胞用成脂分化培养液诱导后,每隔1 d检测细胞成脂分化及相关基因表达。结果发现,其分化比阴性对照质粒转染或未转染细胞显著增强(P<0.05),PPARγ和FAS mRNA表达水平显著提高(P<0.05)。本文构建siRNA慢病毒表达质粒能有效干扰猪Txnip基因表达,Txnip表达沉默可通过上调PPARγ表达促进猪前体脂肪细胞分化。本研究提示,Txnip可能是猪脂肪细胞分化的抑制因子。     

带Myc、His标签的SPAG4L真核表达载体的构建与表达

为了获得带有His、Myc 双标签的SPAG4L蛋白,建立能够稳定表达该蛋白的细胞系,本研究利用PCR技术从人睾丸cDNA中扩增SPAG4L开放阅读框,构建到pcDNA3.1(+)myc-his真核表达载体中进行测序和双酶切验证。将pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L质粒和空白载体分别转染HeLa细胞,G418筛选后建立稳定转染细胞系。用Western blotting和免疫荧光技术对新建立的稳定转染细胞系进行检测。结果表明,成功扩增了SPAG4L基因,构建到pcDNA3.1/myc-His(-)A真核表达载体后,经酶切和测序验证所插入的SPAG4L序列完全正确;pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L转染HeLa细胞后,经G418筛选后建立了稳定转染细胞系。Western blotting检测后发现,新建立的细胞系能够正确表达SPAG4L及其标签蛋白,进一步的免疫荧光实验发现,SPAG4L能够和内质网标签蛋白PDI共定位。研究结果所提供的稳定转染细胞系将为下一步进行免疫共沉淀和pull-down实验提供了有力的工具。     

过表达热休克蛋白70提高CHO细胞表达抗体的能力

通过在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中过表达热休克蛋白70以提高其表达抗体的能力。首先从中国仓鼠基因组DNA中扩取HSP70基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1-HSP70,再将重组质粒稳定转染到CHO/dhfr-细胞中,筛选获得稳定的细胞系,运用RT-qPCR检测和Western blot分析HSP70基因的过表达。在过表达HSP70的CHO细胞组和对照细胞组(转染空载体pcDNA3.1的CHO细胞组)中分别转染表达抗-HBs的质粒,应用ELISA检测两组细胞表达抗-HBs的能力。RT-qPCR结果显示实验组CHO细胞中HSP70基因的表达量明显高于对照组细胞;ELISA检测结果表明过表达HSP70的CHO细胞组抗-HBs表达量高于对照组细胞(P<0.05)。研究揭示HSP70能有效促进细胞内分泌性蛋白的表达。     

人H5N1流感病毒血凝素蛋白DNA疫苗的构建及其免疫原性研究

将我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/1/2005作为研究对象,扩增其HA和HA1基因片段并克隆至真核表达载体pStar,构建成真核表达质粒。通过Western blot和间接免疫荧光检测方法确认,构建的重组质粒在真核细胞中成功地表达了目的蛋白HA和HA1。将重组质粒免疫BALB/c小鼠,检测免疫后外周血中HA/HA1特异性抗体的效价,并比较HA和HA1的免疫原性。结果表明,重组质粒免疫后成功地诱导了体液免疫反应,且二者的血清抗体效价无显著性差异。     

hERG shRNA 表达载体构建及其稳定转染骨肉瘤细胞系MG-63、 SOSP-9607 的建立

目的:构建hERG钾离子通道蛋白(human ether-a-go-go-related gene potassium channel)shRNA表达载体质粒,获得稳定转染干扰质粒的人骨肉瘤细胞系MG-63、SOSP-9607。方法:将4对合成的寡核苷酸链退火形成双链,连接入pGPU6/GFP/Neo表达载体,并测序鉴定。使用脂质体法将重组的质粒转染至MG-63、SOSP-9607,通过G418筛选建立稳定转染的两种细胞系,采用免疫印迹(Western blot)技术检测hERG蛋白的表达。结果:测序结果证实shRNA与载体连接正确,免疫印迹实验证实hERG蛋白表达显著降低。结论:成功构建了hERG shRNA真核表达载体,获得了稳定表达hERG shRNA的人骨肉瘤细胞系MG-63和SOSP-9607。     

Expression cloning of cDNAs that render cancer cells resistant to Pseudomonas and diphtheria toxin and immunotoxins.

BACKGROUND: Several immunotoxins in which antibodies are coupled to plant or bacterial toxins are now in clinical trials for the treatment of cancer. One of these is B3-LysPE38 in which MAb B3 which reacts with many human cancers, is coupled with a genetically modified form of Pseudomonas exotoxin (PE). MATERIALS AND METHODS: To investigate how cells can become resistant to PE-derived immunotoxins, we constructed an immunotoxin-sensitive MCF-7 breast cancer cell line that contains SV40 T antigen and allows episomal replication of SV40 origin containing plasmids. We transfected a pCDM8/HeLa cDNA expression library into these cells, thereby causing over-expression of the plasmid-encoded genes. The transfected cells were treated with immunotoxin to select for resistance-mediating plasmids, which were reisolated from these cells and amplified in Escherichia coli. The resulting plasmid pool was transfected into cells for two further rounds of selection and plasmid reisolation. RESULTS: Several plasmids that caused immunotoxin resistance were enriched by this selection procedure. Four plasmids were stably transfected into MCF-7 cells and found to increase their resistance to PE-derived immunotoxins by 5- to 20-fold. These plasmids also confer resistance to native PE and to diphtheria toxin but not to ricin or cycloheximide. Thus, they appear to specifically interfere with the action of ADP-ribosylating toxins. CONCLUSION: Cancer cells can become resistant to immunotoxins by deregulated expression of normal genes. The clinical significance of this type of resistance will be evaluated in clinical trials.     

幽门螺杆菌VacA N端在巨噬细胞中表达对其细胞因子 分泌功能的影响

构建pDsRed-Monomer-C1/vacA N端真核表达载体,研究幽门螺杆菌空泡毒素单一毒力决定簇对THP-1巨噬细胞细胞因子分泌的影响.PCR扩增vacA目的基因片段,克隆人真核表达载体pDsRed-Monomer-C1中,经酶切、PCR及测序鉴定后,转染THP-1巨噬细胞中,Western blot和荧光显微镜鉴定VacA蛋白在细胞中的表达;电子显微镜和中性红摄人法观察巨噬细胞的空泡样变;ELISA法检测巨噬细胞培养上清TNF-α、IL-1β含量.重组质粒转染THP-1巨噬细胞24h,部分细胞胞浆中出现大小不等的空泡,且重组质粒组培养上清中TNF-α、IL-1β含量明显高于空质粒组和阴性对照组(P＜0.001),二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)下调细胞因子的分泌.结果显示,成功构建pDsRed-Monomer-C1-vacA真核表达载体;VacA蛋白瞬时高表达上调THP-1巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1β;核因子kB(nuclear factor kappaB,NF-kB)可能参与调节VacA诱导的THP-1巨噬细胞的分泌.     

The repair of UV-irradiated plasmids transfected into cultured fish cells

UV-irradiated plasmids (pNPV B and pBSCATSV) were transfected into RBCF-1 cells derived from a goldfish (Carassius auratus) and into a xeroderma pigmentosum (group A) cell line, XP20SSV. The frequency of stable neor transformation by pNPV B decreased in a dose-dependent manner. However, in spite of large differences in UV sensitivity detected in the colony formation assay, the dose-response curves of RBCF-1 cells and XP20SSV cells were almost the same. The photorecovery (PR) of transforming activity of UV-irradiated plasmids was confirmed in RBCF-1 cells but its extent was much smaller than that observed in the survival assay. The expression of the transfected cat (chloramphenicol acetyltransferase; CAT) gene after 24-h incubation in the dark was much more sensitive to UV irradiation when compared with the stable transformation assay. The extent of PR of cat gene expression in RBCF-1 cells was high and comparable with that of the survival assay. The CAT value of RBCF-1 cells transfected with UV-irradiated plasmids relative to that of unirradiated controls increased as incubation time in the dark after transfection became longer. This suggests that the UV lesions on the plasmids transfected in the RBCF-1 cells were repaired in the dark. The cat gene expression of UV-irradiated plasmids in XP20SSV was very low and independent of incubation time after transfection.     

c-myc protein can be substituted for SV40 T antigen in SV40 DNA replication.

Replicating activity of SV40 origin-containing plasmid was tested in human cells as well as in monkey CosI cells. All the plasmids possessing SV40 ori sequences could replicate, even in the absence of SV40 T antigen, in human HL-60 and Raji cells which are expressing c-myc gene at high level. The copy numbers of the replicated plasmids in these human cells were 1/100 as high as in monkey CosI cells which express SV40 T antigen constitutively. Exactly the same plasmids as the transfected original ones were recovered from the Hirt supernatant of the transfected HL-60 cells. Furthermore, replication of the SV40 ori-containing plasmids in HL-60 cells was inhibited by anti-c-myc antibody co-transfected into the cells. These results indicate that the c-myc protein can be substituted for SV40 T antigen in SV40 DNA replication.     

不同打靶位点影响人诱导多能干细胞MYO7A杂合突变位点的基因校正中CRISPR/Cas9介导的同源重组效率

应用CRISPR-Cas9系统对人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）进行基因编辑,为疾病模型的建立、致病机制研究、药物筛选及基因校正治疗疾病提供了更广阔的平台。相对于CRISPR-Cas9介导的基因敲除,应用该系统介导的同源重组实现基因点突变或突变校正效率要低、且难度偏大。为了实现对MYO7A杂合点突变（c.4118C>T）的人iPSCs的点突变校正,本文构建了表达maxGFP的pX330质粒。针对需校正的突变位点,设计5组识别序列并连接到maxGFP-pX330中构建靶向质粒。将5组打靶质粒分别转染HEK 293FT细胞48 h,细胞表达GFP;测序结果显示,MYO7A基因相应位点出现杂峰,表明打靶质粒具有打断活性。将同源模版单链寡核苷酸链（single-stranded DNA oligonucleotides, ssODN）与打靶质粒共同电转入人iPSCs后48 h,经流式分选出(5.8±2.2)%的细胞表达GFP。分选后细胞行单克隆扩增并测序。结果显示,打靶质粒1和ssODN组合对点突变校正未成功;打靶质粒2、3、4、5与ssODN组合均获得了校正后的细胞株。本研究表明,打断位点是影响同源重组校正效率的关键因素。当应用CRISPR/Cas9（或其它核酸酶）介导的同源重组进行基因编辑操作时,可以同时选择多个打靶位点造成基因组不同位置上的双链打断（double-stranded break, DSB）位点,以获得目的单克隆细胞株。本研究为应用CRISPR-Cas9系统对人诱导多能干细胞进行基因编辑提供了有力参考。