和厚朴酚对大肠埃希氏菌生物被膜形成的抑制机制

【目的】研究不同浓度的和厚朴酚(honokiol)抑制大肠埃希菌(Escherichia coli)的供试菌株10389生物被膜(biofilm,BF)形成的作用机制。【方法】用氯化三苯基四氮唑比色法(TTC)和四唑盐减低法(XTT)测定honokiol抑制E.coli10389生物被膜形成的药物最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)及其抑制作用与时间的关系;通过qRT-PCR法检测不同浓度的honokiol对E. coli 10389生物被膜形成基因和群体感应系统相关基因表达量的影响;通过生物发光法和qRT-PCR法检测亚-MIC honokiol对E. coli 10389呋喃糖基硼酸二酯(AI-2)及其调控的与生物被膜形成相关的下游基因表达量的影响。【结果】Honokiol能抑制E.coli10389生物被膜的形成,但不同浓度的honokiol抑制E. coli 10389 BF形成的作用机制不同。其中,与对照组相比,MIC的honokiol能使E. coli 10389 BF形成相关基因编码毒素(hha)和细菌酸性调节因子(ari R) mRNA的表达量显著提高,抗毒素...     

大肠埃希菌生物被膜基因调控研究进展

大肠埃希菌(Escherichia coli)是一种兼性厌氧、有鞭毛的革兰氏阴性短杆菌,常寄生于人和动物肠道内,是常见的人畜共患病病原之一。大肠埃希菌易形成生物被膜,这是一种由细菌群落分泌能够包裹自身的胞外基质与细菌结合形成的特殊聚集体,也是临床细菌感染疾病难以治愈的主要原因。生物被膜的形成不仅帮助细菌逃避宿主的防御系统,还可以降低或阻止药物发挥作用,从而诱发生物被膜相关感染(biofilm-associated infections, BAI)。本文从生物被膜形成的基因调控系统和相关调控蛋白等角度,归纳总结调控大肠埃希菌生物被膜形成的分子机制,并对防治BAI的策略进行了概述,为寻找合适的药物靶点以及防治BAI提供参考。     

白花丹素抗肿瘤作用机制的研究进展

恶性肿瘤一直是生物医学中的难题,利用放射疗法或化学疗法治疗肿瘤常会引发如呕吐、恶心等不良反应。因此,寻找安全有效治疗肿瘤的替代药物源非常重要。白花丹素(plumbagin, PLB)是从中草药白花丹根部提取出来的一种生物活性化合物,在肿瘤治疗中具有重要作用,并且有较好的抗癌活性。因此,本文将从肿瘤细胞的增殖、凋亡、转移和侵袭、血管生成、铁死亡过程以及化疗敏感性等六个方面对白花丹素的抗肿瘤作用及相关分子机制的研究进行综述,以期为基于白花丹素的抗肿瘤药物研发和临床应用提供科学参考。     

藻酸盐裂解酶对高黏液性肺炎克雷伯杆菌生物被膜的影响

为了研究藻酸盐裂解酶(AlgL)对高黏液型肺炎克雷伯杆菌(HvKP)生物被膜和细菌因子RpoS基因的影响,从临床送检的痰液样本中分离出30株肺炎克雷伯杆菌(KP)。采用全自动快速微生物质谱检测系统VITEK进行菌种鉴定,通过药敏试验进行耐药分析,拉丝试验阳性的菌株确定为HvKP;采用半定量结晶紫染色法进行细菌生物被膜半定量检测;用聚合酶链反应(PCR)检测RpoS基因的表达情况。试验发现,AlgL对HvKP生物被膜的形成有显著性抑制作用。本研究为AlgL在临床上用于治疗HvKP提供了研究基础。     

大肠埃希菌生物被膜体外模型的建立及黄连水提物对其抑制作用的初步研究

建立大肠埃希菌生物被膜（biofilm,BF）在Ф30培养皿和96孔板表面形成的体外模型,并开展黄连水煎液对BF抑制作用的初步研究。选取临床分离的大肠埃希菌菌株,在Ф30培养皿中采用LB（Luria-Bertani medium）培养基系统复制体外BF模型,经银染后利用显微摄影系统观察BF形态;在96孔板中采用LB培养基系统复制体外BF模型,采用MTT法利用酶标仪测定OD值。将黄连水煎液作用于大肠埃希菌生物被膜体外模型,分别采用MTT法和银染法考察黄连水提物对大肠埃希菌生物被膜的影响。Ф30培养皿表面可以观察到黑染呈棉絮状的膜样物而空白组没有此样物质;96孔板中,模型组的OD值为4．191,空白组的OD值为0．069;药物作用24h后黄连组的BF明显少于空白对照组;80mg／mL的黄连水煎液即开始对大肠埃希菌生物被膜有抑制作用,抑制率为20．8％,生药浓度达到180mg／mL时为最佳抑制浓度,抑制率为70．23％。Ф30培养皿和96孔板表面可以形成大肠埃希菌生物被膜,黄连水煎液可以抑制和破坏早期及成熟BF,且其抑制作用表现出了一定的量效关系,此方法对黄连水煎液作用于大肠埃希菌生物被膜是可行且稳定的,为应用于临床试验奠定基础。     

长春地区家禽(家畜)中E.coli O157∶H7调查

为了通过对宿主动物EHEC O157∶H7监测,了解长春地区肠出血性大肠埃希菌O157∶H7的污染状况,建立流行病学监测网,以便为疾病预防控制提供良好的科学依据。结果在采集的639份家禽、家畜粪便样品中共检出7株EHEC O157∶H7。     

氨溴索对粘液型铜绿假单胞菌生物膜藻酸盐作用的体外研究

目的探讨氨溴索对铜绿假单胞菌临床分离株形成的生物膜（biofilm,BF）主要成分藻酸盐的干预作用,研究其对藻酸盐合成过程中起重要作用的基因表达和合成过程中限速酶活性的影响,以及其对藻酸盐降解的影响。方法建立铜绿似单胞菌临床分离株BF体外模型,培养7d后得到成熟BF。将BF内的细菌振荡下来后,用疏酸-苯酚法检测氨溴索对藻酸盐含量的影响;RT-PCR检测藻酸盐合成过程中重要基因algD、algU、algR和mucA的mRNA表达;分光光度计检测合成过程中限速酶——GDP-甘露糖脱氢酶（guanosine diphospho-D-mannose dehydrogenase,GMD）的活性,并检测藻酸盐的降解情况。结果在氨溴索3．75mg／ml作用下,藻酸盐含量（mg／g）由86．4024±0．8588下降到59．9199±0．5803（F=66．2,P〈0．01）;其合成重要基因algD、algU、algR和mucA的mRNA的表达分别由1．2994±0．0173、1．0488±0．0457、0．9888±0．0267和0．8731±0．0336变化为1．0253±0．0265、0．9594±0．0106、0．8536±0．0179和1．0770±0．0503（F=91．9,41．1,88．4和56,9,P均〈0．05）;其合成限速酶GMD活性由0．0989±0．0055下降到0．0558±0．0016（F=121．2,P〈0．01）;藻酸盐的降解量（△mg／g）由1．4122±0．0073变化为1．4175±0．0019（F=21．81,P〉0．05）。1．875mg／ml氨溴索作用下,有同样的趋势但效应不如高浓度明显。结论氨溴索可以降低铜绿假单胞菌BF藻酸盐的含量,影响藻酸盐合成过程中重要基因algD、algU、algR和mucA的mRNA的表达,降低藻酸盐合成限速酶GMD活性,但对藻酸盐的降解无影响。     

氨溴索对粘液型铜绿假单胞茵生物膜藻酸盐作用的体外研究

目的探讨氨溴索对铜绿假单胞菌临床分离株形成的生物膜（biofilm,BF）主要成分藻酸盐的干预作用,研究其对藻酸盐合成过程中起重要作用的基因表达和合成过程中限速酶活性的影响,以及其对藻酸盐降解的影响。方法建立铜绿似单胞菌临床分离株BF体外模型,培养7d后得到成熟BF。将BF内的细菌振荡下来后,用疏酸-苯酚法检测氨溴索对藻酸盐含量的影响;RT-PCR检测藻酸盐合成过程中重要基因algD、algU、algR和mucA的mRNA表达;分光光度计检测合成过程中限速酶——GDP-甘露糖脱氢酶（guanosine diphospho-D-mannose dehydrogenase,GMD）的活性,并检测藻酸盐的降解情况。结果在氨溴索3．75mg／ml作用下,藻酸盐含量（mg／g）由86．4024±0．8588下降到59．9199±0．5803（F=66．2,P〈0．01）;其合成重要基因algD、algU、algR和mucA的mRNA的表达分别由1．2994±0．0173、1．0488±0．0457、0．9888±0．0267和0．8731±0．0336变化为1．0253±0．0265、0．9594±0．0106、0．8536±0．0179和1．0770±0．0503（F=91．9,41．1,88．4和56,9,P均〈0．05）;其合成限速酶GMD活性由0．0989±0．0055下降到0．0558±0．0016（F=121．2,P〈0．01）;藻酸盐的降解量（△mg／g）由1．4122±0．0073变化为1．4175±0．0019（F=21．81,P〉0．05）。1．875mg／ml氨溴索作用下,有同样的趋势但效应不如高浓度明显。结论氨溴索可以降低铜绿假单胞菌BF藻酸盐的含量,影响藻酸盐合成过程中重要基因algD、algU、algR和mucA的mRNA的表达,降低藻酸盐合成限速酶GMD活性,但对藻酸盐的降解无影响。     

聚乙二醇小檗碱液对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌生长的抑制作用

目的 明确聚乙二醇小檗碱液在琼脂培养基表面的抑菌特点,及其对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的标准菌株、抗生素敏感菌株与多重耐药菌株生长的抑制作用,研究评价药物在皮肤黏膜表面的抑菌作用的合理实验方法.方法 以大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌(标准菌株、抗生素敏感菌株和多重耐药菌株)为研究对象,用常量肉汤稀释法测定聚乙二醇小檗碱液的最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC);用平皿琼脂培养法和试管肉汤培养法测定不同浓度聚乙二醇小檗碱液的抑菌作用.结果 在不同浓度的聚乙二醇小檗碱液的作用下,在琼脂培养基表面上或肉汤培养基中细菌的生长受到明显抑制,抑制作用与小檗碱浓度正相关,且对抗生素敏感菌株和多重耐药菌株的抑制作用差异无统计学意义;聚乙二醇小檗碱液在平皿琼脂表面和试管肉汤中对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌抑制100％菌株的浓度分别为1 500和375 mg/L、1 500和375 mg/L.聚乙二醇小檗碱液在琼脂培养基表面的抑菌作用明显低于在肉汤培养基中的抑制作用,在琼脂培养基表面的抑菌浓度是肉汤培养基中的抑菌浓度的4倍.并且金黄色葡萄球菌与大肠埃希菌之间差异无统计学意义.聚乙二醇小檗碱液必须达到肉汤培养基中4倍以上浓度时,才能获得抑制100％细菌在琼脂培养基表面生长的效果.结论 高浓度的聚乙二醇小檗碱液可以抑制皮肤黏膜表面的细菌,包括抗生素耐药菌株的生长;皮肤黏膜表面应用聚乙二醇小檗碱液的适宜浓度为1 500 mg/L.琼脂培养基法适用于评价药物在皮肤黏膜表面的抑菌作用.     

不同浓度白花丹素对骨肉瘤细胞MG-63凋亡迁移、基质金属蛋白酶及Bcl-2、Bax、Ezrin蛋白表达的影响

目的:研究不同浓度白花丹素对骨肉瘤细胞MG-63凋亡迁移、基质金属蛋白酶(MMP)及Bcl-2、Bax、Ezrin蛋白表达的影响。方法:取对数生长期的骨肉瘤MG-63细胞,传代培养成细胞株后以随机法分成对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。其中对照组加入到0.1%浓度的DMSO完全培养基中培养,低剂量组、中剂量组、高剂量组分别加入到浓度为5、10、20μmol/L的白花丹素的有关培养基中培养。培养24 h后,采用Transwell法检测MG-63细胞迁移率、Hoechst33342染色法检测MG-63细胞凋亡率、Western blot法检测四组MG-63细胞的MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax、Ezrin蛋白表达水平。结果:培养24 h后,低剂量组、中剂量组、高剂量组的骨肉瘤细胞MG-63凋亡率及Bax蛋白表达水平均较对照组升高(P<0.05),且随白花丹素浓度的增加而升高(P<0.05);骨肉瘤细胞MG-63的细胞迁移率、MMP-2、MMP-9、Bcl-2及Ezrin蛋白表达水平较对照组降低(P<0.05),且随白花丹素浓度的增加而降低(P<0.05)。结论:白花丹素对骨肉瘤细胞MG-63凋亡的促进作用以及迁移的抑制作用明显,其作用机制可能与抑制骨肉瘤细胞MG-63中的MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Ezrin蛋白表达及促进Bax蛋白表达有关,且浓度越高,抑制或促进作用越明显。     

Over-expression in E. coli and purification of the human OCTN1 transport protein

The hOCTN1 amplified from skin fibroblast RNA was cloned in pET-28a(+) or in pH6EX3 plasmid. The encoded recombinant hOCTN1 resulted in a 6-His tagged fusion protein with a 34 or 21 amino acid extra N-terminal sequence in the pET-28a(+)-hOCTN1 or in the pH6EX3-hOCTN1 constructs, respectively. Both constructs were used to express the hOCTN1 in Escherichia coli Rosetta(DE3)pLysS. The best over-expression was obtained with the pH6EX3-hOCTN1 after 6 h of induction with IPTG at 28 °C. The expressed protein with an apparent molecular mass of 54 kDa, was collected in the insoluble fraction of the cell lysate. Further improvement was obtained using the E. coli RosettaGami2(DE3)pLysS strain to express the protein encoded by pH6EX3-hOCTN1. After 6 h of induction with IPTG at 28 °C, hOCTN1 accounted for 30% of the total protein in the insoluble pellet. This protein fraction was washed with Triton X-100 and deoxycholate, solubilized with a buffer containing 0.8% Sarkosyl, 3 M urea and applied to a Ni²⁺-chelating chromatography column. The homogeneously purified hOCTN1 was eluted with a buffer containing 50 mM imidazole, 0.1% Triton X-100 and 50 mM 2-mercaptoethanol. A yield of about 3 mg purified protein per liter of cell culture was obtained.     

Evidence for demand-regulation of ribosome accumulation in E coli

We have determined the relative concentrations of ribosomes accumulated under different growth conditions for a number of translational mutants as well as for some natural isolates of Escherichia coli. The mutants are a tRNA modification mutant (miaA), a streptomycin resistant (SmR) and a streptomycin pseudodependent (SmP) mutant as well as two ribosome ambiguity (ram) mutants. The natural isolates used in this study are known to function with submaximal ribosome kinetics. The data show that for all the ribosome mutants the concentration of ribosomes relative to that in wild type bacteria increases when the growth rate decreases. A small increase is also seen in the natural isolates. In contrast, the miaA mutant shows no increase in ribosome concentration under the same slow growth conditions. The results suggest that bacteria with kinetically impaired ribosomes can to some extent increase the number of ribosomes accumulated under poor growth conditions in order to compensate for their slower function. We use this observation to explain in part how bacteria growing in natural environments can escape the strong selection for maximized growth rates and for optimized ribosomes that are characteristic of laboratory strains.     

大肠杆菌基因组中存在Era亲和蛋白的基因

构建了一个大肠杆菌基因组DNA λ ZAP表达文库,以Dig标记的Era为探针,从4×10⁴噬斑中筛选到一个与探针呈特异结合的噬斑,说明大肠杆菌基因组中确有Era亲和蛋白基因存在.将该噬菌体中插段DNA前800 bp的测序结果与1996年底完成的大肠杆菌基因组全序列作同源性比较,发现该插段序列位于大肠杆菌基因组的第267 section.     

外源基因在大肠杆菌中表达的研究进展

大肠杆菌是外源基因表达的首选体系.大肠杆菌中外源蛋白可定位于胞内、周质或胞外培养基中.按照重组蛋白的可能命运,综述了最近几年大肠杆菌表达体系的研究进展.     

基于卷积神经网络的大肠杆菌启动子预测

目的 基于位点特异性打分矩阵（position-specific scoring matrices,PSSM）的预测模型已经取得了良好的效果,基于PSSM的各种优化方法也在不断发展,但准确率相对较低,为了进一步提高预测准确率,本文基于卷积神经网络（convolutional neural networks,CNN）算法做了进一步研究。方法 采用PSSM将启动子序列处理成数值矩阵,通过CNN算法进行分类。大肠杆菌K-12（Escherichia coli K-12,E.coli K-12,下文简称大肠杆菌）的Sigma38、Sigma54和Sigma70 3种启动子序列被作为正集,编码（Coding）区和非编码（Non-coding）区的序列为负集。结果 在预测大肠杆菌启动子的二分类中,准确率达到99%,启动子预测的成功率接近100%;在对Sigma38、Sigma54、Sigma70 3种启动子的三分类中,预测准确率为98%,并且针对每一种序列的预测准确率均可以达到98%以上。最后,本文以Sigma38、Sigma54、Sigma70 3种启动子分别和Coding区或者Non-coding区序列做四分类,预测得到的准确性为0.98,对3种Sigma启动子均衡样本的十交叉检验预测精度均可以达到0.95以上,海明距离为0.016,Kappa系数为0.97。结论 相较于支持向量机（support vector machine,SVM）等其他分类算法,CNN分类算法更具优势,并且基于CNN的分类优势,编码方式亦可以得到简化。     

35S标记重组植物钙调素的制备方法

利用³⁵S标记的氨基酸混合物喂养工程菌,成功地制备了³⁵S标记的拟南芥钙调素亚型2（³⁵S-ACaM2）,对其纯度、放射活度、电泳行为及其灵敏性等进行了检测.结果表明从工程菌中制备的³⁵S-ACaM2纯度高、放射活度高、Ca²⁺与EGTA存在时的电泳行为与未标记的ACaM2相同,可作为一种高灵敏性的探针用于检测钙调素结合蛋白.     

大肠杆菌碱性磷酸酶的体外定向进化研究

大肠杆菌碱性磷酸酶（E.coli alkaline phosphatase, EAP, EC 3.1.3.1）是一个非特异性二聚体磷酸单酯酶. 采用易错聚合酶链反应(error prone PCR)的方法,在原有高活力突变株的基础上,对EAP远离活性中心催化三联体的区域进行定向进化,经两轮error prone PCR,获得催化活力较亲本D101S突变株提高3倍、较野生型酶提高35倍的进化酶4-186,并对该酶的催化动力学特征进行了分析. 进化酶基因的DNA测序表明4-186含两个有义氨基酸置换：K167R和S374C,二者既不位于底物结合位点,也不位于酶的金属离子结合位点.     

大肠杆菌的蛋白分泌机制

大肠杆菌的分泌蛋白定位于内膜、外膜、周质空间和胞外环境,它们在N端或C端带有一定的结构包含着分泌信号,这两类分泌蛋白在各自特定的一组蛋白因子的协助下跨越内膜,再通过目前尚不清楚的方式实现其最终定位.N端带有信号肽的分子在跨越内膜时得到Sec家族蛋白因子协助,信号肽在跨膜过程中可能被切除,该过程由ATP和电化学势提供能量.C端带分泌信号的分子主要受到Hly家族分子协助,一次穿过内膜和外膜而不经过周质空间.     

影响大肠杆菌中外源基因表达的因素

大肠杆菌已经被广泛地应用于表达各种外源基因,但是,不同的外源基因在表达效率上却有很大的差异,文章综述了影响大肠杆菌中外源基因表达的因素,这将有助于认识大肠杆菌中外源基因表达的规律,以便采取有效的方法提高外源基因在大肠杆菌中的表达效率．     

Substrate antagonism in the kinetic mechanism of E. coli phosphofructokinase-1

In the presence of its allosteric activator GDP, the major phosphofructokinase-1 from Escherichia coli K12 follows Michaelis—Menten kinetics. The kinetic behavior observed at steady-state using different concentrations of the substrates ATP and fructose-6-phosphate and the pattern of inhibition by the substrate analogs adenylyl-(β,γ-methylene)-diphosphonate and D-arabinose-5-phosphate are consistent with a random sequential mechanism in rapid equilibrium, rather than with an ordered binding as was suggested earlier. However, ATP and fructose-6-phosphate do not bind independently to the same active site, since the apparent affinity for one substrate is decreased about 20-fold when the other substrate is already bound. The antagonism between ATP and fructose-6-phosphate shows that a negative interaction occurs during the reaction with E. coli phosphofructokinase-1 which must be considered in addition to its allosteric properties.