副溶血弧菌TF2中整合接合元件ICEVpaTF2的生物信息学特征和剪切、环化活性

[目的] 从副溶血弧菌TF2基因组框架序列中拼接获得整合性接合元件（ICE）ICEVpaTF2的全序列,分析其基因组学特征;研究ICEVpaTF2是否具有从基因组中剪切、环化活性以及剪切、环化时attB和attP位点如何形成。[方法] 对副溶血弧菌TF2基因组框架序列进行RAST注释,发现其基因组中可能存在一个完整的ICE元件,命名为ICEVpaTF2,经过人工拼接和PCR扩增测序验证,得到完整的ICEVpaTF2序列,并对ICEVpaTF2再次进行RAST注释和ICE元件部分特征分析。通过PCR检测,探索ICEVpaTF2是否能够从基因组剪切并环化。通过attL、attR、attB、attP位点序列比较,探索attB和attP重组特征。[结果] ICEVpaTF2全长83588 bp,包含SXT/R391家族ICE元件的52个保守核心基因,它们与ICE切除、整合、自我转移和调节机制相关。ICEVpaTF2也包含5个外源基因插入的热点区（HS）、2个可变区（VR）以及3个非典型插入位点。HS和VR包含了大量可变基因,它们负责编码限制性修饰系统、DNA修复系统或毒素-抗毒素系统等,赋予宿主广泛适应性功能,ICEVpaTF2也包含独特未知功能基因。通过对int、xis二个核心保守基因种系发生分析,发现ICEVpaTF2的int、xis分别属于以R391和SXT为代表的亚群。ICEVpaTF2在attL和attR处发生剪切并完成环化,新形成杂合重组的attB和attP位点。[结论] ICEVpaTF2属于SXT/R391家族,是一个具备自我剪切和环化能力的完整ICE元件,剪切后新形成的attB和attP位点由attL、attR杂合重组形成。     

肠球菌CRISPR-Cas系统基因结构的分析及其与耐药基因的关系

CRISPR-Cas系统是一种细菌的适应性免疫系统,参与特异性防御不同类型的可移动遗传元件,如质粒、噬菌体、转座子等的入侵。旨在分析肠球菌（Enterococcus）基因组中该系统的基因结构,并探讨其与细菌耐药基因之间的关系。NCBI数据库中下载10种肠球菌的全基因组信息,利用软件对CRISPR-Cas系统的分布、cas1基因、重复序列、间隔序列等进行比对分析;查找耐药相关基因,分析其与CRISPR-Cas系统之间的关系。235株肠球菌中含完整CRISPR-cas系统的有35株（14.9%）,含确定CRISPR阵列196个和cas基因簇46个。肠球菌基因组中CRISPR系统主要为II-A型（80.4%）,其次是II-C型（15.2%）,cas1基因序列的系统发育分析结果与CRISPR-cas系统的分型基本一致。肠球菌CRISPR-Cas系统的分布在不同菌种之间差异较大;CRISPR-Cas系统可能阻碍肠球菌某些耐药基因的水平转移。     

嗜热链球菌CRISPR-Cas系统的检测

【目的】CRISPR-Cas系统为嗜热链球菌抵抗噬菌体等外源基因元件提供获得性免疫,分析NCBI中已公开发表全基因组序列的9株嗜热链球菌所含CRISPR-Cas系统的数目和类型,对实验室相应菌株的CRISPR-Cas系统进行检测。【方法】利用生物信息学方法对NCBI中9株已测序嗜热链球菌所含CRISPR-Cas系统进行分析,根据其Cas基因序列设计引物,对实验室嗜热链球菌菌株的Cas基因进行扩增、测序,分析实验室6株嗜热链球菌的CRISPR-Cas系统情况。【结果】9株标准菌株均含不同数目的CRISPR-Cas系统,其类型主要为Ⅱ-A型、Ⅲ-A型和Ⅰ-E型,各类型的标志Cas基因高度保守。6株供试菌中,S4仅含Cas9基因,其它5株均含有Cas9基因、Cas10基因和Cas9*基因,79和KLDS3.0207还含有Cas3基因。【结论】可根据标准菌株高度保守的Cas基因设计引物,预测未知嗜热链球菌所含CRISPRCas系统的数目和类型。S4仅含1个Ⅱ-A型CRISPR-Cas系统,其它5株均含有2个Ⅱ-A型CRISPR-Cas系统和1个Ⅲ-A型CRISPR-Cas系统,此外,79和KLDS3.0207均含有1个Ⅰ-E型CRISPR-Cas系统。     

临床分离志贺菌中CRISPR/Cas系统的分布及其与毒力基因的关系

【目的】了解临床分离志贺菌中CRISPR/Cas系统的分布特征并分析其与毒力基因的关系。【方法】以聚合酶链式反应(PCR)方法,采用10对引物分别对57株临床分离志贺菌中CRISPR1、cas2-cas1、cas6e-cas5、cas7、cse2、cse1-cas3基因和毒力基因ipaH、ial、ipaBCD、virA进行检测。对CRISPR1的PCR结果进行测序,并用CRISPR finder在线软件对CRISPR1基因座进行分析。通过卡方检验初步分析CRISPR/Cas系统与毒力基因的关系。【结果】测序结果显示,CRISPR1基因座中间隔序列数目较少且在不同菌株间一致性较高;57株志贺菌中,84.2% (48/57)的志贺菌中可检测到CRISPR/Cas系统,其中68.8% (33/48)的志贺菌中cas6e-cas5基因或(和) cse2基因中发现插入序列;毒力基因ipaH、ial、virA、ipaBCD的检出率依次为100%、100%、98.2%和87.7%;毒力基因ipaBCD的阳性率与活性CRISPR/Cas系统的分布无关(P>0.05)。【结论】CRISPR/Cas系统广泛存在于临床分离志贺菌中;部分cas基因中有插入序列;并未发现志贺菌中活性CRISPR/Cas系统与毒力基因的分布有关。     

极端酸性矿山环境微生物基于CRISPR系统的适应性免疫机制

【目的】通过对酸性矿山环境中嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、钩端螺旋菌属(Leptospirillum)、硫化杆菌属(Sulfobacillus)、酸原体属(Acidiplasma)和铁质菌属(Ferroplasma)的100株冶金微生物基因组中CRISPR-Cas系统的结构特征和同源关系进行生物信息学分析,在基因组水平上解析冶金微生物基于CRISPR系统对极端环境的适应性免疫机制。【方法】从NCBI网站下载基因组序列,采用CRISPR Finder定位基因组中潜在的CRISPR簇。分析CRISPR系统的组成结构与功能:利用Clustal Omega对重复序列(repeat)分类;将间隔序列(spacer)分别与nr数据库、质粒数据库和病毒数据库比对,获得注释信息;根据Cas蛋白的种类和同源性对酸性矿山环境微生物的CRISPR-Cas系统分型。【结果】在100株冶金微生物基因组中共鉴定出415个CRISPR簇,在176个c CRISPR簇中共有80种不同的重复序列和4147条间隔序列。对重复序列分类,发现12类重复序列均能形成典型的RNA二级结构,Cluster10中的重复序列在冶金微生物中最具有代表性。间隔序列注释结果表明,这些微生物曾遭受来自细菌质粒与病毒的攻击,并通过不同的防御机制抵抗外源核酸序列的入侵。冶金微生物细菌的大部分CRISPR-Cas系统属于I-C和I-E亚类型,而古菌的CRISPR-Cas系统多为I-D亚类型,两者基于CRISPR-Cas系统的进化过程中存在显著差异。【结论】酸性矿山环境微生物的CRISPR结构可能采用不同免疫机制介导外源核酸序列与Cas蛋白的相互作用,为进一步揭示极端环境微生物的适应性进化机理奠定了基础。     

创伤弧菌毒力相关因子的全基因组关联分析研究

【目的】创伤弧菌是致死率最高的弧菌物种,但目前尚无在全基因组层面挖掘毒力相关因子的研究。本研究以创伤弧菌分离来源(临床和环境)作为不同表型,通过与260株基因组序列进行关联分析,挖掘毒力相关因子,从而进一步了解创伤弧菌致病因素。【方法】对139株创伤弧菌分离株进行高通量测序,获取其全基因组序列;与公共数据库已公开发表的121株基因组整合,使用pyseer软件进行全基因组关联分析,对与不同分离来源显著相关的基因进行注释和解读。【结果】共发现11个基因与临床分离株显著相关,其中9个是本研究新发现的创伤弧菌潜在毒力相关因子。【结论】本研究使用群体基因组学和统计遗传学方法,在全基因组范围扫描挖掘了创伤弧菌毒力相关因子,为深入揭示该物种致病机制、设计新的疫苗和治疗靶点提供了重要依据。     

CRISPR-Cas9系统与mazF介导的大片段删减法在酿酒酵母染色体大片段删减中的比较

【目的】比较CRISPR-Cas9系统与maz F法这两种酿酒酵母染色体大片段删减方法。【方法】分别用上述两种方法删减了酿酒酵母长度为26.5 kb的染色体大片段YKL072W-YKL061W,并比较了两种方法的转化效率、敲除成功率。【结果】利用CRISPR-Cas9系统平均得到5个转化子,但正确率为100%;maz F法得到约100个转化子,正确率略低于前者,为93%。【结论】两种方法均能高效删减酿酒酵母染色体大片段,CRISPR-Cas9系统正确率较高,操作简便省时;maz F法相对稳定,对目的基因无PAM位点要求。     

沙门氏菌CRISPR位点的结构特征比较

成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR),是存在于多数细菌和古菌中的遗传结构,能够有效防御外源DNA的入侵(质粒、噬菌体等),进而防御外源基因的水平转移。【目的】本研究以沙门氏菌属中常见的鸡伤寒沙门氏菌(Salmonella gallinarum)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)以及肠炎沙门氏菌(salmonella enteritidis)等30个菌株为研究对象。探索CRISPR位点在不同沙门氏菌种中的结构差异。【方法】通过生物信息学的方法比较间隔序列与插入序列的同源性以及CRISPR位点与质粒数量关系。【结果】30株沙门氏菌中均存在CRISPR结构,包括CRISPR位点61个以及可疑位点12个。重复序列和cas1基因均不能作为这4类细菌的分类依据。【结论】虽然我们发现CRISPR位点数量与间隔区数量和质粒数量之间均不存在统计学关系,但间隔序列整合子、耐药基因等移动遗传原件具有一定的同源性,说明沙门氏菌在进化过程中不断受外源基因的侵袭。     

基于内源III-B型CRISPR-Cas系统构建超嗜热火球菌Pyrococcus yayanosii A1的基因敲降系统

【目的】亚氏火球菌(Pyrococcusyayanosii)A1菌株的最适生长温度为98°C,最适生长压力为5.2×104Pa,是研究此类严格厌氧、超嗜热和兼性嗜压古菌的环境适应性机制的良好材料。本研究基于P. yayanosii A1基因组中III-B型CRISPR-Cas系统,旨在建立可应用于此类古菌的基因表达敲降系统(geneknock-downsystem)。【方法】人工构建的mini-CRISPR簇,由内源性CRISPR簇Group1的重复序列(repeats)和待敲降的淀粉酶基因(PYCH_13690)中的原间隔序列(protospacer)组成。将该mini-CRISPR簇插入到具有辛伐他汀抗性的穿梭载体p LMOShhp中,使之转录与目的基因m RNA匹配的cr RNA,引导Cmr复合物对其进行切割。【结果】使用高静水压(HHP)诱导型启动子Phhp诱导mini-CRISPR簇表达时,淀粉酶基因的m RNA数量在5.2×104Pa静水压时下调到原来的67.05%,在1.0×102Pa静水压时下调为原来的49.69%;而使用组成型启动子Phmtb诱导mini-CRISPR簇表达时,淀粉酶基因的m RNA数量在5.2×104Pa静水压时下调为原来的58.48%,在1.0×102Pa静水压时下调为原来的23.97%。使用鲁戈氏碘液显色法对这两类基因表达敲降突变菌株的培养物中残留的淀粉含量进行分析,结果显示突变菌株的淀粉降解能力明显降低。【结论】在P. yayanosii A1中建立了基于内源Ⅲ-B型CRISPR-Cas系统的基因敲降系统,可以用于抑制此类超嗜热嗜压古菌体内基因的表达。     

醋酸菌中CRISPR位点的比较基因组学与进化分析

CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是近几年发现的一种广泛存在于细菌和古菌中,能够应对外源DNA干扰(噬菌体、病毒、质粒等),并提供免疫机制的重复序列结构。CRISPR系统通常由同向重复序列、前导序列、间隔序列和CRISPR相关蛋白组成。本研究以醋酸发酵中常见3个属醋杆菌属(Acetobacter)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)和葡糖杆菌属(Gluconobacter)的48个菌株为研究对象,通过其基因组上CRISPR相关基因序列的生物信息学分析,探索CRISPR位点在醋酸菌中的多态性及其进化模式。结果表明48株醋酸菌中有32株存在CRISPR结构,大部分CRISPR-Cas结构属于type I-E和type I-C类型。除了葡糖杆菌属外,葡糖醋杆菌属和醋杆菌属中的部分菌株含有II类的CRISPR-Cas系统结构(CRISPR-Cas9)。来自不同属菌株的CRISPR结构中重复序列具有较强的保守性,而且部分菌株CRISPR结构中的前导序列具有保守的motif (与基因的转录调控有关)及启动子序列。进化树分析表明cas1适合用于醋酸菌株的分类,而不同菌株间cas1基因的进化与重复序列的保守性相关,预示它们可能受相似的功能选择压力。此外,间隔序列的数量与噬菌体数量及插入序列(Insertion sequence, IS)数量有正相关的趋势,说明醋酸菌在进化过程中可能正不断受新的外源DNA入侵。醋酸菌中CRISPR结构位点的分析,为进一步研究不同醋酸菌株对醋酸胁迫耐受性差异及其基因组稳定性的分子机制奠定了基础。     

托光柄菇属一中国新记录种

[背景] 托光柄菇属（Volvopluteus）隶属于光柄菇科（Pluteaceae）,目前世界上仅有4个种。[目的] 调查我国东北地区大型真菌资源。[方法] 采集大型真菌标本,对其形态进行详细的观察和描述,提取DNA,测定rDNA ITS序列,基于最大似然法和贝叶斯法构建系统发育树。[结果] 2019–2020年在吉林省延边朝鲜族自治州敦化市采集的标本中,有6份标本为密执安托光柄菇V.michiganensis,该种真菌此前未在我国发现。在系统发育分析中,采自我国的密执安托光柄菇V.michiganensis与该种的模式标本聚为一个分支。[结论] 密执安托光柄菇V.michiganensis为中国新记录种。     

犬种布鲁氏菌ZG株单克隆抗体4H3抗原模拟表位的筛选及分析

【背景】目前犬布鲁氏菌病诊断存在一定的困难。【目的】筛选并研究犬种布鲁氏菌单克隆抗体4H3株的特异性抗原表位。【方法】利用噬菌体肽库展示技术,以犬种布鲁氏菌单克隆抗体4H3株作为靶分子,包被酶标板,用12肽随机肽库经过3轮生物淘洗程序进行筛选。经过3轮筛选后,噬菌体产出率从5.00×10^-7增加到9.84×10^-6,假阳性率逐轮降低。从第3轮筛选的阳性克隆中随机挑取14个进行增殖,提取基因组DNA,进行测序分析;并通过iELISA和cELISA检测阳性克隆的亲和性和特异性。【结果】14株阳性单克隆噬菌体共出现3种不同的短肽序列,分别是KMSIRHPIRLPI、ILRRRRKRIIQI和QRIHMRLTTQS;iELISA结果表明3种短肽序列与单克隆抗体的亲和性依次为KMSIRHPIRLPI>ILRRRRKRIIQI>QRIHMRLTTQS;cELISA结果显示短肽KMSIRHPIRLPI和ILRRRRKRIIQI特异性较强。对亲和性较强、特异性较高的2条短肽KMSIRHPIRLPI和ILRRRRKRIIQI展开具体分析,比对分析表...     

产气荚膜梭菌前噬菌体的分布特点及遗传进化分析

【目的】分析和研究产气荚膜梭菌中前噬菌体的分布情况、基因组特点及遗传进化关系。【方法】利用PHASTER (phage search tool enhanced release)软件预测产气荚膜梭菌携带的前噬菌体,基于ANI (average nucleotide identity)值对前噬菌体进行分群,利用CARD (comprehensive antibiotic research database)、Res Finder 4.1、VFDB (virulence factors database)和Bac Met(antibacterial biocide&metal resistance genes database)分析前噬菌体携带的耐药基因、毒力基因、抗菌剂/金属离子抗性基因,利用CRISPRCas Finder分析产气荚膜梭菌的CRISPR-Cas系统,利用MEGA 7.0进行前噬菌体的遗传进化关系分析。【结果】产气荚膜梭菌平均携带前噬菌体2.67条,其长度呈双峰分布,平均占基因组2.23%;前噬菌体不携带耐药基因,但携带了α毒素、唾液酶和溶血素等毒力基因以及重金属...     

乌鳢源杀鱼爱德华菌的分离鉴定及药敏特性研究

【背景】江苏省扬州市某乌鳢养殖场发生疾病,给养殖户造成了严重的经济损失。【目的】确定病因并筛选出敏感药物,为乌鳢相关疾病的防治提供参考。【方法】从患病乌鳢体内分离致病菌,并从形态、生理生化特征、16S rRNA和gyrB基因序列及特异性PCR检测等方面对分离菌株进行鉴定,同时开展人工感染试验分析其致病性,通过纸片扩散法进行药敏特性分析。【结果】从患病乌鳢体内分离获得优势菌株SHL,经形态特征、理化特性、16SrRNA和gyrB基因序列及特异性PCR检测鉴定为杀鱼爱德华菌。进一步人工感染试验证实其对乌鳢有较强的致病性,LD50为1.6×105 CFU/g,发病症状与自然发病症状相似。药敏试验结果显示,该菌株对青霉素、氯霉素、四环素等28种抗菌药物高度敏感,对红霉素中度敏感,对苯唑西啉、克拉霉素、万古霉素等6种药物耐药。【结论】引起江苏省扬州市某养殖场的乌鳢体表溃烂及死亡的病原菌为杀鱼爱德华菌,这是我国首次从淡水鱼类中检出致病性杀鱼爱德华菌,表明该菌的感染谱在扩大,需引起水产养殖领域的重视,在养殖过程中可根据药敏实验结果选用合适的国标渔药进行防治。     

海南地区与环渤海湾美人鱼发光杆菌美人鱼亚种水产动物分离株的表型与遗传特征分析

美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.damselae,PDD)是一种广泛分布于海洋环境内的重要病原菌,可导致多种海洋生物患病死亡,近年来在我国不同养殖区域内均有发现和报道.[目的]通过生理代谢表型、毒力基因分布和分子遗传分析,系统比较我国海南地区和环渤海湾不同株系PDD...     

橡胶树暹罗炭疽菌Zn2Cys6型转录因子CsGcc1的生物学功能

【背景】暹罗炭疽菌（Colletotrichum siamense）是一种重要的病原真菌,可以引起炭疽病,给全球橡胶产业带来巨大的经济损失。Zn₂Cys₆型转录因子是真菌特有的锌指类转录因子,通常参与调控真菌的生长发育过程。【目的】在暹罗炭疽菌中鉴定了一个与稻瘟病菌Gcc1同源的Zn₂Cys₆型转录因子CsGcc1,并研究其功能。【方法】根据同源重组原理构建CsGCC1的基因敲除突变体,并通过营养生长、H₂O₂敏感性、分生孢子产生及萌发、玻璃纸试验和致病性分析,明确CsGcc1的功能。【结果】CsGcc1编码一个含有646个氨基酸的蛋白,而且含有一个GAL4结构域。CsGCC1基因在培养36 h的菌丝及分生孢子中具有较高的表达量。CsGCC1基因敲除突变株营养生长速率降低且对H₂O₂更加敏感。相较于野生型菌株,突变株的分生孢子产量、萌发率及附着胞形成率均降低。此外,CsGCC1的敲除可以明显降低分生孢子的穿透能力,突变株对橡胶叶片的致病力减弱。【结论】Zn₂Cys₆型转录因子CsGcc1参与调控暹罗炭疽菌的营养生长、氧化应激、分生孢子发育及致病性等过程。