单增李斯特菌新疆分离株lmo2193基因克隆及序列分析

根据GenBank中的lmo2193基因序列设计特异性引物,利用PCR方法对lmo2193基因进行扩增,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,测序后对基因核苷酸序列进行分析,预测其编码蛋白质的二三级结构,对其进行同源性及遗传变异分析。新疆分离株LM90SB2的lmo2193基因序列全长为1 303 bp,包含1 077 bp开放阅读框,共编码358个氨基酸;LM90SB2株lmo2193基因核苷酸序列与NTSN、F2365、81-0582、10-0809、02-1792相似性为99.99%;与SLCC2755、H34、WSLC1019相似性为99.3%～99.7%;与C1-387、L2625、10-4754、lm3136相似性为98.2%～98.3%。推导的氨基酸同源性为95.3%～99.7%。分子进化树表明,LM90SB2菌株lmo2193基因与4b型菌株的亲缘关系较近。蛋白质二级结构预测表明,LM90SB2 lmo2193蛋白为亲水性蛋白,无信号肽,不形成跨膜结构。蛋白结构域预测,lmo2193蛋白为ATP酶。成功克隆LM90SB2基因,为进一步研究LM90SB2的lmo2193基因功能提供一定依据。     

单增李斯特菌新疆分离株lmo0160基因克隆及序列分析

【目的】单增李斯特菌是一种重要的食源性致病菌,常引起人和动物致病。其细胞壁表面LPXTG基序蛋白在单增李斯特菌致病过程中发挥重要作用,根据参考株全序列预测的41个LPXTG基序蛋白中仍有部分蛋白功能未知。对单增李斯特菌新疆绵羊脑分离株LM90SB2的LPXTG基序蛋白Lmo0160的基因进行克隆及生物信息学分析,为功能验证提供基础。【方法】根据GenBank中收录的lmo0160序列设计特异性引物,利用PCR方法对新疆分离株的lmo0160基因进行扩增,将扩增产物克隆到pMD 19-T载体,进行PCR、双酶切鉴定及序列测定,并对基因核苷酸序列和蛋白序列进行分析。【结果】分离株LM90SB2的lmo0160序列全长为1 708 bp,包含1 428 bp的开放阅读框,共编码475个氨基酸;LM90SB2株lmo0160核苷酸序列与CFSAN008100株(4b型,美国)、CFSAN023463株(4b型,美国)、J2-064株(4b型,美国)、F2365株(4b型,奶酪,美国)和NTSN株(4b型,绵羊脑,中国扬州)相似性为99.0%-99.1%;与M7株(4a型,牛奶,中国浙江)相似性为97.2%,与Finland1998株(1/2a型,美国)、N53-1株(1/2a型,熟火腿,瑞士)、N1546株(1/2a型,鱼,丹麦)和EGD-e株(1/2a型,美国)相似性为87.2%-91.1%;其推导的氨基酸序列与上述菌株相似性为91.8%-99.4%。系统进化树显示,LM90SB2菌株的lmo0160基因与CFSAN023463、F2365和NSTN菌株亲缘关系较近,处于同一分支上,而与标准株EGD-e菌株亲缘关系较远。蛋白质二级结构预测表明,LM90SB2的Lmo0160蛋白为亲水性蛋白,无信号肽,不形成跨膜结构。蛋白结构域预测表明Lmo0160蛋白含有胶原蛋白结合域和Cna B结构域。【结论】克隆了LM90SB2的lmo0160基因,为进一步研究LM90SB2的lmo0160基因功能奠定了基础。     

沙门菌PhoP-PhoQ双组分信号转导系统

PhoP-PhoQ是调控沙门菌毒力的重要双组分信号转导系统,由组氨酸蛋白激酶PhoQ和反应调节蛋白PhoP组成。PhoP-PhoQ可调节沙门菌对Mg2+及其他周质环境的适应性,并调控沙门菌感染中毒力基因的转录和表达。PhoP-PhoQ调控的毒力基因参与沙门菌对上皮细胞的侵袭、胞内生存、对抗菌肽的抵抗反应、脂质A的修饰、Ⅲ型分泌系统效应蛋白的分泌等环节。PhoP-PhoQ还可与其他双组分信号转导系统或调节子合作,调控沙门菌的毒力。因此,PhoP-PhoQ双组分信号转导系统在沙门菌的毒力调控中发挥重要作用。     

单增李斯特菌耐药外排泵研究进展

单增李斯特菌是一种重要的人兽共患食源性胞内致病菌,广泛存在于自然环境中且易污染动物性食品,人及动物感染后可引起严重的李斯特菌病,死亡率高达30%。单增李斯特菌通常对多种药物敏感,然而,因不合理使用抗菌药或消毒剂形成的选择压力导致李斯特菌多重耐药情况的报道日渐增多。外排泵蛋白是细菌中一类重要的蛋白,可参与机体多种生物学过程,包括影响细菌对抗生素敏感性、促进有毒化合物泵出、影响细菌毒力等。本文综述了近年来关于单增李斯特菌耐药外排泵的功能及调控机制的研究进展,为深入理解李斯特菌耐药等环境适应机制及有效控制该病原污染传播和筛选抗感染药物新靶点提供理论基础。     

苏云金芽孢杆菌双组份信号转导系统的生物信息学分析

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)能产生杀虫晶体蛋白等多种活性成分,是目前应用最广泛的微生物杀虫剂。本文采用生物信息学方法,系统分析了由本实验室完成全基因组测序的苏云金芽孢杆菌YBT-1520、CT-43和BMB171 3个菌株的双组分信号转导系统(Two-componentsignal transduction system,TCS)的分布、结构及功能,并初步构建了部分TCS的调控网络关系图。本研究旨在为深入研究苏云金芽孢杆菌的生长、代谢以及毒力因子的表达与调控,全面了解伴孢晶体的形成机制开辟新的研究方向。     

单增李斯特菌溶血素O的功能研究进展

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm,简称单增李斯特菌)是一种普遍存在的革兰阳性食源性病原体,可引起人类和一些动物的李斯特菌病。侵袭性李斯特菌病通常很严重,临床上表现为自然流产、败血症和脑膜脑炎,也可表现为发热性胃肠炎综合症。成孔蛋白单增李斯特菌溶血素O(Listeriolysin O,LLO,由hly基因编码)是一种重要的毒力因子,属于胆固醇依赖性细胞溶解素(cholesterol-dependent cytolysins,CDC)毒素,其通过膜穿孔机制介导Lm从吞噬体逃逸并引起李斯特菌病。最近的研究表明LLO除了主要的膜穿孔作用,还存在其他功能,在Lm感染过程中扮演了重要的角色。从LLO的功能和作用机制等方面综述了近些年对该毒素的研究进展,以便更好地理解单增李斯特菌的感染机制,为防治李斯特病的相关研究提供参考。     

单增李斯特菌lmo2192基因克隆与表达

[目的]对单增李斯特菌新疆绵羊脑炎临床分离株LM90SB2的lmo2192基因进行克隆及原核表达。[方法]利用PCR方法扩增lmo2192基因,连接p MD19-T载体进行克隆,筛选阳性菌进行测序比对。构建重组表达质粒p ET32a-2192,将其转入大肠杆菌感受态细胞,经诱导表达,利用SDS-PAGE与Western Blotting鉴定重组蛋白。[结果]扩增lmo2192基因序列长度为969 bp,与预期一致。该基因在大肠杆菌中大量表达,经SDS-PAGE和Western Blotting鉴定分析该产物为56 k Da左右的融合重组蛋白,与预期大小一致。[结论]成功克隆lmo2192基因,并获得大量表达,为进一步研究该基因功能奠定理论基础。     

单增李斯特菌在冷鲜猪肉中的生长预测模型比较

[目的]探讨单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)在冷鲜猪肉中的生长及现有预测软件GP( Growth Predictor)、PMP( Pathogen Modeling Programme)及CP (ComBase Predictor)对LM在冷鲜猪肉中生长的预测准确性.[方法]测定LM在4℃、8℃、12℃及16℃冷鲜猪肉中的生长,并用DMFit软件对生长数据进行拟合,计算各个温度点下的迟滞期(Lag phase duration,LPD)、生长率(Growth rate,GR)、最大生长密度(Maximum population density,MPD),同时用3种预测模型对相同条件下LM在猪肉中的生长进行预测,将实测值与预测值进行比较分析.[结果]冷鲜猪肉在16℃,经过2.6h LM即进入对数生长期.从8℃提高至12℃时,LM在冷鲜猪肉中的生长率从0.017l0g(cfu/g).h-1增至0.038l0g(cfu/g).h-1.在4℃ - 16℃,PMP预测的GR要比实测值低,而LPD则高于实测值.GP在8℃及以上的温度范围内,所预测LPD比实测值偏高.3种预测模型中,GP对GR的预测稍高于实测值,偏差因子(Bf)为1.01,准确因子(Af)为1.38;CP对LPD的预测值与实测值更为接近,Af及Bf分别为4.33及2.83.[结论]在冷鲜猪肉生产和销售过程中,严格控制温度尤为重要.PMP的预测较为保守,不适于冷鲜猪肉中LM生长的预测;建议用GP对GR进行预测,而CP对LPD的预测仅作为参考.     

单核细胞增生李斯特菌对秀丽隐杆线虫致病性的研究

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)是李斯特菌病的病原细菌。用Lm野生株EGDe、弱毒株ΔprfA、毒力回复株+prfA和高毒株+prfA^*喂饲模式生物秀丽隐杆线虫N2,并以线虫的良好食源大肠埃希菌OP50以及非致病的无害李斯特菌（Listeria innocua）作为对照,检测Lm对线虫发育周期、寿命和产卵数的影响。结果显示：当以无害李斯特菌、Lm野生株以及PrfA突变株为食时,线虫的产卵数虽有所下降,但线虫不仅能够正常产卵,而且其发育周期和寿命均较以OP50为食时显著延长（P≤0.05）;线虫体表和消化道中均可检测到大量李斯特菌,但粪便中的活菌数极少。以上结果说明Lm不能杀死秀丽隐杆线虫,对线虫也没有显著致病性,不适合作为研究Lm致病机制的模型;Lm可在线虫体表和消化道存在,暗示Lm可借助线虫在土壤环境中生存和传播。     

单核细胞增生李斯特菌检测技术研究进展

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是常见的食源性致病菌之一。目前,在众多单增李斯特菌的检测方法中应用较广的是免疫学检测法、分子学检测法。免疫学检测时间短,操作简单,但该方法依赖高特异性的抗体,会出现假阳性,还需要进一步鉴定检测结果。分子学检测法克服了免疫学检测法不能在种的水平鉴定单增李斯特菌的缺点,省时省力,灵敏度高,但是分子学检测法需要丰富的操作经验,并且不适于现场大批量检测。新兴的代谢学检测法、光谱学检测法、生物传感器等也都有各自的优缺点。本文综合近年最新文献,就单增李斯特菌检测的最新方法、检测进展及未来发展趋势予以分析综述,以期为该菌的检测提供参考。     

单增李斯特菌氧化还原蛋白系统研究进展

单增李斯特菌是重要的食源性病原微生物,抗氧化应激是李斯特菌生存和致病的关键机制之一。活性氧(reactive oxygen species,ROS)浓度升高会破坏氧化还原平衡,使机体处于氧化胁迫的应激状态,进而导致生物大分子如蛋白质的损伤。蛋白质中半胱氨酸等含硫氨基酸对ROS尤其敏感,半胱氨酸残基脱氢氧化生成二硫键,可以稳定蛋白质空间构象,增加蛋白质的半衰期,进而使蛋白质免受损坏。抗氧化修复通常指的是对半胱氨酸残基的氧化还原过程,即二硫键的形成与打开。硫氧还蛋白家族包含硫氧还蛋白、谷氧还蛋白和Dsb-样蛋白系统,是生物体中常见的氧化还原修复系统。本文根据现有的文献报道,结合本课题组的研究进展,对单增李斯特菌硫氧还蛋白家族进行综述,以期为完善单增李斯特菌硫氧还蛋白调控系统提供参考。     

单增李斯特菌vip基因缺失

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是广泛存在于自然界及食物中的食源性致病菌,作为胞内寄生菌,它可以引起强烈的细胞免疫,是潜在的优良疫苗载体。vip是单增李斯特菌的毒力基因,与其侵袭能力密切相关。因此构建vip基因敲除株可为单增李斯特菌疫苗载体的研发打下重要基础。从单增李斯特菌EGDe基因组中扩增出vip基因上、下游序列,连接到穿梭载体pKSV7中得到敲除载体pKSV7-Δvip,将其以电穿孔的方式转入单增李斯特菌后,通过同源重组利用氯霉素和温度双重压力筛选得到vip基因的敲除突变株,并对敲除菌株的生长曲线进行分析发现vip敲除对细菌的生长没有显著影响,为进一步研究vip基因功能、单增李斯特的致病机制和疫苗载体的研发提供参考。     

prfA基因缺失影响单增李斯特菌诱导细胞凋亡的能力

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,Lm)入侵宿主细胞并带来危害,包含3个关键性环节,即宿主细胞的黏附和侵袭、细胞内增殖和运动、细胞间传播。每个环节的实现均需要不同毒力因子的调控,不同血清型Lm毒力的强弱取决于其毒力因子的活性,prfA基因作为Lm毒力的调控基因起到至关重要的作用。本研究使用单增李斯特菌野生株EGDe及其prfA基因缺失株EGDe-ΔprfA,以人结肠癌腺细胞Caco-2和人肝癌上皮细胞HepG2为研究对象,通过细胞侵袭实验和诱导凋亡能力探究prfA基因缺失对EGDe毒力的影响。溶血实验结果表明prfA基因的缺失并不会明显改变EGDe的溶血能力;侵袭实验表明突变株与EGDe野生株相比对Caco-2细胞和HepG2细胞侵袭能力分别下降了40%和30%;EGDe-ΔprfA处理组与EGDe处理组相比较,Caco-2细胞和HepG2细胞平均凋亡比例分别下降了35.8%和43.7%,说明prfA基因敲除后会降低细胞凋亡。本研究初步证实了prfA基因对EGDe毒力的调控作用,prfA基因缺失降低EGDe侵袭过程中的细胞凋亡,这对于了解EGDe的致病机理及进行相关研究有重要作用。     

单核细胞增多性李斯特菌硫氧还蛋白Lmo1609的应激生物学功能研究

【目的】本研究旨在构建单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)硫氧还蛋白Lmo1609的基因缺失株,分析Lmo1609的氧化还原酶学活性,及其在细菌生长、运动过程中发挥的作用,并探究了Lmo1609参与细菌抗氧化应激和致病的生物学基础。为阐明其抗应激生物学作用以及完善李斯特菌的感染机制奠定分子基础。【方法】利用同源重组原理构建lmo1609基因缺失株及回补株。通过分子生物学、应激生物学和感染生物学等手段,对Lmo1609的生物学功能进行探索。以胰岛素为底物分析其氧化还原酶学活性;通过构建lmo1609缺失株和回补株,比较野生株和突变株在运动性、生长能力、抗氧化应激、细胞黏附、侵袭和增殖能力等方面的差异,进而鉴定Lmo1609的生物学功能。【结果】缺失lmo1609后,单增李斯特菌在生长能力上无明显变化,而运动能力明显减弱;对H2O2的敏感性增强;对细胞的黏附侵袭能力没有差异;对小鼠的致病力没有显著影响。【结论】本研究首次证实了单增李斯特菌硫氧还蛋白Lmo1609具有还原酶学活性,参与调控细菌的运动和对H2O2的氧化应激耐受,不介导单增李斯特菌的致病性。     

单核细胞增生性李斯特菌inlA和inlB基因缺失菌株的构建

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是人畜共患的食源性致病菌,其对恶劣环境有较强的抵抗力,广泛存在于各种食品加工环境,容易引起严重的食品安全问题。LM是一种胞内寄生菌,其毒力因子内化素A(internalin A,InlA)和内化素B(internalin B,InlB)被认为在LM穿透宿主屏障、入侵宿主细胞以及胞间传播等过程中起到重要作用。本文利用同源重组法将LM野生菌株EGDe的inlA和inlB基因的敲除,对inlA和inlB基因缺失菌株的基本生物学特性进行研究,并运用RealTime-PCR监测LM的毒力基因表达。实验结果表明,基因的缺失对突变菌株的生长以及对环境中的氯化钠(NaCl)和乙醇(EtOH)的耐受能力没有影响,但多个毒力基因的表达量明显下降。该缺失菌株的构建为进一步研究InlA和InlB在LM入侵宿主细胞过程中的具体功能提供了重要材料。     

依赖PrfA转录调控的单核细胞增生李斯特菌毒力基因inlC启动子结构特点的初步研究

为了研究单核细胞增生李斯特菌毒力基因启动子的结构特点与转录调控因子PrfA蛋白之间的关系,应用PCR定点突变和重组PCR技术缺失了该菌毒力基因inlC启动子上可能与PrfA蛋白结合以及诱发转录起始相关的碱基序列,构建了一系列突变启动子与lacZ报告基因融合表达质粒, 使lacZ基因的表达置于inlC突变启动子下,并分别电转化单核细胞增生李斯特菌野生株P14、PrfA蛋白高表达突变株P14a 和prfA基因等位缺失突变株A42中,检测相应的β-半乳糖苷酶活性。结果表明：位于inlC启动子转录起始点下游22bp 处的一段17bp的类似PrfA蛋白结合序列TTAACAGCGTTTGTTAA并没有增强和抑制PrfA转录调控活性的功能;甚至将其改造成“完美的” PrfA蛋白结合序列TTAACATTTGTTAA后,也不影响inlC依赖于PrfA的转录活性地表达;但是,如果缺失inlC启动子上原始的PrfA蛋白结合序列,则使inlC依赖于PrfA的转录活性完全丧失;另外,单核细胞增生李斯特菌毒力基因inlC和plcA 依赖于PrfA的转录活性的表达也与启动子上PrfA蛋白结合区(PrfA-box)距离-10区的碱基个数有关:最适为22或23bp,长于23bp或短于22bp的突变启动子的依赖PrfA的转录活性大大降低,甚至没有活性。说明除PrfA蛋白结合序列外,受PrfA调控的毒力基因启动子上还可能存在其它尚未阐明的结构和序列影响PrfA蛋白的结合以及启动转录表达。     

单增李斯特菌末端氧化酶亚基QoxB的生物学功能探究

【目的】本研究旨在构建单增李斯特菌末端细胞色素aa3氧化酶亚基qoxB基因缺失株,并探索其在细菌生长及感染过程中发挥的生物学功能。【方法】利用同源重组方法构建获得缺失株ΔqoxB后,对野生株EGD-e和缺失株ΔqoxB的生长能力、细菌运动能力和细胞内黏附、侵袭、增殖及胞内迁移能力进行比较,同时利用荧光定量PCR方法检测ΔqoxB中鞭毛相关基因转录水平的变化。【结果】缺失qoxB基因后细菌在体外培养过程中生长能力没有差异,细菌的鞭毛运动能力显著降低,在30℃培养24 h和48 h后ΔqoxB运动圈直径分别较EGD-e下降35.86%和34.20%,且22个鞭毛相关基因转录水平显著降低。通过细胞感染试验发现缺失qoxB基因后细胞黏附、侵袭、增殖及胞内迁移能力均显著下降。【结论】本研究首次证实末端氧化酶亚基QoxB能降低单增李斯特菌的运动能力和对细胞的感染能力,此研究为进一步阐明末端细胞色素氧化酶影响单增李斯特菌的致病机制提供重要依据。