北京棒杆菌天冬氨酸激酶突变体R169H的构建及酶学性质表征

【目的】提高北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)中天冬氨酸激酶(aspartokinase,AK)活力。【方法】利用定点突变技术对AK基因进行突变,并将突变体转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中异源表达。重组菌经超声破碎后、利用镍柱对AK进行纯化,并经SDS-PAGE和Western blot验证。通过检测酶活力比较突变体和野生型动力学变化并研究突变体和野生型的部分酶学性质。【结果】成功构建突变体R169H。经验证知,AK分子量为48kDa。突变体R169H的Vmax为226.3 U/mg·s-1,较野生型提高2.3倍。最适反应温度为26℃,与野生型经验值相同;最适反应pH为9.0,较野生型经验值8.0有所提高;在最适温度和pH值下的半衰期为5.5 h,比野生型的4h稳定性要好;代谢产物赖氨酸、苏氨酸和蛋氨酸在低浓度时对AK均具有激活作用。【结论】突变体中R169与E92间氢键消失,能够影响亚基间聚合度,降低酶对底物的亲和力,减弱代谢产物对AK的反馈抑制作用,从而使R169H中AK的Vmax提高2.3倍。     

北京棒杆菌AS1.299高丝氨酸脱氢酶突变体L200F/D215K的异源表达及酶学性质

【目的】对北京棒杆菌Corynebacterium pekinense高丝氨酸脱氢酶(homoserine dehydrogenase,HSD)进行空间结构改造从而获得优良性能新酶。【方法】利用定点突变技术构建HSD双突变体L200F/D215A、L200F/D215E、L200F/D215G和L200F/D215K,并将其转入大肠杆菌E.coli BL21中进行高效表达,选取催化效率最高的双突变体L200F/D215K与双突变前的L200F进行动力学和酶学性质比较。【结果】HSD双突变体L200F/D215K的Vmax为36.92 U/mg,较L200F提高1.24倍;最适反应温度为37℃,较L200F提高2℃;最适反应pH为7.5,与L200F经验值相同;最适温度下的半衰期为4.16 h,较L200F提高1.12倍;L200F/D215K和L200F对有机溶剂和金属离子均表现出较好的抗性。【结论】HSD通过空间结构改造活力得到提高,并且其酶学性质得到优化。本研究有助于认识HSD突变体的酶学性质,为其新酶的研发利用提供有力依据。     

钝齿棒杆菌天冬氨酸激酶基因的克隆和序列分析

运用PCR方法,从野生型钝齿棒杆菌株(Corynebacterium crenatum)AS1542及具有AEC抗性的突变株CD945染色体上分别扩增出天冬氨酸激酶(AK)基因(ask),构建了重组质粒。核苷酸序列分析表明,C.crenatum AS1542AK基因与C.crenatum CD945相比,第1199位的碱基由T变为C,引起酶蛋白β亚基第80位氨基酸从亮氨酸变成脯氨酸。该氨基酸的突变在蛋白结构上位于ACT结构域内,该区受赖氨酸调控。C.crenatum AS1542的AK基因的编码区核苷酸序列与C.glutamicum\,C.flavum及B.lactofermentum相比,同源性分别为97.23%、97.55%和97.62%,酶蛋白氨基酸序列的同源性分别为99.76%、99.52%和99.76%。但在AK基因的启动子上游序列部分与其它棒杆菌相比有较大差异。     

钝齿棒杆菌乙酰谷氨酸激酶编码基因argB的克隆表达、纯化及酶学性质研究

本研究的钝齿棒杆菌(Gorynebacterium crenatum SYPA)是筛选得到的高产精氨酸突变菌株,其中argB基因编码的乙酰谷氨酸激酶(NAGK)是精氨酸合成过程中的关键酶。为了进一步研究该酶的相关特性,以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum SYPA)基因组为模板,扩增得到其arB基因,成功构建了pET-28a-argB重组质粒,并在E.coli BL21(DE3)中诱导后高效表达。利用载体pET-28a上的His6·Tag标记选用Ni柱亲和层析法纯化表达具有活性的NAGK,纯化后酶的比活力达到7.28 U/mg,纯化倍数达66.18。并对该酶的酶学性质进行了初步研究,该酶的最适反应温度为30℃;最适pH值为9.0;酶学动力学参数以N-乙酰谷氨酸为底物的Km为3.35mmol/L;金属离子Cu~(2+)、Mn~(2+)、螯合剂对乙酰谷氨酸激酶均有明显的抑制作用。     

抗反馈抑制的天冬氨酸激酶基因在钝齿棒杆菌中的表达

将来自钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）CD945具有AEC抗性的天冬氨酸激酶(AKfbr)基因克隆到穿梭载体pJC1上,构建重组质粒pLY153。用电击法将质粒pLY153转化到野生型菌株C. crenatum AS1.542及其突变株C. crenatum CD945中。携带AKfbr基因的C. crenatum AS1.542菌株能抗浓度皆为12mg/mL的AEC和苏氨酸。AKfbr基因在C. crenatum CD945中得到表达,天冬氨酸激酶活性提高4倍。摇瓶发酵实验结果表明,重组菌在对数前期和中期生长正常,不受抑制;与对照菌相比,赖氨酸终产量提高22％,赖氨酸生产率提高23％。     

谷氨酸棒杆菌过氧化氢酶的异源表达、纯化以及酶学性质

过氧化氢酶能催化过氧化氢分解为水和氧气,在工业上有着较为广泛的应用。然而,纺织和造纸工业的特殊的高碱性环境,使得开发碱性过氧化氢酶有着重要的应用价值。利用大肠杆菌表达来自于谷氨酸棒杆菌的过氧化氢酶,对其表达条件进行了优化,并通过镍柱亲和层析的方法分离纯化重组蛋白,然后表征纯酶的酶学性质。最适表达条件为:诱导剂IPTG浓度0.2 mmol/L,诱导温度25℃,诱导时间11 h。过氧化氢酶比酶活达到55 266 U/mg,具有较高的催化活性。该酶具有相当宽泛的p H值适应范围,在p H 4.0–11.5范围内均具有较高的酶活性,并在p H 11.0条件下表现出最高的酶活性。将纯酶在p H 11.0的溶液中处理3 h时剩余酶活为93%,说明该酶在高碱条件下有良好的稳定性。该酶最适温度为30℃,在25–50℃热稳定性较好。其动力学参数Km为25.89mmol/L,Vmax为185.18mmol/(min?mg)。抑制剂十二烷基硫酸钠(SDS)、尿素、Na N3、β-巯基乙醇、EDTA对酶活有不同程度的抑制作用。来源于谷氨酸棒杆菌的过氧化氢酶具有较高的催化效率、良好的碱耐受性,在工业生产中有较好...     

固定化谷氨酸棒杆菌T6—13细胞的酶学性质研究

比较研究了固定化谷氨酸棒杆菌细胞和自然细胞的谷氨酸脱氢酶、异拧檬酸脱氢酶,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的一些性质。最适pH、温度对二者酶促反应速度的影响基本相似;pH、热稳定性固定化细胞高于自然细胞;底物表观米氏常数谷氨酸脱氢酶,异柠檬酸脱氢酶有所增大,而葡萄糖-6-磷酸脱氢酶则有所下降;辅酶表观米氏常数均有所增大。这些是影响固定化细胞应用的主要因素。     

枯草芽胞杆菌L-天冬氨酸a脱羧酶的酶学性质

b-丙氨酸是一种重要的医药化工原料,目前主要依靠化学法进行生产。探寻更为环保和高效的生物生产法是未来研究的一个方向。L-天冬氨酸a脱羧酶 (PanD) 能特异地脱去L-天冬氨酸的a羧基,生成b-丙氨酸。本文比较了3种分别来源于大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌及枯草芽胞杆菌的PanD比酶活 (分别为0.98、7.52和8.4 U/mg)。后两者的最适pH均为6.5,最适反应温度分别为65 ℃及60 ℃。与目前研究最多的来源于大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌的PanD相比,来源于枯草芽胞杆菌的PanD具有更好的活性和热稳定性,具有更强的工业应用潜力。同时,本文对该酶特有的翻译后自剪切及机理性失活现象进行了分析和讨论。     

谷氨酸棒杆菌YILW苏氨酸脱水酶基因的克隆表达及酶学性质

将L-异亮氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum YILW)苏氨酸脱水酶(threonine de-hydratase,TD)的编码基因ilvA在大肠杆菌中进行异源表达及进行初步的酶学性质研究。分别以C.glutamicum ATCC13032、YILW的基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增出苏氨酸脱水酶的编码基因ilvA,测序获得编码序列。利用质粒PET-His将该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达、金属螯合纯化,对其酶学性质进行初步研究。结果显示C.glutamicum YILW编码基因序列与已报道的ilvA序列相差5个碱基,相似度为99.6%,第383位氨基酸由苯丙氨酸突变为缬氨酸。酶学性质研究表明:重组酶YilwTD最适反应温度为32℃,在20~55℃范围内该酶较稳定,最适pH为6.7,该酶底物专一性强,对最适底物苏氨酸的米氏常数Km=8.32 mmol/L,最大反应速度Vmax=3.18×104U/mg,与野生型酶相比,突变(F383V)后可显著降低终产物对酶的反馈抑制作用。为揭示突变对苏氨酸脱水酶活性的影响及进一步利用基因工程技术改造L-异亮氨酸生产菌,提高L-异亮氨酸产量奠定了基础。     

巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的定点突变及其动力学性质研究

为了提高青霉素G酰化酶（PGA）在酸性及有机溶剂中的稳定性,以大肠杆菌的晶体结构为模板,用软件PMODELING同源模建巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的三维结构结构并且选择PGA分子表面的合适碱性氨基酸突变为丙氨酸,通过三种不同的快速PCR介导定位突变的方法,将位于PGA的α亚基21位、128位和β亚基492位、512位的赖氨酸残基分别突变为丙氨酸,获得四个突变酶Kα021A、Kα128A、Kβ492A和Kβ512A。其中Kα128A和Kβ512A保持与野生型相近的酶活力,其动力学性质如最适温度、最适pH,Km及Kcat没有明显变化;突变酶Kα021A和Kβ492A则丧失 了酶活力。上述结果表明,PGA分子表面非活性中心的赖氨酸→丙氨酸点突变使突变子的性状发生了分化,突变效应呈现出丰富的多样性。该有理设计不但可以提高酶的稳定性,而且为揭示PGA结构和功能的关系提供了一个新的研究模型。     

伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株构建及其生物学特性及致病性研究

伪结核棒状杆菌是一种可以感染多种动物和人的兼性胞内寄生病原,主要引起被感染动物慢性化脓性炎症反应。[目的]为进一步评价磷脂酶D基因(pld)在伪结核棒状杆菌感染致病中的作用。[方法]本研究采用同源重组技术,在不引入外源基因情况下,构建伪结核棒状杆菌pld无痕缺失株。通过比较pld缺失株和野生株的菌落形态及生长曲线、体外对巨噬细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放及其在胞内的繁殖情况以及体内感染小鼠致死率及促炎细胞因子分泌水平,研究pld与该病原感染致病之间的关系。[结果]无痕缺失pld对伪结核棒状杆菌的菌落形态及生长无明显影响。与野生株ATCC 19410和XH02相比,ATCC 19410Δpld和XH02Δpld失去了与马红球菌ATCC 6939的协同溶血功能,所感染巨噬细胞的LDH释放水平显著下降,胞内细菌数量显著降低;体内试验发现ATCC 19410Δpld对小鼠的致死率、肝脏和脾脏载菌量以及腹水及脏器促炎细胞因子水平均低于ATCC 19410。[结论]成功构建了伪结核棒状杆菌pld无痕缺失株。证实pld在该病原体外感染引发巨噬细胞死亡以及体内感染小鼠致病中具有重要作用。     

Aspergillus fumigatus来源植酸酶的Q23L和Q23LG272E突变研究

Aspergillus fumigatus来源的植酸酶具有热稳定性好、pH作用范围广的优点, 但其比活性很低。设计的植酸酶Q23L突变能在pH4.5～7.0范围内大幅提高比活性,但pH稳定性却显著下降, 为了进一步改良Q23L的pH稳定性, 在Q23L分子上加入了G272E突变。将原酶、突变酶Q23L和突变酶Q23LG272E分别在毕赤酵母GS115中表达,表达酶经纯化后进行酶学性质比较分析,结果表明：突变酶Q23L的比活性比原酶显著提高, 在pH5.5比活性由51u/mg提高到109u/mg, 但其pH稳定性, 尤其是在pH3.0～4.0酸性条件下的稳定性却显著降低,低于80%。突变酶Q23LG272E在pH3.0～4.5和pH6.5～7.0时的稳定性比Q23L有所提高, 恢复到原酶的水平,而比活性基本维持在Q23L的水平。通过一级序列和三维结构比较,分析了可能影响Q23LG272E酶学性质的因素,为进一步研究植酸酶的结构与功能提供了材料。     

Aspergillus fumigatus来源植酸酶的Q23L和Q23LG272E突变研究

Aspergillus fumigatus来源的植酸酶具有热稳定性好、pH作用范围广的优点, 但其比活性很低。设计的植酸酶Q23L突变能在pH4.5～7.0范围内大幅提高比活性,但pH稳定性却显著下降, 为了进一步改良Q23L的pH稳定性, 在Q23L分子上加入了G272E突变。将原酶、突变酶Q23L和突变酶Q23LG272E分别在毕赤酵母GS115中表达,表达酶经纯化后进行酶学性质比较分析,结果表明：突变酶Q23L的比活性比原酶显著提高, 在pH5.5比活性由51u/mg提高到109u/mg, 但其pH稳定性, 尤其是在pH3.0～4.0酸性条件下的稳定性却显著降低,低于80%。突变酶Q23LG272E在pH3.0～4.5和pH6.5～7.0时的稳定性比Q23L有所提高, 恢复到原酶的水平,而比活性基本维持在Q23L的水平。通过一级序列和三维结构比较,分析了可能影响Q23LG272E酶学性质的因素,为进一步研究植酸酶的结构与功能提供了材料。     

谷氨酸棒状杆菌尿素传感器的研究

基于腺酶催化尿素分解产生氨,以氨气敏电极为基础电极,用含脲酶丰富的谷氨酸棒状杆菌研制成测定尿素的微生物传感器.在30℃、pH8.0、0.1mol/L磷酸盐缓冲液中,该传感器的线性范围为1.1×10^-4～1.4×10^-2mol/L,斜率为51.2mV/decade,检测下限为1.0×10^-5mol/L,寿命可达45d.考察了传感器响应初速和底物浓度之间的关系,测定了微生物膜中脲酶的表观米氏常数K_m及最大响应初速v_m.     

Glucose-controlled -isoleucine fed-batch production with recombinant strains of Corynebacterium glutamicum

-Isoleucine was produced in a fed-batch bioprocess with -leucine auxotrophic Corynebacterium glutamicum strains developed by genetic engineering. An efficient supply with nutrients was achieved by applying closed-loop control of glucose as the main carbon source, with a model-based, parameter-adaptive control strategy. This control strategy is based on an extended, semi-continuous Kalman filter for process identification and a minimum variance controller. The lab scale fed-batch process with C. glutamicum SM1 and C. glutamicum DR17 pECM3::ilvA38 was characterized with respect to biomass, product and by-product accumulation. A differential analysis of growth, specific productivities, and selectivities was performed to characterize the carbon flow over process time. Characterization of -isoleucine transport steps across the cell membrane resulted in a balance of -isoleucine transport over process time. Up to an extracellular -isoleucine concentration of 140 mM the cytosolic -isoleucine, provided by the biosynthesis, was quantitatively excreted into the medium via the export carrier system. Optimized feeding profiles for -leucine and phosphate in correlation with the on-line estimated glucose consumption were achieved up to the pilot scale (300-1 stirred tank reactor). The maximum -isoleucine concentration was 150 mM (21 g l⁻¹) with a space-time yield of 4.3 mmol l⁻¹ h⁻¹. With a 98% closed carbon balance the selectivity for isoleucine was 14%, for biomass 13%, and for CO₂ 68%.     

应用组学技术分析伪结核棒状杆菌的致病性

胞内寄生病原伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis,Cp)不仅对全球养殖业造成巨大的经济损失,且可感染人而危害公共卫生安全。组学技术的快速发展促进了Cp致病性的研究。通过基因组测序分析获得72株Cp全基因组序列,初步明确了羊型Cp与马型Cp的结构、进化关系及致病性差异的可能原因;基于蛋白质组学研究,发现了磷脂酶D(PLD)、丝氨酸蛋白酶(CP40)及神经氨酸酶H(NanH)等与Cp生理学、毒性和免疫相关及其他未知功能的蛋白;利用转录组学发现Cp在高渗透压、热休克或酸性条件等恶劣环境中以粘附、应激和氧化还原反应基因表达差异最为典型。本文在介绍Cp基因组测序情况基础上结合作者获得的Cp宣汉株(XH02)基因组序列进行比较基因组学和SNP进化分析,同时对蛋白质组学和转录组学技术在Cp致病机制研究中的应用概况进行综述。     

谷氨酸棒杆菌代谢工程高效生产L-缬氨酸北大核心CSCD

L-缬氨酸作为一种支链氨基酸,广泛应用于医药和饲料等领域。本研究借助多种代谢工程策略相结合的方法,构建了生产L-缬氨酸的微生物细胞工厂,实现了L-缬氨酸的高效生产。首先,通过增强糖酵解途径、减弱副产物代谢途径相结合的方式,强化了L-缬氨酸合成前体丙酮酸的供给;其次,针对L-缬氨酸合成路径关键酶—乙酰羟酸合酶进行定点突变,提高了菌株的抗反馈抑制能力,并利用启动子工程策略,优化了路径关键酶的基因表达水平;最后,利用辅因子工程策略,改变了乙酰羟酸还原异构酶和支链氨基酸转氨酶的辅因子偏好性,由偏好NADPH转变为偏好NADH,从而提高了L-缬氨酸的合成能力。在5L发酵罐中,最优谷氨酸棒杆菌工程菌株Corynebacterium glutamicum K020的L-缬氨酸产量、得率和生产强度分别达到了110g/L、0.51g/g和2.29 g/(L·h)。     

谷氨酸棒杆菌人工合成启动子文库的构建及应用

启动子是实现基因精细表达调控的重要工具,广泛应用于微生物的代谢工程改造.谷氨酸棒杆菌是重要的工业底盘,已报道的启动子文库较少且主要是基于完全人工设计的突变序列构建获得.本研究对谷氨酸棒杆菌odhA基因天然启动子的-10区及附近序列进行随机突变,借助rfp报告基因和荧光成像系统进行高通量筛选,构建了包含57个相对强度为2...     

Threonine accumulation in the seeds of a barley mutant with an altered aspartate kinase

Barley (Hordeum vulgare L.) mutants altered in the regulation of synthesis of aspartate-derived amino acids were sought by screening embryos for growth on a medium containing lysine plus threonine. One mutant, Rothamsted 2501, was selected with good growth. From the segregation of resistance in the following generations, it was concluded that the resistance was conferred by a dominant gene, Lt1. No homozygous Lt1/Lt1 fertile plants have been recovered. Partially purified aspartate kinase preparations from resistant and sensitive plants were separated on DEAE-cellulose chromatography into three peaks of activity (I, II, III) and the feedback regulatory properties of these peaks determined. These peaks are considered to be three isozymic forms of aspartate kinase, one predominantly sensitive to threonine and two sensitive to lysine or lysine plus S-adenosyl methionine. The feedback characteristics of one of the peaks of aspartate kinase activity from resistant plants were changed such that lysine was half-maximally inhibitory at 10 rather than 0.4mm. Increases in the concentrations of the free pools of threonine (4×) and methionine (2×) were measured in young plants grown on a basal medium. Threonine in the soluble fraction of mature seeds from resistant plants was increased from 0.8 to 9.6% of the total threonine content. The total content of both threonine and methionine of the seeds was increased by 6% compared with grain of similar nitrogen content.S.E.R. acknowledges the receipt of a Council of Europe Scholarship through The British Council. Part of this was also supported by EEC Grant 473.     

北京棒杆菌邻氨基苯甲酸合成酶基因的克隆、序列分析及表达

以北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)野生株AS1.299和突变株PD-67的基因组为模板,用PCR方法扩增了邻氨基苯甲酸合成酶(AS)基因(trpEG)片段和前端控制序列。核酸序列分析结果表明,该片段全长3374bp,包含3个ORF,推测分别为前导肽基因trpL、AS componentⅠ基因trpE和AS componentⅡ基因trpG。C.pekinense野生株AS1.299与突变株PD-67相比较,trpL基因完全一样;trpE基因有6个碱基的突变,导致了5个氨基酸残基的改变;trpG基因有1个碱基的突变,导致了1个氨基酸残基的改变;同时它们在-35序列处还有一个A→G的突变。通过同源性比较发现,C.pekinense AS1.299与Corynebacterium glutamicum ATCC13032和Brevibacterium lactofermentum的亲缘关系是很近的。trpL基因上游存在启动子区域,并能被Escherichiacoli的RNA聚合酶所识别,实现异源互补。野生型和突变型AS基因在C.pekinense AS1.299和PD-67中都得到表达,并且重组菌相对于宿主菌的酶活都有了很大提高。摇瓶发酵实验结果表明,带有突变型AS基因的PD-67重组菌生长比较慢,稳定期比PD-67推迟24h,但产生的L-色氨酸比PD-67高22.39%。