百日咳鲍特菌外膜蛋白的致病性与免疫原性

百日咳鲍特菌外膜蛋白是存在干细菌表面的一组功能性蛋白质,包括P69、FhaC和BrkA,其中以P69最为重要。P69分子中的RGD-（GGxxP）5和（PQP）5两个富含脯氨酸结构区分别具有粘附作用和很强的免疫原性,其抗体具有较强的保护作用,可作为无细胞型百日咳疫苗中的一个重要抗原成分。P69具有多态性,百日咳流行菌株的P69已从P69A转变成以P69B或P69C为主,所引起的抗原性漂移与疫苗预防效果下降有直接关系。FhaC是该菌的一种外膜蛋白,能特异地辅助丝状血凝素分泌;BrKA不仅具有蛋白转运功能,且能抵抗抗体依赖补体介导的细胞毒作用。     

百日咳鲍特菌菌毛蛋白纯化方法的建立及免疫原性的初步评价

目的建立一种适合生产放大的百日咳鲍特菌菌毛蛋白(fimbriae, Fim)纯化新工艺,并对其免疫原性进行初步评价。方法百日咳黏附素(pertactin, PRN)流穿液经一步盐析和一步复合型阴离子Capto Adhere疏水层析流穿法进行纯化,以纯度和回收率为检测指标,对硫酸铵盐析质量体积比和疏水离子层析条件进行优化,进行连续3批生产验证工艺稳定性。检验精纯Fim蛋白毒性,将合格Fim蛋白与百日咳其他组分配伍成五组分无细胞百日咳疫苗(acellular component pertussis vaccine, acPV),免疫小鼠,评价免疫原性。结果成功建立了从PRN流穿液中纯化Fim蛋白的方法。该工艺制备的3批Fim蛋白纯度(95%)高,回收率均在60%以上,具有良好的重复性,且Fim蛋白符合特异性毒性试验要求。5μg Fim蛋白免疫小鼠后在7、28、35和42 d血清中的抗Fim抗体几何平均滴度(geometric mean titer, GMT)分别为10.6、97.7、102.9、192.6 IU/mL,与生理盐水组相比具有统计学差异(P0.05)。结论利用QbD理念建立了适合生产放大的百日咳鲍特菌菌毛蛋白纯化新工艺,且蛋白具有良好的免疫原性,未来有望作为组分百日咳疫苗的候选抗原。     

6A型肺炎链球菌荚膜多糖水解物的制备及其结合物在小鼠体内免疫原性研究

目的制备6A型肺炎链球菌荚膜多糖(PS6A)水解物及其结合物,研究结合物在小鼠体内的免疫原性。方法在60℃水解温度下,筛选出PS6A水解适宜的醋酸水解浓度和水解时间。通过水解物和原糖(PS6A)的核磁共振氢谱(1H NMR)和磷谱(31P NMR)比较验证水解物结构的正确性。以1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸盐(1-Cyano-4-(dimethylamino)pyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化水解物的羟基,并与破伤风类毒素己二酸酰肼衍生物(TTAH)结合,制备结合物PS6A-TTAH;并检测结合物的理化性质。通过抑制ELISA分析原糖、水解物和结合物的抗原性。将小鼠分为2组(PS6A组和PS6A-TTAH组),分别免疫3剂次,用间接ELISA分析原糖和结合物在小鼠体内的免疫原性。结果多糖经0.2 mol/L醋酸60℃水解8 h后,其相对分子质量大小(KD)由0.03升高为0.51,重均相对分子质量(Mw)由8.127×10~5g/mol降为1.175×10~5g/mol。核磁共振结果表明,各特征质子的化学位移相比原糖未发生改变。结合物的游离多糖质量分数为4.55%,游离载体蛋白质质量分数为1.08%。抑制ELISA结果显示,水解物、结合物的抑制曲线与原糖基本吻合。PS6A-TTAH组有剂次加强效应(P分别为0.001、0.004和0.001),其第1~3针免后IgG抗体水平均高于PS6A组,差异均具有统计学意义(P分别为0.001、0.002和0.001)。结论制备的PS6A水解物能有效的保留天然多糖的特异基团,以此水解物制备的结合物在小鼠体内具有良好的免疫应答。     

C群脑膜炎球菌结合物小鼠免疫原性的研究

目的比较C群脑膜炎球菌多糖蛋白质结合物(简称结合物)的相对分子质量大小和免疫剂量对其在小鼠体内免疫原性的影响,为结合物的分子大小的质控和结合疫苗成品免疫剂量的选择提供实验依据。方法利用CDAP活化法制备C群脑膜炎球菌结合物,通过硫酸铵盐析进行纯化,然后利用Sepharose CL-4B凝胶过滤层析分析,并根据化学检测结果将结合物分为KD0-0.2(组分1)、KD0.2-0.4(组分2)、KD0.4-0.7(组分3)等3个不同相对分子质量组分,每份分别采用1.0μg、0.2μg的免疫剂量免疫小鼠,并对血清进行ELISA分析。结果采用1.0μg免疫剂量时,3种不同相对分子质量的C群脑膜炎球菌结合物均能产生较高水平的抗体,具有典型的加强效应,第2剂免疫即可产生高水平的抗体,而第2、3剂免疫后的抗体水平差异无统计学意义;采用0.2μg免疫剂量时,三种不同相对分子质量的C群脑膜炎球菌结合物只有在第3剂免疫后才能产生较高水平抗体,第1、2剂免疫后的抗体水平差异无统计学意义,组分1和组分2在第3剂免疫后产生的抗体水平优于组分3;对于相同相对分子质量结合物,用1.0μg免疫小鼠产生的抗体水平优于0.2μg免疫组,而且有显著的统计学意义。结论高剂量时,多糖相对分子质量大小对C群脑膜炎球菌结合物的免疫原性没有显著性影响;低剂量时,小相对分子质量结合物对其免疫原性有影响。同等相对分子质量时,1.0μg比0.2μg的免疫剂量可以激发更高的抗体水平。     

一株减毒百日咳鲍特菌的构建及生物学特性分析

百日咳是传染性强、感染率高的急性呼吸道传染病,主要感染婴幼儿,是婴儿死亡的主要原因之一。百日咳鲍特菌（Bordetella pertussis）是引起百日咳的最主要病原菌。近年来世界各地多次出现百日咳暴发,迫切需研制更加有效的新型百日咳疫苗。本研究构建了一株减毒百日咳活疫苗BPTM1,利用同源重组方法敲除编码百日咳鲍特菌主要毒力因子百日咳毒素（pertussis toxin,PTX）和皮肤坏死毒素（dermonecrotic toxin,DNT）的基因,并用大肠埃希菌的同源基因置换了负责气管细胞毒素（tracheal cytotoxin,TCT）转运的基因ampG。通过聚合酶链反应验证了毒素及相关基因的敲除和置换,蛋白免疫印迹法检测表明PTX的S1亚基未表达。体外生长曲线和体内定植曲线均表明,相比于野生型百日咳鲍特菌BPMM,减毒BPTM1的生长和定植能力未受影响,其所致肺部病理效应减轻,而所诱导的百日咳鲍特菌特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体保持高水平。本研究表明,减毒百日咳鲍特菌BPTM1有可能成为百日咳疫苗的候选疫苗。     

百日咳鲍特菌感染婴幼儿口咽部的菌群变化

目的 通过比较健康婴幼儿与百日咳鲍特菌感染婴幼儿口咽部的菌群相对丰度,探讨百日咳鲍特菌感染对婴幼儿口咽部的菌群影响。方法 采用高通量测序技术,对53例百日咳鲍特菌感染婴幼儿和21例健康婴幼儿口咽标本进行16S rDNA测序,对测序序列进行分析,比较两组间的菌群多样性及在门、属水平上菌群结构差异。结果 健康婴幼儿与百日咳鲍特菌感染患儿在性别和年龄方面差异没有统计学意义。百日咳鲍特菌感染婴幼儿比健康婴幼儿口咽部菌群多样性显著增加。变形菌门（Proteobacteria）作为主要的门在百日咳鲍特菌感染患儿组中相对丰度显著高于健康婴幼儿组;两组排在相对丰度前15位的属,共有3个主要的属在百日咳鲍特菌感染患儿中显著增加,分别为盐单胞菌属（Halomonas）、嗜血杆菌属（Haemophilus）和鲍特菌属（Bordetella）;而罗氏菌属（Rothia）显著减少。结论 百日咳鲍特菌感染婴幼儿口咽部的菌群发生了显著的变化,百日咳鲍特菌感染患儿口咽部的菌群多样性比健康婴幼儿显著增加,在门和属水平百日咳鲍特菌感染患儿与健康婴幼儿主要组成方面均有显著性不同。     

轮状病毒四价灭活疫苗的制备及在小鼠的免疫原性研究

制备轮状病毒四价灭活疫苗,观察其在小鼠体内的抗体应答情况。实验采用轮状病毒原液经凝胶过滤层析纯化,灭活后配制四价疫苗,肌肉注射免疫小鼠,ELISA法测定小鼠血清IgA、IgG。将单价G1、G2、G3、G4型灭活病毒原液及四价轮状病毒灭活疫苗免疫小鼠后,均可刺激产生针对RV的高水平的特异性IgG抗体,但IgA应答较弱。表明四价轮状病毒灭活疫苗在小鼠中具备很好的免疫原性。     

甲型副伤寒菌O-特异性多糖与破伤风类毒素结合菌苗的制备及其在小鼠体内的免疫原性

以脱毒后去除类脂A的甲型副伤寒杆菌高分子量O SP1和低分子量O SP2 为特异性抗原 ,以破伤风类毒素 (TT)为蛋白质载体 ,用己二酸二肼 (ADH)作为连接剂制备的两种结合物及其多糖免疫NIH小鼠 ,结果显示单独注射O SP1或O SP2 免疫小鼠后 ,均不能刺激小鼠产生抗 LPS抗体 ;而用O SP1 TT和O SP2 TT结合物免疫后 ,小鼠血清中均产生了特异性抗 LPSIgG和IgM抗体 ,且O SP1 TT免疫组血清中IgG抗体水平明显高于O SP2 TT免疫组 ,两组结合物免疫血清中抗体类型以IgG为主。O SP1 TT结合物免疫组第二次免疫和第三次免疫后IgG抗体水平均较前一次有显著升高 (p<0 0 1)说明 ,O SP1 TT结合物具有加强应答效果。补体介导的体外杀菌试验证明 ,O SP1 TT与O SP2 TT结合物免疫血清具有特异性杀菌活性。     

C群脑膜炎球菌多糖-rP64K结合物的制备及免疫原性

用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶·四氟化硼(CDAP)活化C群脑膜炎球菌多糖(GCMP),以己二酰肼(ADH)作为连接子,与重组B群脑膜炎球菌外膜蛋白64 KD(rP64K)在碳二亚胺的(EDAC)作用下结合,制备GCMP-P64K结合物。纯化后免疫NIH小鼠,用间接ELISA法检测小鼠血清中抗GCMPIgG抗体水平,并GCMP-TT结合物比较载体诱导的免疫抑制。所制备多糖-蛋白结合物(GCMP-P64K)保持了GCMP抗原特异活性,结合物免疫小鼠后可诱生比多糖单独免疫更高水平的GCMP血清IgG抗体,并能形成免疫记忆,为研究理想载体蛋白提供了新的思路。     

肺炎链球菌18C型糖蛋白结合物的制备及其免疫原性

制备肺炎链球菌18C型荚膜多糖－破伤风类毒素结合物（CPS－TT）,测定结合物的理化性质,抗原特异性及其在动物中的免疫原性。结果显示,结合物能与相应的多糖和破伤风抗血清形成明显的沉淀线,蛋白／多糖比率为1．86,结合物分子大小（Kd值）为0．058。注射小鼠后可诱导明显的抗体应答,而且随着注射针次的增加,抗体反应水平明显增高,显示加强效应。结果表明,制备的肺炎链球菌糖蛋白结合物抗原性良好,具有胸腺依赖性的特性,在小鼠中显示较好的免疫原性。     

6A型肺炎球菌结合物分子大小对小鼠免疫原性的影响

目的 比较不同分子大小的6A型肺炎球菌(serotype 6A Streptococcus Pneumoniae )结合物和佐剂吸附在小鼠体内免疫原性的影响。方法 通过乙酸水解降低6A型荚膜多糖的相对分子质量制备成水解物,水解物经1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化并与破伤风类毒素己二酸酰肼衍生物TT AH 结合,制备成结合物。用Sepharose 4 Fast Flow 纯化结合物,并根据化学检测结果将结合物分为 K D 0.0~0.2、 K D 0.2~0.4、 K D 0.4~0.6等3个组分,每个组分分别以磷酸铝佐剂吸附,将吸附前后的各个组分按照每针次每只小鼠0.2 μg分别免疫小鼠,并采用ELISA检测结合物在小鼠体内的抗体水平。结果 3种不同相对分子质量吸附前后的结合物在小鼠体内均能产生较高水平的抗体,各组2、3针之间具有明显的加强效应。在吸附组和未吸附组中,3种不同分子大小的结合物在小鼠体内产生抗体水平无明显差异。各组分佐剂吸附后的结合物血清抗体滴度高于未吸附组,但这种差异无统计学意义( P > 0.05)。结论 结合物的分子大小对小鼠体内抗体水平的产生没有明显影响;磷酸铝佐剂吸附对于不同分子大小的结合物在小鼠体内的免疫原性有一定的增强效应,但这种增强效应差异无统计学意义。     

C群奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖-TT结合疫苗的制备及其在小鼠体内免疫原性的研究

将C群脑膜炎球菌荚膜多糖以ADH作为间隔剂与TT结合形成GCMP-TT结合疫苗,然后用此结合疫苗免疫NIH小鼠,结果显示使用GCMP免疫小鼠后仅能产生较低水平抗GCMP的IgG抗体,而用GCMP-TT免疫后小鼠血清中产生了较GCMP免疫显著增高抗GCMP的IgG抗体,并且GCMP-TT组第二次和第三次免疫后与初次免疫相比,IgG抗体水平均有显著升高(P<0.01),表明GCMP-TT结合疫苗具有免疫记忆和再次免疫加强应答效应。补体介导的血清抗体体外杀菌试验结果证明,GCMP-TT结合疫苗组免疫小鼠诱导的抗体IgG比GCMP组具有增强的体外杀菌活性。     

对百日咳脂寡糖特异的保护性和非保护性单抗的分析

对百日咳脂寡糖特异的保护性和非保护性单抗的分析百日咳脂寡糖（ＬＯＳ）经电泳出现ＬＯＳＡ和ＬＯＳＢ两条带,人和鼠抗ＬＯＳＡ中多糖分子的单克隆抗体对百日咳菌具有高度的特异性,在体外具有杀菌活性。本文作者将鼠抗ＬＯＳＡ的单克隆抗体ＢＬ－１、ＢＬ－６、ＢＬ－...     

新型呼肠病毒 S基因 DNA 疫苗在小鼠体内的免疫原性

目的：探讨新型呼肠病毒R4株S片段免疫小鼠后引发的免疫应答。方法构建4个不同S基因节段的重组真核表达质粒,并免疫小鼠;ELISA检测血清以研究R4特异性抗体升高水平,并对其抗体亚型进行鉴定;ELISPOT检测小鼠淋巴细胞INF-γ的表达情况。结果与对照组相比,4个重组质粒免疫的小鼠血清都有明显的R4特异性抗体升高,尤其以S1和S3基因免疫后抗体水平较高,且均以IgG2a占绝对优势;S1基因免疫组小鼠的细胞免疫应答最强。结论 S1基因重组质粒免疫小鼠后可同时引发较强的体液免疫和细胞免疫应答,是较为理想的疫苗备选基因片段。     

重组HIV-AEgp145和SIV-envT基因的rAAV8在小鼠体内的免疫原性研究

病毒性载体疫苗是一种有前途的艾滋病疫苗.为了构建以重组腺相关病毒8型(recombinant adeno associated virus type 8,rAAV8)为载体,表达HIV或SIV包膜蛋白的艾滋病疫苗.同时在小鼠体内对其免疫原性进行评价,为下一步研究奠定基础.本研究分别构建了表达HIVAE亚型和SIVmac239株包膜蛋白(不含胞内区)的rAAV8-AEgp145和rAAV8-SIVenvT两种重组病毒,并通过PCR和WesternBlot方法对重组病毒进行了体外鉴定.将两种重组病毒分别接种BALB/c小鼠,应用ELISA和ELISPOT方法检测小鼠的HIV/SIV特异性抗体滴度和细胞免疫应答强度.结果显示,rAAV8能够在293T细胞中高效表达HIV AEgp145和SIVenvT基因.小鼠接种两种重组病毒3-5W后,均能检测到gp120特异性抗体和env特异性细胞免疫应答,并且在16-20W后反应强度仍显著高于对照组.以上结果提示,携带HIVAEgp145和SIVenvT基因的rAAV8载体能够在小鼠体内诱导中等强度并且持续时间较长的特异性体液和细胞免疫应答.     

铜绿假单胞菌6型O-特异性多糖与破伤风类毒素结合物免疫原性研究

目的研制有效防治铜绿假单胞菌感染的疫苗。方法用热酚水法提取铜绿假单胞菌6型(IATS 6)菌株的脂多糖(LPS),去除类脂A并纯化O-特异性多糖(O-SP),用CDAP活化O-SP,己二酸二肼作连接臂,在EDAC作用下,与破伤风类毒素结合制备出O-SP-TT结合物并对该结合物进行小鼠免疫原性试验和免疫保护性试验。结果制备的结合物在小鼠免疫原性试验中,产生了高效价的IgG抗体,与O-SP试验组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);免疫保护性试验表明,结合物免疫小鼠能很好的保护5～10 LD50活菌的腹腔攻击。结论该结合物有望成为防治IATS 6型铜绿假单胞菌感染的有效疫苗。     

重组百日咳毒素Sl亚单位的纯化及免疫原性

将重组百日咳毒素S1亚单位基因的质粒在DH5α和TOPl0两株大肠杆菌中进行表达,并对表达产物进行了初步纯化。粗制的rSl免疫家兔所得血清,用HP—PT及1B7-PT包被的ELISA测定效价,并做被动免疫保护试验。抗PT的抗体滴度为1：32000。该抗rSl血清在小鼠被动免疫保护试验中,对百日咳杆菌18323毒株进行脑腔攻击的被动免疫保护作用达到100％。证明rSl亚单位具有良好的抗原性和免疫原性,并与天然S1具有相同的抗原表位。     

无细胞百日咳攻击菌的制备及液氮保存方法分析

为了制备无细胞百日咳效价测定用攻击菌并用液氮进行保存,对此方法进行评价。采用原代攻击菌复苏传代后测定细菌浓度,并用蛋白胨水稀释为27亿个菌/m l,分装冻存管中。放入液氮罐内,并对液氮保存的攻击菌进行相应的检测,用统计软件计算。结果显示,此方法制备的攻击菌与传统的攻击菌无显著性差异,冻后虽攻击菌的毒力有所下降,但都在100-1000/MLD的正常范围内,且冻后0、3、6、9、12月无显著性差异。同批支间差异小,CV<5%。通过此方法制备的攻击菌稳定性好,试验结果符合《中华人民共和国药典》要求,可用于无细胞百日咳的效价测定。     

壳寡糖和壳聚糖对高脂膳食小鼠的降脂功能比较研究

本文比较研究了壳寡糖和壳聚糖对高脂膳食小鼠降脂作用的影响。选取雄性C57BL/6小鼠,随机分成4组:即Control组(正常日粮)、Model组(高脂日粮)、COS组(高脂+5%壳寡糖组)和CS组(高脂+5%壳聚糖组)。饲喂17周,每周记录摄食量、称量小鼠体重。17周后进行小鼠血清、肝脏生化指标和RT-PCR分析。结果表明:壳寡糖和壳聚糖的添加可降低高脂膳食小鼠体重、血脂和肝脂水平,提高肝脂酶活性,缓解肝脏脂质过氧化水平,调节肝脏脂肪代谢基因,缓解脂质代谢紊乱。壳寡糖的降脂作用效果好于壳聚糖。