棉铃虫核型多角体病毒ORF33基因的原核表达和在宿主细胞中亚细胞定位

对棉铃虫Helicoverpa ar migera核型多角体病毒HearSNPV的ORF33基因(ha33)进行克隆和原核表达,hass在E.coli中表达不完全,表达产物的大小为17kDa,小于预测的分子量28.4kDa。用纯化的原核表达产物免疫家兔,制备了多克隆抗体,应用多克隆抗体检测了HearSNPV感染的宿主细胞(HzAMI)中ORF33基因的表达,表达产物的分子量为31kDa。并通过共聚焦荧光显微镜方法,用多克隆抗体检测编码的蛋白在宿主细胞(HzAM1)中的亚细胞定位,发现ha33编码的蛋白存在于宿主细胞的细胞质中,并持续到感染后期。     

斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF146基因的克隆、表达与启动子活性分析

【目的】研究斜纹夜蛾核型多角体病毒II ORF146基因的结构与功能。【方法】根据SpltMNPV IIORF146基因序列设计引物,经PCR扩增克隆ORF146基因。在生物信息学分析基础上进行启动子活性分析和转录时相分析。构建ORF146片段的原核表达载体,表达并纯化融合蛋白后制备多克隆抗体。【结果】核苷酸序列分析表明,读码框含1383 bp,编码460个氨基酸的蛋白质,推定分子量为50.4 kDa。启动子活性分析和转录时相分析都表明该基因是个早、晚期都表达的基因,在病毒感染8 h和18 h有两个转录峰,24 h以后转录水平略有下降,但趋于稳定。pET-28a-ORF13原核表达的融合蛋白经纯化后制备的多克隆抗体特异性高,效价可达1∶3200以上。【结论】SpltMNPV II ORF146基因是一个早期和晚期都表达的病毒组成型结构蛋白基因。推测ORF146基因可能与SpltMNPV II病毒感染宿主细胞后病毒DNA复制有关。制备的多克隆抗体可用于深入研究该蛋白的生物学特性与功能。     

猪源戊型肝炎病毒基因IV型ORF3编码蛋白的表达及鉴定

通过PCR从已构建的猪源戊型肝炎病毒全基因克隆扩增ORF3全基因,将扩增产物插入到pMD18-T载体中,亚克隆至原核表达载体pET28a（+）,构建pET28a-ORF3表达载体,转入E.coli BL21 (DE3),IPTG诱导表达。Ni-NTA层析柱纯化表达蛋白,用SDS-PAGE、免疫印迹、ELISA等方法分析鉴定表达产物。结果成功扩增到345 bp的目的基因;构建了重组表达载体pET28a-ORF3;转化宿主菌E.coli BL21 (DE3)后表达产物的相对分子质量在6.50~16.5 kDa之间,与预期表达的目的蛋白相对分子质量相符;表达的目的蛋白能与阳性猪源和人源血清发生特异性反应,证实其具有较好的反应原性。     

杆状病毒SpltMNPV ORF124基因截短片段的克隆与表达

目的:克隆并表达斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodotura litura mulfieapsid nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)ORF124基因的部分编码序列.方法:用PER方法扩增目的基因序列片段,并将其克隆至原核表达载体pQE-30上,转化到Escherichia.coli M15[pREP-4]中进行诱导表达.结果:构建了pQE-tr124原核表达质粒,含有该质粒的大肠杆菌经IPTG诱导表达了一个与预期理论值相符的约为33kDa的蛋白.以Ni2+-NTA偶连抗体检测证明所表达的蛋白为带有组氨酸的融合蛋白.结论:成功表达了SpltMNPV ORF124的部分编码序列,该融合蛋白的成功表达为进一步深入研究基因的功能奠定了基础.     

E.coli M15碱性磷酸酶的表达、纯化及活性分析

目的:克隆、表达并纯化大肠杆菌M15碱性磷酸酶(EAP)成熟肽(phoA),分析其活性.方法:采用PCR技术从M15基因组DNA中扩增出phoA编码基因;构建其原核表达载体pCold-TF-EAP;转入E.coli BL21(DE3)进行表达;IMAC Ni-NTA柱层析法纯化重组蛋白;重组蛋白与底物对硝基苯磷酸二钠显色反应分析其活性.结果:克隆得到了序列约1 400bp phoA编码基因,原核表达了分子量约为100 kDa的融合重组EAP(rEAP),纯化获得的rEAP具有催化磷酸单酯的活性,有效反应温度范围大,在27℃～67℃都具有较高的催化活性,在pH7.5 ～8.0间催化活性最高.结论:克隆了可正确表达EAP的phoA编码基因,为EAP的工业化生产及应用提供了生物材料.     

肌肉特异性激酶基因的克隆、表达和纯化

目的:克隆小鼠肌肉特异性激酶(muscle-specific kinase,MuSK)基因,原核表达、纯化MuSK蛋白。方法:获取编号AY360453的小鼠肌肉特异性激酶的基因编码序列进行优化和合成,将得到的目的基因构建于大肠杆菌表达载体pQE30中,获得重组表达载体pQE30-MuSK,转化至大肠杆菌菌株M15中表达,SDS-PAGE凝胶电泳检测是否有目的蛋白条带,MuSK酶联免疫分析试剂盒检测目的蛋白的免疫活性及其含量。结果:获得MuSK基因1.4kb片段,成功构建pQE30-MuSK原核表达载体,MuSK蛋白在大肠杆菌中成功表达,相对分子质量约为48kDa,Elisa试剂盒测得样品中MuSK的含量约为8.2pmol/L。结论:利用分子克隆技术建立了MuSK基因的原核表达系统,为更深入的研究其在重症肌无力中的作用打下基础。     

小鼠OAZ2基因的原核表达及抗体制备

目的:克隆小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶2(OAZ2)功能基因,原核表达、纯化OAZ2蛋白并制备抗OAZ2多克隆抗体.方法:IRT-PCR法从鼠黑色素瘤细胞总RNA中克隆OAZ2 cDNA后,通过重叠延伸PCR技术构建无需移码即可全长翻译的功能基因.将OAZ2功能基因克隆人原核表达载体pET15b并原核表达.表达的蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后,用SDS-PAGE和Western Blot分析鉴定.用纯化的OAZ2蛋白作为抗原免疫Bab/C小鼠以制备多克隆抗体,制备抗体用ELISA和Western Blot检测抗体滴度和特异性.结果:成功获得小鼠OAZ2 cDNA并构建出无需移码翻译的OAZ2功能基因.OAZ2功能基因在大肠杆菌BL21(DE3)中可诱导性高表达并能用Ni-NTA树脂高效纯化.用纯化蛋白免疫Bab/C小鼠制备的抗血清经ELISA检测有较高的多克隆抗体效价(＞1∶64000),经Western blot鉴定可与纯化的OAZ2蛋白质特异性结合.结论:建立了鼠OAZ2蛋白原核表达和纯化技术,制备出高效价和特异性抗OAZ2多克隆抗体,为进一步研究OAZ2基因的功能奠定了基础.     

vMIP-II-TfN融合蛋白在毕赤酵母中的表达和纯化

目的:构建pPIC-vMIP-II-TfN酵母表达载体,表达纯化vMIP-II-TfN融合蛋白。方法:利用PCR方法扩增编码人转铁蛋白N端半分子的基因片段,通过酶切、连接、转化等分子克隆方法构建pPIC-vMIP-II-TfN酵母表达载体;电击法转化X33酵母菌;用甲醇诱导重组酵母菌表达融合蛋白,利用硫酸铵沉淀、透析、Ni-NTA层析等技术进行蛋白纯化,SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达和纯化情况,利用趋化实验进行纯化蛋白活性检测。结果:经过两次PCR扩增了一个长约1.1kb的包含Xba I酶切位点的IgG3-TfN基因片段,插入pPIC-vMIP-II的Xba I酶切位点,经菌液PCR鉴定获得重组子,测序结果表明构建载体pPIC-vMIP-II-TfN的表达框正确无误,转化X33酵母菌,用甲醇诱导表达出48kDa的vMIP-II-TfN融合蛋白,经硫酸铵沉淀、透析、Ni-NTA纯化后得到纯度约为95%的vMIP-II-TfN融合蛋白。Western印迹结果表明融合蛋白能与转铁蛋白抗体特异性结合。活性检测表明经过诱导表达的vMIP-II-TfN融合蛋白具有趋化抑制活性。结论:成功构建pPIC-vMIP-II-TfN酵母表达载体,重组酵母工程菌经甲醇诱导成功表达出vMIP-II-TfN融合蛋白,纯化后的vMIP-II-TfN融合蛋白具有趋化抑制活性。     

斜纹夜蛾核多角体病毒Spit119基因在大肠杆菌中的表达及抗体制备

用PCR的方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)ORF119全长基因(Splt119),将其克隆至5'端有6 × His编码序列的原核表达栽体pQE30上,转化大肠杆菌M15[pREP4],在1 mmol/LIPTG诱导下超量表达了一个分子量约28 kD的融合蛋白.经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化,免疫新西兰大白兔制备了特异的抗Splt119抗体.Western blotting免疫印迹分析表明,该抗体适合用作Splt119蛋白功能的进一步研究.     

抗人整合素αvβ3-组织因子融合蛋白基因的构建和表达

目的:利用基因工程技术构建和表达抗人整合素αvβ3单链抗体(scFv)与人可溶性组织因子(sTF)的融合蛋白scFv-sTF。方法:用重叠延伸PCR技术扩增scFv基因,同时用组装PCR方法人工合成sTF基因,然后以酶切连接方式融合2个基因,并克隆至原核表达载体pQE80L中,构建表达质粒pQE80L-scFv-sTF,以重组子转化大肠杆菌M15诱导目的基因表达。结果:SDS-PAGE分析显示工程菌可以表达相对分子质量约55×103的融合蛋白scFv-sTF,Western印迹分析证实表达的目的蛋白具有6×His标签;经低剂量IPTG诱导和较低温度培养,scFv-sTF获得了可溶性表达;纯化回收目的蛋白,ELISA试验证实,该重组抗体分子具有良好的抗原结合活性。结论:构建并表达了抗人整合素αvβ3的单链抗体融合蛋白scFv-sTF,并验证了其抗原结合活性,初步证明它可以与抗原特异性结合,为进一步研究其抗肿瘤作用打下了基础。     

SARS冠状病毒基因结构中未知蛋白Orf7的研究

为探讨SARS-CoV未知蛋白在基因表达调控中的作用,本研究以鉴定的SARS-CoV BJ01毒株cDNA为材料,采用PCR方法扩增SARS-CoV未知蛋白基因Orf7,Orf8,Orf9,引入GFP和pDsRed作为报告基因,构建出5种表达质粒pEGFP-Orf7,pEGFP-Orf8,pEGFP-Orf79,pcDNA3-Orf7,pcDNA3-Orf8.进行体外转染实验后,采用荧光酶标仪测量其细胞中荧光蛋白的表达量,再采用流式细胞仪进一步进行瞬时表达的分析比较.结果发现,pcDNA3-Orf7与pEGFP共转染时,pcDNA3-Orf7能够增强绿色荧光蛋白(GFP)的表达,pEGFP-Orf7与pDsRed共转染时pEGFP-Orf7可以增强红色荧光蛋白(RFP)的表达,且同时表达红色和绿色荧光的细胞数增加.本文首次证明了ORF7编码的63个氨基酸的蛋白具有反式激活作用,即为SARS-CoV自身的反式激活因子.     

猪圆环病毒2型ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR从疑患断奶仔猪多系统消耗综合症(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出ORF2全基因(702bp).将此片段克隆入pGEM-T easy载体,筛选获得重组质粒pTORF2,并对此质粒中的插入序列进行了测序分析,结果表明本试验克隆的ORF2与美国PCV-2分离株AF264039的核苷酸及氨基酸序列同源性均达到100%,与其他PCV-2毒株同源性分别为92.3%～98 6%和92.3%～96.6%.重组质粒pTORF2经BamH I、EcoR V双酶切,回收ORF2基因,转移入真核表达载体pSec-Tag2/HygroB的相应酶切位点之间,构建成重组质粒pSecTagORF2.此重组表达载体的构建成功为进一步研究ORF2编码蛋白的生物学活性及建立PCV诊断试剂盒打下基础.     

SARS冠状病毒基因结构中未知蛋白Orf7的研究

为探讨SARS-CoV未知蛋白在基因表达调控中的作用,本研究以鉴定的SARS-CoVBJ01毒株cDNA为材料,采用PCR方法扩增SARS-CoV未知蛋白基因Orf7,Orf8,Orf9,引入GFP和pDsRed作为报告基因,构建出5种表达质粒:pEGFP-Orf7,pEGFP-Orf8,pEGFP-Orf79,pcDNA3-Orf7,pcDNA3-Orf8。进行体外转染实验后,采用荧光酶标仪测量其细胞中荧光蛋白的表达量,再采用流式细胞仪进一步进行瞬时表达的分析比较。结果发现,pcDNA3-Orf7与pEGFP共转染时,pcDNA3-Orf7能够增强绿色荧光蛋白(GFP)的表达,pEGFP-Orf7与pDsRed共转染时pEGFP-Orf7可以增强红色荧光蛋白(RFP)的表达,且同时表达红色和绿色荧光的细胞数增加。本文首次证明了ORF7编码的63个氨基酸的蛋白具有反式激活作用,即为SARS-CoV自身的反式激活因子。     

Varicella-zoster virus ORF7 interacts with ORF53 and plays a role in its trans-Golgi network localization

Varicella-zoster virus (VZV) is a neurotropic alphaherpesvirus that causes chickenpox and shingles. ORF7 is an important virulence determinant of VZV in both human skin and nerve tissues, however, its specific function and involved molecular mechanism in VZV pathogenesis remain largely elusive. Previous yeast two-hybrid studies on intraviral protein-protein interaction network in herpesviruses have revealed that VZV ORF7 may interact with ORF53, which is a virtually unstudied but essential viral protein. The aim of this study is to identify and characterize VZV ORF53, and to investigate its relationship with ORF7. For this purpose, we prepared monoclonal antibodies against ORF53 and, for the first time, characterized it as a ~40 kDa viral protein predominantly localizing to the trans-Golgi network of the infected host cell. Next, we further confirmed the interaction between ORF7 and ORF53 by co-immunoprecipitation and co-localization studies in both plasmid-transfected and VZV-infected cells. Moreover, interestingly, we found that ORF53 lost its trans-Golgi network localization and became dispersed in the cytoplasm of host cells infected with an ORF7-deleted recombinant VZV, and thus ORF7 seems to play a role in normal subcellular localization of ORF53. Collectively, these results suggested that ORF7 and ORF53 may function as a complex during infection, which may be implicated in VZV pathogenesis.

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缺失ORF73或ORF214基因对重组鸡痘病毒免疫应答的影响

【目的】旨在研究鸡痘病毒ORF73和ORF214编码蛋白是否具有IL-18结合蛋白的功能,以及ORF73或ORF214基因缺失后对重组病毒诱导免疫应答的影响。【方法】以缺失ORF73或ORF214基因并表达H5亚型AIVHA基因的重组鸡痘病毒(rFPVLP-△73LRH5A、rFPVLP-△214LRH5A)作为研究对象,以未缺失ORF73或ORF214基因而表达H5亚型AIVHA基因的重组鸡痘病毒(rFPVLP-12LSH5A)作为对照,检测重组病毒体外诱导SPF鸡脾细胞和外周血淋巴细胞产生IFN情况,同时检测重组病毒免疫SPF鸡后诱导的体液免疫、CD4+/CD8+比值、外周血淋巴细胞的增殖能力和H5亚型AIV强毒攻击后的免疫保护效力。【结果】rFPVLP-△73LRH5A和rFPVLP-△214LRH5A体外诱导脾细胞产生的IFN量显著高于rFPVLP-12LSH5A,而免疫10d后的CD4+/CD8+比值显著低于rFPVLP-12LSH5A;3种重组鸡痘病毒诱导外周血淋巴细胞增殖的能力没有明显差异;3种重组病毒在SPF鸡均产生针对H5亚型AIV的HI抗体,免疫14d后rFPVLP-△214LRH5A组诱生的HI抗体水平显著低于rFPVLP-12LSH5A组的抗体,但3组在免疫21d后HPAIV的致死性攻击时,均100%被保护。【结论】鸡痘病毒ORF73和ORF214编码蛋白具有IL-18结合蛋白抑制IFN产生的功能,虽然缺失株和亲本株重组鸡痘病毒在细胞和体液免疫应答存在一定差异,但在SPF鸡均能诱导产生良好的免疫保护。     

猪圆环病毒2型ORF2编码基因真核表达载体的构建及表达

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计了1对引物,应用PCR从含有PCV-2的PK-15细胞中扩增出ORF2基因,将其克隆入pSecTag2载体中,构建了pSecORF2载体.又设计一条含信号肽序列的上游引物,以pSecORF2为模板,扩增出含信号肽序列的ORF2基因,将其克隆到plREShyg载体上,构建了plRESiORF2真核表达载体.然后通过磷酸钙共沉淀法转染CHO细胞,进行表达.间接免疫荧光实验(IFA)成功检测到plRESiORF2在CHO细胞中的表达.这为进一步研究ORF2编码蛋白的生物学活性及建立PCV诊断试剂盒打下基础.     

猪2型圆环病毒ORF1与ORF2基因和伪狂犬病毒基因的重组与表达的研究

根据GenBank发布的猪2型圆环病毒(PCV2 )序列(AY0 35 82 0 ) ,设计两对特异性引物,采用PCR方法,分别扩增了猪2型圆环病毒ORF1和ORF2基因。将ORF1和ORF2基因的PCR产物回收并酶切后,依次插入到伪狂犬病毒gE gI双缺失通用转移载体pIECMV中,构建了猪2型圆环病毒_伪狂犬病毒重组中间转移质粒pIEORF1-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移质粒pIEORF1_ORF2与伪狂犬病毒TK^- gE^- LacZ⁺ 基因组共转染IBRS_2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行空斑纯化,利用检测PCV2ORF1基因和ORF2基因的PCR方法筛选重组病毒TK^- gE^- gI^- ORF1-ORF2⁺ ,用Southernblotting鉴定重组病毒,并用Westernblotting检测ORF1_ORF2融合蛋白的表达情况,在此基础上也测定了重组病毒在不同细胞上的增殖滴度。结果表明,外源基因ORF1和ORF2已成功插入到TK^- gE^- LacZ⁺ 亲本株的基因组中,并获得了表达,表达的蛋白可与PCV2阳性血清发生反应。同时发现ORF1和ORF2基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力与亲本株相当。     

戊型肝炎病毒ORF3及其蛋白的研究进展

戊型肝炎病毒(HEV)是发展中国家急性肝炎流行的重要病原体之一,由于缺少有效的细胞培养系统和廉价的小型动物模型,对病毒的生物学特性及发病机理了解较少。近几年在HEV ORF3及其蛋白的分子生物学特性和功能研究方面取得了一些进展,为深入了解HEV的感染和致病机理提供了新的理论依据,对这些研究成果进行了综述。     

戊型肝炎病毒ORF1多聚蛋白的不同功能域在细胞内的定位

为了探讨戊型肝炎病毒多聚蛋白ORF1的多个功能域在宿主细胞中的表达和定位情况,我们首先将psk-HEV重组载体上的ORF1各功能域的编码序列克隆到绿色荧光蛋白载体pcDNA3.1-GFP上,构建成融合表达的重组质粒,并测序和酶切鉴定其构建成功。再通过Western-Blot验证各融合蛋白在细胞中正确表达,并用激光扫描共聚焦显微镜观察融合蛋白在细胞内的分布和定位。在Huh7细胞中,RdRp蛋白主要分布于细胞核内,HEL蛋白以囊泡状分布于细胞核周,MET蛋白以颗粒状存在于细胞核和细胞质中,PLP蛋白呈极性分布于细胞核周,X蛋白在细胞核和细胞质中均存在。各融合蛋白在细胞中的不同定位印证了对这些蛋白质的功能预测和体外研究结果,这为进一步研究HEV不同蛋白功能提供了支持。