《活性多肽和胰岛素结构与功能研究》讨论会论文摘要选

为了解胰岛素空间结构的性质,用差值傅里叶法对猪和牛两种[Trp]B_1胰岛素进行了初步的X射线分析。用简易康维皿微量气相扩散装置生长出了这两种胰岛素衍生物的大单晶体,大小约为0.7毫米,测得空间群为R_3,晶胞参数为:     

化学修饰提高胰岛素口服降血糖作用的研究

本文探索了用小分子化合物对胰岛素进行化学修饰,以增加口服降血糖的可能性.制备了乙酰胰岛素、琥珀酰胰岛素和半乳糖酰胰岛素.这些胰岛素不仅较好地保持了天然胰岛素的活性,而且其口服降血糖作用也较天然胰岛素明显增加,其中琥珀酰胰岛素是天然胰岛素的口服降血糖作用的二倍以上.这为口服或肛门给药的胰岛素新剂型的研制提供了科学依据.     

胰岛素作用原理研究近况

我国科学工作者在1965年首次用化学方法全合成了具有全部生物活力的结晶牛胰岛素,开辟了人工合成蛋白质的新时期,也促进了我国对胰岛素的深入研究。1973年,我国科学工作者又测定了1.8埃分辨率猪胰岛素分子的三维结构,为胰岛素结构与功能     

溴化氰活化右旋糖酐对胰岛素共价修饰的研究

本文用溴化氰活化右旋糖酐对胰岛素进行共价修饰,对修饰胰岛素若干性质作了研究.修饰胰岛素无论对正常小鼠、还是对糖尿病模型小鼠的降血糖活性均较天然胰岛素明显提高;修饰胰岛素对糖尿病模型小鼠,在用药后0.5至6.5小时期间,平均降血糖幅度为70.3%,而天然胰岛素是59.1%,且作用时间延长.本文还探讨了修饰胰岛素的口服降血糖效果.     

91年12月销售重组胰岛素

新北欧药物公司在12月销售5种重组人胰岛素制剂。这是用美国Zymogenetics公司开发的酵母为宿主,利用基因操作技术制造的。该公司现也已申请引进配合型和注射制剂等,1992年将胰岛素制剂更换成重组人胰岛素,分割该公司和日本市场的盐野义制药公司、美国Eli Lilly公司从1986年销售重组人胰岛素。日本决定1992年用基因操作技术制造胰岛素。丹麦Novo Nordisk公司开发用蛋白分解酶将猪胰岛素(有一个氨基酸序列与人的不同)变换成人型的制造     

静电和疏水效应对胰岛素二聚体稳定性的影响

从猪胰岛素二聚体的结构出发,着重研究了胰岛素二聚体单体之间的静电和疏水相互作用,用连续介质模型的有限差分方法计算得到胰岛素二聚体的静电势,用溶剂可接近表面（ASA）模型分析了分子表面积及疏水性,还考察了不同pH值对胰岛素二聚体静电和疏水相互作用的影响。结果分析表明,当pH值处于弱酸弱碱范围内时（4．6－8．5）,静电相 互作用能和疏水自由能都呈现出较小的值,当pH为6．2时,疏水性出现一个明显的峰值,这与胰岛素二聚体结晶的实验条件相吻合。     

胰岛素B_(29)-赖氨酸侧链修饰对其与胰岛素抗体结合的影响

本文报道了若干胰岛素B_(29)-赖氨酸侧链氨基修饰的胰岛素衍生物与胰岛素抗体的结合能力。结果表明B_(29)的侧链氨基用各种不同类型的基团取代后其与胰岛素抗血清的结合能力没有明显变化或有所下降。当两个胰岛素分子的B_(29)-赖氨酸的侧链氨基通过己二酰交联形成二聚体后,其与胰岛素抗体结合力约为胰岛素的38.5±4.9%。     

胰岛素受体抗体的产生及其初步鉴定

六年前Kahn等报道了在严重抗胰岛素型的特殊的糖尿病患者(称B型)的血清中,存在有胰岛素受体的抗体。这种抗体可以抑制胰岛素与其受体的结合,并且有类似胰岛素的生物活性,如促进葡萄糖的氧化、抑制脂肪的分解等。这一发现,对于糖尿病的临床和胰岛素受体的研究都是很重要的。从那以后,人们尝试通过免疫动物的方法获得胰岛素受体的抗体。但迄今,无论是用含胰岛素受体的细胞膜或用纯化的胰岛素受体免疫动物,所获得的胰岛素受体的抗体,都只能模仿胰岛素的生物活性,而不能象从糖尿病患者(B型)中获得的胰岛素受体的抗体那样抑制胰岛素与其受体的结合。人胎盘细胞膜含有比胰岛素典型靶细胞更丰富的胰岛素受体。本文用人胎盘细胞膜免疫家兔获得了人胎盘细胞膜蛋白的抗体,并对其中的胰岛素受体的抗体进行了初步鉴定。     

胰岛素蛋白质工程：高活性（B10Asp）人胰岛素

用基因定位突变方法将胰岛素Ｂ链第１０位的Ｈｉｓ变为Ａｓｐ,获得高活力胰岛素（Ｂ１０Ａｓｐ）人胰岛素,其受体结合能力和离体生物少分别为猪胰岛素的２６２％和２３５％体内生物活力也明显高于猪胰岛素,它的促细胞生长能力为猪胰岛素的１７４％。     

胰岛素结构与功能关系的研究——Ⅳ.B_(22)-精氨酸的改变对胰岛素生物活性的影响

本文叙述了一系列B_(22)-精氨酸改变的B_(23)-D-Ala去B链羧端六肽胰岛素类似物的半合成。半合成途径是胰岛素六甲酯(INS-OMe)经胰蛋白酶和羧肽酶B作用得到去B链羧端九肽胰岛素五甲酯OMe-(DNIOH),A_1和B_1的α-氨基用Boc-基保护后与X-D-Ala·PheOMe(X=Gly,D-Arg,Val,Arg,Boc-Lys和OTB-Asp)缩合,三氟乙酸和皂化去除所有的保护基。这些类似物的生物活力表明;B_(22)-Arg并非不能改变,它用Lys甚至Asp代替后,不影响活力,活力水平约为天然胰岛素的20%。当B_(22)-Arg用Val代替后活力降低一半,而用Gly或D-Arg代替后,活力很低。文中对B_(22)-Arg在维持胰岛素构象和对胰岛素生物活力的影响以及豚鼠胰岛素活力低的原因等问题进行了讨论。     

去七肽胰岛素的分子动力学研究

本文用分子动力学的方法对去七肽胰岛素(DHPI)分子的构象进行了研究,首先用分子动力学方法对晶体胰岛素分子的构象能进行了优化,然后除去B链C端的最后七个残基(B24—B30),做分子动力学模拟,得到了DHPI的平衡构象和均方差波动。胰岛素分子的X射线晶体衍射结构和能量优化构象之间的均方根偏差为0.1;所得DHPI构象和胰岛素能量优化构象间C原子间的均方根偏差为1.8。变化最大的区域是A8—A10,A18—A21,B1—B41和B18—B23。     

胰岛素及其苄基衍生物在钠-氨系统中的还原及活力恢复

(1)应用三种不同的方法制得了胰岛素苄基衍生物。胰岛素如果用钠-氨还原再与氯化苄作用,可以得到不再有完整二硫键存在的充分苄基化的产物。(2)将胰岛素、S-磺酸型A及B链混合物或者胰岛素苄基衍生物,在钠-氨内还原,然后在稀碱溶液中重氧化,都可以使胰岛素活力再生。用胰岛素或S-B磺酸型A及B链混合物时,经过此处理则活力可以恢复5—10%。用胰岛素苄基衍生物时则一般活力恢复1—2%。(3)从充分苄基化了的胰岛素衍生物能恢复活力这一事实说明可以通过人工合成的A和B链最后合成胰岛素。(4)观察了A和B键混合物巯基氧化和活力再生的过程,并进行了讨论。     

[Trp]~(B_1)胰岛素结构研究——Ⅰ.晶体生长与初步晶体学观察

用微量气相扩散法生长出猪和牛[Trp]~(B_1)胰岛素单晶体,用X射线晶体学方法测定了空间群和晶胞参数,其空间群为R3,晶胞参数与天然猪胰岛素晶体很接近。在徘循衍射图上可以观察到衍射强度的变化。     

[Trp]~(B_1)胰岛素结构研究——Ⅰ.晶体生长与初步晶体学观察

用微量气相扩散法生长出猪和牛[Trp]~(B_1)胰岛素单晶体,用X 射线晶体学方法测定了空间群和晶胞参数,其空间群为R3,晶胞参数与天然猪胰岛素晶体很接近。在徘循衍射图上可以观察到衍射强度的变化。     

胰岛素蛋白质工程;[B9Glu,B10Asp]人胰岛素

用缺口双链ＤＮＡ的定向突变方法分别将胰岛素Ｂ链第９和第１０位的Ｓｅｒ和Ｈｉｓ改变为Ｇｌｕ和Ａｓｐ,获得「Ｂ９Ｇｌｕ,Ｂ１０Ａｓｐ」人胰岛素。其受体结合能力为猪胰岛素的３４．４％,而体内活力与猪胰岛素基本相同     

胰岛素蛋白质工程：高活性［B10Asp］人胰岛素

用基因定位突变方法将胰岛素Ｂ链第１０位的Ｈｉｓ变为Ａｓｐ,获得高活力胰岛素──［Ｂ１０Ａｓｐ］人胰岛素。其受体结合能力和离体生物活力分别为猪胰岛素的２６２％和２３５％;体内生物活力也明显高于猪胰岛素;它的促细胞生长能力为猪胰岛素的１７４％。     

胰岛素分子结构与功能关系的复杂性

<正> 1955年Sanger阐明了胰岛素分子的全部氨基酸顺序。七十年代初,英国牛津小组和中国小组解出了高分辨率的胰岛素分子的空间结构。对胰岛素分子结构的这二次认识的飞跃极大地推动了胰岛素分子结构与功能的研究。近二十多年来,用各种化学修饰和合成方法制备了几百种在分子的不同部位作不同修饰的胰岛素衍生物,组成胰岛素分子的51个氨     

去B链羧端五肽胰岛素的结构研究——Ⅰ.制备及性质

本文报道了一种改进的去B链羧端五肽胰岛素(DPI)的制备方法。按此法可获适宜单晶培养用的DPI制剂。其结晶制剂的受体结合活力为胰岛素的88%。其小白鼠惊厥活力为20I.U./毫克。在Zn~( )存在下和胰岛素有免疫交叉反应。     

启动子CMV和EF1α对人胰岛素基因在BHK细胞中表达的影响

目的　构建人胰岛素基因真核高效表达载体 ,为胰岛素转基因研究奠定基础。方法　用限制性内切酶SpeⅠ和HindⅢ消化pEF1α GFP ,回收 1 2kbEF1α启动子 ,插入到pCMV mINS的NruⅠ和HindⅢ位点中 ,获得重组质粒pEF1α mINS ;将pCMV mINS和pEF1α mINS分别转染BHK细胞 ,用G418筛选 ,阳性克隆传至 2 0代后 ,分别用放免方法和免疫组化法分析胰岛素和 或胰岛素原在BHK细胞中的表达情况。结果　经放免测定 ,pCMV mINS和pEF1α mINS在BHK细胞中胰岛素和 或胰岛素原的表达量分别为 4 0 77μIU ml和 6 897μIU ml。经免疫组化分析 ,pCMV mINS在BHK细胞质中胰岛素表达水平的灰度值为 190 0± 19 5 6 ;pEF1α mINS在BHK细胞质中胰岛素表达水平的灰度值为 181 4± 18 45 ,在BHK细胞核中表达水平的灰度值为 15 5 4± 11 6 6。结论　在BHK细胞中启动子EF1α启动胰岛素基因表达的活性比启动子CMV高。     

文昌鱼胰岛素样肽的表达、纯化、鉴定及其多克隆抗体制备

为了深入研究胰岛素和胰岛素样生长因子1（IGF－1）的起源和进化以及结构与功能的关系。表达了胰岛素和IGF－1的祖先分子－－文昌鱼胰岛素样肽（ILP）。重组单链ILP的基因用化学方法合成（从cDNA推测的ILPB结构域的C端和A结构域的N端用Ala-Ala-Lys三肽连接起来,并钭B28Arg突变为Lys）,克隆到表达载体pVT102-U中,ILP在酿酒酵母中得到有效表达。发酵液经4步分离纯化,得到均一的单链ILP,经质谱测定分子量和氨基酸组成分析证明表达产物正确。通过Lys-C蛋白内切酶处理将重组单链ILP转化成双链形式。虽然双链ILP与人胰岛素受体没有结合活力。但圆二色性光谱显示它与胰岛素的结构非常相似,用表达的单链ILP免疫新西兰大白兔,获得了高滴度的多克隆抗体。