人胚胎干细胞传代培养及细胞化学染色特性

目的 体外建立人胚胎干细胞传代培养方法,研究人胚胎干细胞细胞化学染色特性.方法 以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层传代培养人胚胎干细胞,检测人胚胎干细胞、自发分化克隆及拟胚体的细胞化学染色特性.结果 人胚胎干细胞在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上传30代以上其形态保持不变;人胚胎十细胞碱性磷酸酶、过碘酸-雪夫反应、α-醋酸萘酚酯酶染色阳性,自发分化克隆细胞阳性程度明显减弱;人胚胎干细胞形成的拟胚体碱性磷酸酶染色弱阳性,过碘酸-雪夫反应、α-醋酸萘酚酯酶染色阳性.结论 小鼠胚胎成纤维细胞能支持人胚胎干细胞传代培养,细胞化学染色结果能初步鉴别人胚胎干细胞未分化特性.     

杉木雌配子体与后胚发育过程中核酸、蛋白质和类脂的消长

在杉木胚胎分化期至成熟期,每个雌配子体总核酸和DNA,RNA含量在初期增加,后期则随着胚的分化发育逐渐下降,而蛋白质和类脂则一直上升。每胚总核酸、DNA,RNA则相应增加,而蛋白质、类脂的含量和干重亦逐渐增加。在胚分化早期RNA的迅速合成与细胞的分化及器官形成有关。但以胚干重为单位的DNA、RNA含量却随着胚的发育而有所减少;蛋白质含量先增加,至成熟后才下降。授粉前的胚珠,以及雌配子体、胚中都发现有凝集素存在。     

高等植物胚胎的发育生物学研究——Ⅵ.粳稻胚分化发育期间一些大分子物质的动态

鉴测了粳稻胚的发育进程及不同分化发育时期中DNA、RNA、蛋白质、淀粉含量和鲜重、干重、细胞数的变化。 开花后6～13天(胚分化第一到第四叶原基期间)胚细胞数增加时,DNA、RNA含量迅速上升。此后细胞数和DNA、RNA含量都趋于稳定,但RNA在18～25天再次增长。每胚蛋白质和干重基本上随RNA含量相应地变化。 每毫克胚于重的核酸和蛋白质含量在13天出现明显的转折。平均每细胞的DNA含量在整个发育期保持稳定,RNA第一阶段的增长只持续到分化完成的前夕,而蛋白质在25天以前一直增加。 胚内淀粉的累积在整个胚形成期呈现三段斜率不同的直线。以单位干重表示时则在8天左右和21天出现两个高峰,先于RNA和蛋白质两次积累的高峰。 在大分子物质的变化与胚胎发育进程相互关系并与籼稻比较的基础上,将稻胚发育划分为原胚期、分化期、成熟期和休止期。     

第二章 核酸的化学(提要)

核酸是生物体内普遍存在的一类生物大分子。根据化学组分,核酸可以分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两大类。所有生物细胞内部含有这两类核酸,但在病毒,要么只含DNA,要么只含RNA,没有既含DNA又含RNA的病毒。类病毒只是游离的小分子RNA。核酸的生物功能是多种多样的,但最主要的是它具有贮存和传递遗传信息的功能。DNA在细胞内主要存在于染色体中,是遗传信息的主要载体,通过半保留复制将全部遗传信息传给子细胞。细胞核和细胞质中都有RNA。RNA至少有三种主要类型:(1)核糖体RNA(rRNA),(2)转移RNA(tRNA),(3)信使RNA(mRNA)。它们在蛋白质生物合成     

用DNA过量核酸分子杂交法对大鼠肝和大鼠肝癌细胞核RNA的比较研究

用DNA过量核酸分子杂交法观察到,大鼠肝癌细胞中重复频率在10~4以上的Poly(A)-核RNA的频率和种类,均比大鼠正常肝细胞有所增加。大鼠肝癌细胞中重复频率在1—4×10~2的Poly(A)-核RNA和Poly(A)~+核RNA的重复频率,比大鼠正常肝细胞减少,而RNA种类则增加。大鼠肝癌细胞中,接近单拷贝的Poly(A)-核RNA和Poly(A)~+核RNA,其频率比大鼠正常肝细胞略有增加,而种类则减少。用总细胞核RNA得类似结果。     

水稻胚胎形成期间蛋白质和RNA合成活力的变化

用~3H-亮氨酸和~3H-尿苷标记不同发育时期的稻胚,发现蛋白质合成活力呈四阶段变化;各种RNA的合成与胚胎各发育阶段密切有关。α-鹅膏蕈碱(1.0μg/ml)对稻胚RNA合成的抑制作用在开花后7、15和18天较强,13天时很弱。在水稻胚胎形成期间,胚细胞蛋白质合成活力高峰先后出现于胚分化后期(开花后11天)和成熟中期(18天);mRNA的合成在分化初期(7天)和成熟中期(15～18天)较强;而rRNA和/或tRNA的合成高峰则出现在胚胎器官原基分化已经完成时(13天)。     

高等植物胚胎的发育生物学研究——Ⅱ.水稻胚胎发育过程中的生化变化

应用微量生化分析的方法测定了开花后6～30天水稻幼胚分化过程中的DNA、RNA,蛋白质、类脂和干重的动态变化。在人工气候室条件下(25℃,10小时光照)培养的水稻,在开花后第6～15天,即从第一叶原基形成至胚分化完成期间,每胚总核酸含量不断增加。尤其是在胚发育的早期阶段,DNA、RNA含量迅速增加。此后,在开花后18～30天,核酸含量的增加逐趋减缓。在此过程中,每胚蛋白质、类脂含量和干重也相应增加。然而,以胚干重为单位的DNA、RNA含量却随胚的发育而减少。同时,蛋白质含量仍不断增加。所以,DNA、RNA相对含量的减少,可能是由于细胞内含物和结构物质的增加而引起的。至于平均每个细胞的DNA含量,在整个胚发育过程中几乎稳定;而RNA含量,在胚发育的早期阶段有所增加,以后则基本保持同样水平。在胚发育早期RNA的强烈合成可能与细胞的分化和器官形成有关。     

人的类胚胎干细胞中碱性磷酸酶的检测方法和条件

检测人的类胚胎干细胞 (em bryonic stem cells,ES细胞 )中的碱性磷酸酶活性 ,以判别 ES细胞是否处于未分化状态 ,为分离和培养出高度未分化人的类胚胎干细胞 ,建立人类 ES细胞系 ,从而建立体外研究细胞分化和发育调控机制的模型提供方便。本文对检测 ES细胞中碱性磷酸酶活性的钙钴法和α-奈基磷酸技术方法和条件进行了探讨。结果显示 :检测 ES细胞中的碱性磷酸酶用α-奈基磷酸法较钙钴法为好 ,操作更简单 ,不会出现假阳性。分离和培养出高度未分化人的类胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES细胞 ) ,建立人类 ES细胞系 ,再定向诱导其…     

玉米杂种优势与种子萌发时的胚重和RNA、DNA含量的相关性

对10个具优势的玉米单交种及其亲本进行试验。取种子开始萌发的胚(包括胚芽、胚轴和胚根)进行RNA、DNA和全氮的定量测定。做了胚胎细胞数的计测和328单交种及其亲本胚胎石蜡切片的观察。试验结果表明,优势杂种胚中RNA、DNA和全氮含量均比其亲本胚中的含量高。计测胚胎细胞数也表明,杂种比其亲本胚胎的细胞数有明显的增多。从328单交种及其亲本的石蜡切片观察看出,杂种胚胎组织分化提前,器官分化清晰,发育得好。     

大鼠肝癌发生过程基因转录调控机理的研究 Ⅰ.与DNA重复顺序互补的RNA的比较

肝细胞癌变过程,除去在细胞形态和代谢活动方面发生变化外,而且还呈现出某些胚胎肝的表型,如甲胎蛋白和胚胎性同功酶谱等。这些胚胎性蛋白在肝癌细胞中的再现,可能是由于肝细胞基因表达的调控系统,在肝细胞癌变过程中发生了异常变化,以至使己分化成熟的成年肝细胞去分化,进而发展为恶变细胞。我们用二乙基亚硝胺(DENA)诱发大鼠肝癌,在肝癌发生过程中,观察基因调控失调,及其与肝癌发生的关系。首先,     

小鼠胚胎干细胞分化为肝细胞的基因芯片分析

弄清胚胎肝脏发育的分化调节机制,对指导干细胞在肝再生中的应用以及研究肝分化相关疾病分子机制具有重要意义．胚胎干细胞的全能性使得体外建立肝向分化模型成为可能,采用单层贴壁培养方式,分阶段加入成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、制瘤素(OSM)等因子,诱导小鼠胚胎干细胞D3(mESC-D3)的肝向分化．分化细胞在光镜和电镜下呈现肝样细胞形态,RT-PCR、细胞免疫荧光检测以及PAS染色分析表明,这些细胞具有肝细胞特征性的基因表达和生化功能．采用干细胞分化相关基因芯片比较早期肝定向分化前后的基因表达差异,结果显示,48个差异表达基因中(大于2倍),20个上调、28个下调．进一步的生物信息学分析发现,它们集中体现在细胞外基质、细胞连接、FGF、BMP分子及Notch、Wnt信号通路上,提示这些改变可能与胚胎早期的肝向分化密切相关．     

LIF基因转染的ES细胞生长与分化特性的研究

我们将人D型LIF cDNA以正反两种方向分别克隆到载体pKCR 3,并引入neo~r基因,构建成pSVLD( )和pSVLD(-)质粒,按磷酸钙沉淀法分别转染ES-5胚胎干细胞,经G418和不同浓度LIF条件培液共同筛选、Nor-thern和Southern分析以及ES-5细胞集落分化抑制能力测定,建立了过度表达分泌LIF的ESL( )细胞株和表达外源反义LIF RNA的ESL(-)细胞株。我们发现,ESL( )A2细胞能够在无外源LIF常规培液下至少传13代以上,仍能正常生长和传代,并保持与ES-5细胞同样的体外生长的特征性形态,以及具有干细胞特点和发育多潜能性,表明过度表达LIF确实能使ES细胞完全脱离对外源LIF条件培液的依赖性;而表达反义LIP RNA的ESL(-)细胞对培液中LIF浓度的依赖性明显升高,也更易分化,说明ES细胞内源LIF基因的表达水平虽低,但对于抑制ES细胞的分化仍可能是必需的。形态学观察发现,体外悬滴培养中经10~(-6)mol/L RA诱导后,过度表达LIF并未产生抑制ESL( )A2细胞分化的现象,和亲本ES-5细胞比较,也未发现其明显改变了10~(-6)mol/L RA对ESL( )A2细胞诱导分化的方向;而相同条件下,表达外源反义LIF RNA,则使ESL(-)B5细胞更易于向形态明确的细胞包括成纤维样和梭样细胞分化。上述细胞株的建立,提供了一个研究在不添加LIF的常规培液中生长的ES细胞或表达外源反义LIF RNA的ES细胞的生长分化的模型。     

无饲养层培养人胚胎干细胞方法的建立

人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hES细胞)是当前医学研究的热点之一．然而hES细胞培养条件苛刻,通常需要采用鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEFs)饲养层来维持其未分化状态,成为目前hES细胞研究的瓶颈之一、本实验成功地将hES细胞接种在细胞外基质包被的六孔板上培养,传代20次后细胞仍然保持良好的未分化状态,各种hES细胞生物学特性(如表面标志物SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-8l,OCT-4,碱性磷酸酶及体内外分化潜能等)均无改变;其冻存、复苏效果与生长在饲养层上的hES细胞无明显差异．因此,该无饲养层培养体系可以用于培养hES细胞,并为hES细胞转基因研究及大规模培养打下良好的基础．     

胚胎干细胞分化为肝细胞的研究进展

目前 ,细胞移植作为终末期肝病的辅助治疗方法 ,移植的细胞必须满足在受体肝脏中存活、增殖并可分化为成熟肝细胞两个重要条件 ,但目前应用的肝细胞来源有限 ,其功能随着培养时间的延长而逐渐下降等问题限制了这一治疗策略的广泛开展。作为具有发育全能性和无限增殖能力的细胞 ,胚胎干细胞向肝细胞的分化研究近年来引起了广泛的关注 ,并取得了较大的进展 ,寻找合适、高效的分化诱导方法是目前研究的热点之一。胚胎干细胞向肝细胞的分化研究既可以为临床细胞替代治疗提供合适的细胞来源 ,也可以在药物评估和肝脏发育分化基础研究方面起到重要的作用。通过概括肝脏和拟胚体分化发育的分子机制 ,对体外胚胎干细胞向肝细胞分化的几种诱导体系作了介绍 ,并对分化肝细胞的应用前景和存在的问题进行了讨论。     

一种新的培养人胚胎干细胞的包被基质

目的开发一种新的培养人胚胎干细胞(hESCs)的包被基质,使hESCs的培养更加简便。方法用甲醇固定的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为包被基质,人胚胎干细胞系X-01在该基质上生长,每隔5~6 d传代一次,培养10代后,对人胚胎干细胞特性进行检测,包括细胞形态、碱性磷酸酶染色、相关多能性基因的表达和分化能力。结果 hESCs在新的基质上生长良好,经10次传代后仍能保持典型的hESCs克隆形态。碱性磷酸酶染色阳性,免疫荧光染色Oct4、SSEA4、Tra-1-60为阳性,体外分化可形成拟胚体。结论此种固定的基质可以大量制备,长期保存,并可以长期维持hESCs的未分化状态,为人胚胎干细胞的体外扩增探索出了一个新的途径。     

小鼠胚胎干细胞定向分化为神经干细胞过程中microRNA的变化

目的用生物芯片技术分析胚胎干细胞定向分化为神经干细胞过程中microRNA(miRNA)的表达变化,筛选调控的分化的miRNA,研究分化调控机制。方法胚胎干细胞在含LIF培养基中培养3d后,采用经典5步培养方法定向诱导向神经干细胞分化,采用nestin作为神经干细胞标记进行鉴定,送检胚胎干细胞及神经干细胞,提取总RNA以及小分子RNA,经荧光标记后与miRNA基因芯片杂交,获得胚胎干细胞诱导前后miRNA表达谱。结果1)胚胎干细胞在含LIF培养过程中保持未分化状态,Oct-4、碱性磷酸酶表达阳性;2)经典五步法诱导胚胎干细胞定向分化为神经干细胞,nestin阳性细胞为85%;3)通过基因微阵列分析,有90个miRNA的改变显著,其中68个表达上调,22个表达下调。结论miRNA可能对胚胎干细胞定向分化为神经干细胞过程起到关键作用。     

胚胎干细胞向肝实质细胞体外定向诱导分化过程中的肝卵圆细胞

如果肝脏严重受损致使肝细胞大部分坏死,或由于某些原因 ( 肝毒性物质、致癌物质的作用 ) 抑制残存肝细胞增殖时,肝内前体／干细胞———肝卵圆细胞便被激活并分化生成肝细胞和胆管细胞等以参与肝修复 . 基于此理论,人们建立了啮齿类动物肝卵圆细胞诱导实验模型 . 但显然上述模型不适用于人类,所以有必要开发一种适用于人类的、高效的肝卵圆细胞的新诱导模型 . 选用小鼠胚胎干细胞,转成拟胚体分化 3 天后分组,诱导组添加肝细胞生长因子 (HGF) 、表皮生长因子 (EGF) 作定向诱导分化 . 其间用免疫细胞化学 (ICC) 检测肝卵圆细胞标志物 A6 等的表达,用流式细胞仪筛选肝卵圆细胞并行 RT-PCR 、透射电镜检测 . 所筛选的肝卵圆细胞进一步体外培养并进行 ICC 和 RT-PCR ,检测其分化生成成熟的肝细胞和胆管细胞的能力 . 研究证实胚胎干细胞体外定向诱导生成肝实质细胞的过程中,存在着有双向分化能力的肝卵圆细胞这个中间分化阶段 . 诱导组肝卵圆细胞分化率均显著地高于对照组,最高时可达 6.11% 左右 . HGF 和 EGF 能显著性诱导胚胎干细胞源性卵圆细胞的生成 . 流式细胞仪筛选 Sca-1+/CD34+ 细胞占总细胞数的 4.59% ,其中 A6 阳性肝卵圆细胞占 90.81% 左右 . 使用流式细胞仪可获得高富集的 A6+/Sca-1+/CD34+ 肝卵圆细胞 . 提供了一种可适用于人类的肝卵圆细胞的新诱导模型 .     

细胞间相互作用影响iPSc来源肝细胞的成熟

获得功能性的肝细胞可用于研究肝细胞再生机理,并可为细胞移植和药物筛选提供生物材料。该研究采用四步法诱导多能干细胞分化成肝细胞,比较传代和不传代分化细胞的形态和肝细胞特异标志的差异表达。结果发现,利用诱导多能干细胞分化可获得白蛋白(albumin,ALB)阳性的成熟肝细胞,不传代法获得的细胞更接近于肝细胞形态,两组均获得甲胎蛋白(alphafetoprotein,AFP)和ALB阳性表达的细胞;GATA6(GATA binding protein 6)和HNF4A(hepatocyte nuclear factor 4 alpha)表达水平没有显著性差异,但不传代法分化细胞的AFP和ALB表达量高于传代法,存在显著性差异。结果提示,细胞因子与细胞间、多细胞间相互作用等因素影响多能干细胞的分化,细胞间相互作用有利于肝细胞定向诱导分化过程中肝细胞的成熟。     

小鼠胚胎干细胞在六种培养体系的培养观察

目的　观察小鼠胚胎干细胞在六种培养体系中的生长情况。方法　小鼠胚胎干细胞 (ESD3细胞株 )在以下六种培养体系中培养 :1 .原代小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF)有血清培养 ,2 .MEF无血清培养 ,3.SNL细胞有血清培养 ,4.LIF(白血病抑制因子 )有血清无饲养层培养 ,5.LIF无血清无饲养层培养 ,6.大鼠肝细胞 (BRL)条件培养基培养。经体外培养 1 0代后 ,观察其克隆形态 ,同时进行碱性磷酸酶检测并将ES细胞接种于裸小鼠皮下 ,观察ESD3的未分化状态和多潜能性。结果　六种培养体系培养的ESD3具有典型的ES细胞克隆形态 :巢状 (集落状 )隆起生长 ,边缘清楚 ,表面平滑 ,结构致密 ;AKP强阳性 ;裸小鼠体内形成了由多种组织构成的畸胎瘤。结论　六种培养体系均能支持ESD3生长 ,并能保持其未分化性和多潜能性 ,为ES细胞的应用研究奠定了良好的基础。     

LincRNA1230抑制小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞分化

胚胎干细胞是一类具有多向分化潜能的细胞.胚胎干细胞可以模拟体内发育过程,在无外界信号分子刺激的情况下,自发向神经前体细胞分化.有研究表明,这一体外发育过程受神经分化相关转录因子和表观遗传修饰的共同调控,然而该过程中的分子机制尚不清楚.本研究发现长链非编码RNA1230(LincRNA1230)参与了小鼠(Mus musculus)胚胎干细胞向神经前体细胞的分化过程.在小鼠的胚胎干细胞中过表达LincRNA1230可以显著抑制其神经分化效率;反之,干扰LincRNA1230可以提高分化效率.进一步研究表明,LincRNA1230通过结合Wdr5,降低神经分化相关基因启动子区H3K4me3的修饰水平,从而抑制相关基因的表达活性.这些发现揭示了LincRNA1230在小鼠胚胎干细胞神经分化过程中的重要作用.