转双抗虫基因741杨的抗虫效应及其规律研究

通过室内饲虫试验 ,应用昆虫的总死亡率、各龄期死亡率、各龄历期及发育速率、昆虫体重增长速率等指标 ,测定了转双抗虫基因 74 1杨的抗虫性。研究结果表明 ,转基因抗虫杨不同株系对昆虫的致死效应有显著差异 ;不同昆虫种类和同一昆虫幼虫的不同龄级对转基因杨株系的敏感性有明显差异 ,4种测试昆虫的敏感性强弱依次为 :杨小舟蛾 >美国白蛾 >杨扇舟蛾 >舞毒蛾 ,随着昆虫幼虫龄级的增加 ,昆虫对转基因杨株系的敏感性逐渐降低 ;高抗虫株系主要表现为对低龄幼虫的强致死作用 ,中等抗虫株系表现为对各龄幼虫稍低的但是持续的致死效应 ;各转基因杨株系对测试昆虫的生长和发育都有明显抑制作用 ,可导致昆虫的发育历期延长、发育速率和体重增长速率降低。     

转单、双Bt基因741杨外源基因表达和抗虫性比较

【目的】研究联合使用两种或两种以上的抗虫基因的抗虫效果, 同时鉴定并筛选出转双Bt基因741杨对鳞翅目和鞘翅目害虫有较强抗性的株系。【方法】选取转三基因（Cry3Aa+Cry1Ac+API）741杨8个株系、 转双基因（Cry1Ac+API）741杨1个株系和转单基因（Cry3Aa）741杨3个株系为试材, 从外源基因PCR检测、 毒蛋白表达和抗虫性三方面对转基因株系进行对比分析。【结果】经PCR扩增后各转基因株系出现了预期的电泳条带。ELISA蛋白检测显示转基因株系中都有与所含基因相应的Bt杀虫蛋白表达。用转基因株系新鲜叶片进行柳蓝叶甲Plagiodera versicolora和美国白蛾Hyphantria cunea室内饲虫实验表明： 转入不同抗虫基因的杨树对昆虫的抗性具有选择性, 对非靶标昆虫没有毒杀作用。转双Bt基因741杨具有双抗性, 不同转基因株系表现出高中低的抗性水平： 在对柳蓝叶甲的抗性上, 筛选出的其中5个高抗株系（pCCA1, pCCA2, pCCA5, pCCA6和pCCA9）的抗性水平明显比含Cry3Aa单Bt基因的3个高抗株系（pCC11, pCC53和pCC84）高; 在对美国白蛾的抗性上, 有7个株系（pCCA2~pCCA7和pCCA9）的抗性水平与含Cry1Ac单Bt基因株系（pB29）表现一致, 只有1个株系（pCCA1）对美国白蛾表现出了极低的抗性。【结论】多个抗虫基因在741杨上的联合使用, 不仅扩大了抗虫谱, 其中的高抗株系还具有了更高的抗虫能力, 有效地发挥了基因的叠加效应。     

转双抗虫基因741杨节肢动物群落营养结构及生态位变化

转双抗虫基因741杨（简称转基因741杨）节肢动物群落中,基位物种的植食性昆虫丰富度显著降低,但中性节肢动物丰富度却明显增加.高抗和中抗的节肢动物群落中位物种和顶位物种较之对照有所增多.转基因741杨节肢动物群落的害虫功能团,其优势状况,与对照相比有所改变：天敌优势度高于对照,中性节肢动物丰富度增加,并在天敌-害虫的营养链中起着重要的调控作用.鳞翅目害虫的空间生态位宽度最小,其它各功能类群的生态位宽度较大;捕食性和寄生性天敌与鳞翅目害虫的生态位重叠均较小,而与腐生和游逛种类的生态位重叠较大;各类害虫之间、捕食性天敌与寄生性天敌之间亦存在激烈竞争.转基因741杨对寄生性天敌和捕食性天敌在利用时间资源上有正作用.各种功能类群的时-空二维生态位宽度和生态位重叠均不如单维生态位宽度和生态位重叠值大,但抗性株系天敌类群对环境的适应性优于对照.     

‘741杨’D2类细胞周期蛋白基因的克隆及功能鉴定

D类细胞周期蛋白(D-type cyclin,CYCD)调控细胞周期G1/S期转变。CYCD与细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)结合形成CYCD/CDK复合物,被激活的CYCD/CDK复合物通过磷酸化下游细胞周期响应因子调控细胞周期有序进行,进而影响植物的生长发育。该研究以‘741杨’为实验材料,成功鉴定得到1个D2类细胞周期蛋白基因(PtoCYCD2;1)。研究表明:(1)实时定量PCR(qRT-PCR)显示,PtoCYCD2;1基因在根、茎、叶、叶柄、树皮和木质部中均有表达,在叶中的相对表达水平最高。(2)亚细胞定位表明PtoCYCD2;1蛋白定位于细胞核。(3)与野生型(Wild-Type poplar,WT)相比,过表达PtoCYCD2;1基因的‘741杨’出现株高降低,茎直径减小,叶片明显下卷的表型。(4)扫描电镜分析(SEM)显示,转基因杨树叶片的上表皮细胞平均面积变小,细胞数量增多;树脂切片结果显示与WT相比,转基因杨树叶片的栅栏组织和海绵组织的细胞间隙疏松。(5)qRT-PCR结果显示,转基因杨树中细胞周期调控基因CDKA;1、CDKB1;1和CDKB2;1的表达水平显著上调,植物成视网膜细胞瘤相关蛋白1(retinoblastoma-related protein1,RBR1)基因、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(kip-related protein,KRP)基因的表达水平显著下调。该研究结果为进一步研究木本植物CYCD2基因的功能奠定了基础。     

靶标昆虫杨扇舟蛾对转Bt基因741杨胁迫效应的SSR分析

应用SSR分子标记技术,研究了以不同抗性转基因741杨为食物的杨扇舟蛾实验种群的遗传分化,探讨以转Bt基因杨树作为食物对靶标昆虫的胁迫效应.利用筛选出的10对引物,分别对经取食转基因741杨高抗品系‘Pb29’、中抗品系‘Pb17’及未转基因杨(对照)筛选出的杨扇舟蛾实验种群进行遗传多样性和遗传分化研究.结果表明: 10对引物共检测到76条等位基因,平均等位基因7.6个,平均有效等位基因为2.2,平均观测杂合度为0.5167,平均期望杂合度为0.5167,平均多态位点百分率达96.7%.经取食转基因741杨筛选出的杨扇舟蛾实验种群的遗传多样性水平显著高于未转基因种群,且取食转基因741杨的杨扇舟蛾与CK样本间的遗传相似性最低,表明经取食转Bt基因杨树的杨扇舟蛾实验种群遗传多样性有增高趋势.基于SSR分析,转基因741杨对杨扇舟蛾实验种群的胁迫筛选效应明显.     

转C4光合酶基因水稻株系的抗光氧化特性

用经转入磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)、NADP-苹果酸酶(NADP-ME)、PEPC+PPDK等酶的基因的水稻株系及原种为材料,研究了光氧化条件下的叶绿素荧光特性和膜脂过氧化.光氧化处理后,与原种相比,转C4光合酶基因特别是转PEPC和转PEPC+PPDK基因水稻株系的PSⅡ原初光化学效率(Fv/Fm)、PSⅡ在照光下的实际光化学效率(ФPSⅡ)和光化学猝灭(qp)下降的比原种少,而非光化学猝灭(qN)增加的比原种多,说明在光氧化条件下,转C4光合酶基因水稻株系吸收的光能中有较多的光能转化为化学能,过剩的光能通过热耗散而减轻光破坏;同时转C4光合酶基因水稻株系诱导产生的的内源活性氧清除酶系超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)的活性比原种高,从而有效清除水稻叶片内的活性氧(O-2、H2O2),使活性氧积累比原种少,因而膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)产生较少.表明转C4光合酶基因特别是转PEPC和转PEPC+PPDK基因水稻株系耐光氧化能力较强.在光氧化条件下,它们的叶绿素和蛋白质含量下降较少,表现出耐光氧化特性.这些结果为应用生物技术创造耐光氧化种质提供了实验依据.     

转双抗虫基因107杨节肢动物群落特征及相对稳定性

于2015年5—9月对唐山市滦南县苗圃场内的转双抗虫基因(Bt Cry1Ac和API基因)107杨(简称:转抗虫基因107杨)及未转基因107杨(简称:对照杨)进行了节肢动物群落调查,利用群落特征指数、群落相似性系数、群落相对稳定性和主成分分析法对转抗虫基因107杨节肢动物群落特征、相似性、相对稳定性及主成分进行对比分析。调查共获得节肢动物6818头,隶属于2纲,8目,43科,58种。研究结果表明:转抗虫基因107杨和对照杨节肢动物群落中以鳞翅目、鞘翅目、膜翅目、双翅目昆虫为主要类群,其中鳞翅目昆虫个体数量最多;鳞翅目和半翅目昆虫个体数量与对照杨差异显著;在功能类群上,转抗虫基因107杨食叶昆虫个体数量较对照杨显著减少,刺吸昆虫个体数量显著增加;转抗虫基因107杨节肢动物群落多样性指数、均匀度指数较高,优势度指数较低,节肢动物群落物种分布较均匀;相似性结果显示,物种组成与对照杨相似度较高;转抗虫基因107杨节肢动物群落物种间在数量上的制约作用较强;主成分分析表明食叶昆虫物种数量与个体数量、刺吸昆虫物种数量和其他植食性昆虫个体数量是影响转抗虫基因107杨与对照杨节肢动物群落变化的共同主导因子。     

转KN1毛果杨细胞分裂素、赤霉素含量及其相关形态结构

为了研究KN1基因超量表达对木本植物生长发育的影响,本研究测定了转KN1基因毛果杨细胞分裂素类激素及赤霉素的含量,并进行表型及解剖结构观察。结果表明,转基因毛果杨植株细胞分裂素类激素ZR、dhZR和iPA的含量分别为14.14ng/g、18.29ng/g和12.43ng/g,明显高于对照的9.44ng/g、12.47ng/g和7.60ng/g,而赤霉素GAs含量为9.61ng/g,低于对照的12.14ng/g,从而引起其植株矮化、分枝增加、叶片增厚、叶色变深、表皮细胞增大、栅栏和海绵组织发达等现象。本研究将为探索KN1基因对木本植物生长发育的影响提供依据。     

抗虫转基因银河杨的生长特性和抗虫性

以非转基因银河杨(Populus alba×Populus hopeiensis)为对照,对抗虫转基因银河杨抗虫基因Cry3A的稳定性,转基因银河杨的物候期、生长状况和抗虫性进行研究。结果发现,Cry3A基因整合稳定,在根、茎、叶中RNA和蛋白水平均有表达,不同组织中Bt蛋白水平差异显著,茎中Bt蛋白水平最高。抗虫转基因银河杨的物候期、生长状况未发生显著变化,但表现出显著的抗虫性。     

牛POMC基因多态性及其与南阳牛生长性状的相关分析

为研究阿片黑皮质素前体(POMC)在动物采食和能量平衡调控中发挥重要作用, 文章采用PCR-SSCP结合DNA测序方法, 对秦川牛、南阳牛、郏县红牛、晋南牛、鲁西牛、安格斯牛和荷斯坦奶牛共计480头个体POMC基因的多态性进行研究, 并分析了多态位点与南阳牛生长性状的相关性。结果表明, 牛POMC基因3个位点中, 在3′侧翼区P3位点新发现3个连锁存在的SNP(811845 C>T、811821 T>C和811797 A>G, 与NW_928357对照)。POMC基因3′侧翼区多态位点与南阳牛6月龄体重和0~6月龄平均日增重显著相关, BB型个体显著大于AA型(P<0.05)。     

转双抗虫基因杂种741毛白杨的研究

用部分改造后的苏云金芽孢杆菌 (Bt)杀虫蛋白基因和慈菇蛋白酶抑制剂 (API)基因A构建了植物表达载体。然后通过根癌土壤杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens (SmithetTownsend)Conn .)介导将此表达载体上的双抗虫基因转入杂种 741毛白杨 [PopulusalbaL .× (P .davidianaDode P .simoniiCarr.)×P .tomentosaCarr.]获得了一批抗卡那霉素的转化再生植株。用杨扇舟蛾 (Closteraanachoreta (Fabricius) )进行虫试的结果表明有 3株抗虫杨树 ,其中有1株杨树的叶片可使试虫在 6天内的死亡率达 90 %以上 ,而且存活幼虫的生长发育受到了明显的抑制。PCR检测及基因组DNASouthern杂交分析的结果都表明Bt杀虫蛋白基因和API基因已整合到以上 3株抗虫杨树的基因组中 ,而且表现为单拷贝整合。用Bt毒蛋白抗血清进行滤膜免疫反应及ELISA检测结果表明 3株转基因杨树都有Bt杀虫蛋白的表达 ,表达量约占叶总可溶性蛋白的 0 .0 15 %。这是国内外首次报道用双抗虫基因获得的抗虫 741毛白杨植株。     

抗虫的转AaIT基因杨树的获得

通过根癌农杆菌叶盘法将构建在双元载体上的昆虫特异性神经蝎毒素AaIT基因转化至中国南方杨树N106(小叶杨×美洲黑杨,P.deltoides×P.simonii)中,共获得了62株再生植株。PCR分析及PCR产物Southernblotting的分析结果表明,AaIT基因整合在再生植株的基因组上。对部分转AaIT基因植株进行了杀虫实验,转基因植株A5对一龄舞毒蛾(Lymantriadispar)幼虫有明显的抗性,饲喂转基因杨树叶片的幼虫死亡率显著高于未转基因对照植株,其取食面积小,存活幼虫体重明显小于对照。ELISA分析证明了AaIT蛋白的表达。     

NaCl胁迫对转基因杨树外源基因表达的影响

以具高抗虫性的转抗虫基因‘741杨’及在此基础上转入了发根农杆菌Ri质粒T-DNA株系的组培苗为材料,研究了转基因株系BtCrylAc抗虫基因和发根基因的表达及其对NaCl胁迫的反应。结果表明,转入Ri质粒T- DNA上的rol基因后,导致苗木根系数目增加,根系长度减小,IAA和GA含量显著提高,抗虫BtCrylAc基因编码的毒蛋白的表达量降低;随着NaCl胁迫强度的增加,苗高、根系数量、叶绿素含量及IAA、GA含量逐步降低,而根系的长度加大,Bt毒蛋白含量显著提高,表明NaCl胁迫使转基因杨外源Bt毒蛋白基因的表达增强,而发根农杆菌Ri质粒T-DNA的表达下降。     

与杨树木材密度、纤维性状相关的SSR分子标记

通过对美洲黑杨 (Populusdeltoides)×青杨 (P .cathayana)的 68个F2 、双亲及其 4个F1无性系田间随机区组设计 ,5次重复 ,分析了与木材材性有关的木材密度、纤维长、纤维宽以及微纤丝角等性状。结果表明 :纤维长有明显的杂种优势 ,控制该性状表现的基因之间具有正效应的互作 ;控制木材基本密度的基因之间具有负效应的互作。结合SSR分子标记结果 ,采用单因素方差分析法进行标记与性状的相关分析 ,共找到与木材密度、纤维长、纤维宽以及微纤丝角相关联的标记分别为 5、7、4、2个 ;青杨在这 4个材性性状方面也具有对性状起贡献的标记 ,如与木材密度相关的PMGC2 873 1(贡献率 4 88% )标记 ,与纤维长相关的PMGC456 3 (贡献率 2 2 96% )、PMGC2 70 2 2 (贡献率9 17% )标记 ,与纤维宽相关的PMGC2 40 8 1(贡献率 7 18% )标记 ,与微纤丝角相关PMGC2 52 5 1(贡献率 16 59% )标记 ,在育种中如果能正确加以利用 ,也可起到一定的材性改良作用     

转TPSP融合基因小麦的耐旱相关特性

在获得转TPSP基因小麦纯合株系的基础上,对3个转基因株系的耐旱相关生理特性进行了分析。脯氨酸含量测定显示,干旱胁迫过程中小麦叶片中脯氨酸含量逐渐增加,且3个转基因株系叶片中脯氨酸的积累速度和积累量均显著高于非转基因对照;叶绿素荧光参数测定显示,3个转基因株系的Fv/Fm值在胁迫过程中均略高于非转基因对照,转基因株系4-4-4的Fv/Fo值显著高于非转基因对照,表明转基因株系在水分胁迫条件下光合系统II（PSII）的光合效率有所增强;转基因小麦耐旱性鉴定显示：模拟干旱胁迫100h时对照小麦叶片几乎全部萎蔫,而3个转基因株系均表现出较强的耐旱性;复水24h后转基因株系4-9-1、4-4-4和30-1-2的叶片黄化率分别为25.2%、23.3%和27.6%,显著低于非转基因对照（48.8%）。上述研究结果表明转TPSP基因小麦具有较强的耐旱能力,为转基因材料进一步应用于小麦抗旱育种提供了依据。     

转BADH和Bar基因水稻培育及其相关特性评价

采用基因枪法将目的基因AhBADH和Bar转入水稻不育系P88S基因组中,经过PCR和Southern杂交检测,发现目的基因已整合到水稻基因组中.草铵膦发芽试验说明Bar基因已经在植株中正常表达.耐盐鉴定试验表明,转基因株系较对照耐盐性明显提高.光温敏核不育系P88S经过转基因后育性发生改变,表现出一定的可育度.     

油葵含油量相关基因在烟草中的表达

采用RT-PCR和RACE技术从油葵(Helianthus annuus L.)种子中克隆了DGAT基因的cDNA全长序列,命名为HaDl(GenBank登录号为HM 015632).将HaDl与CaMV 35S组成型启动子融合,构建植物表达载体pBI-HaDl,通过根癌农杆菌介导转化烟草.对转基因植株进行GUS及PCR检测,同时采用气相色谱-质谱法(GC-MS)分析转基因烟草叶片中脂肪酸各成分的含量.结果表明:HaDl基因cDNA全长1 936 bp,最大开放阅读框为1 524 bp,编码507个氨基酸;推测的氨基酸序列与其它植物已报道的DGAT1基因的氨基酸序列一致性为70%～80%,具有DGAT1蛋白保守的二酰甘油结合基序"HKWIVRHLYFP",因此HaDl基因属于DGAT1基因家族.GUS活性染色及PCR检测均证明外源HaDl整合到烟草基因组并成功表达.转基因烟草叶片脂肪酸含量测定发现,油酸、软脂酸和硬脂酸的含量得到提高,推测HaDl是植物油脂合成相关的重要基因.     

转C4光合固碳相关基因水稻的研究进展

近10年来, 转C4光合固碳相关基因水稻的研究取得了长足进展, 已受到国内外科学界的广泛关注。本文简要介绍并评述了有关方面的研究进展, 包括水稻的C4光合固碳基因工程、转C4固碳相关基因水稻光合和光氧化的生理特性及转C4光合固碳相关基因水稻的生理育种3个方面; 提出以常规育种和生物技术相结合, 开展转C4光合固碳相关基因水稻的生理育种, 是培育优质、高产超级稻的有效途径。     

转C4光合固碳相关基因水稻的研究进展

近10年来,转C4光合固碳相关基因水稻的研究取得了长足进展,已受到国内外科学界的广泛关注。本文简要介绍并评述了有关方面的研究进展,包括水稻的C4光合固碳基因工程、转C4固碳相关基因水稻光合和光氧化的生理特性及转C4光合固碳相关基因水稻的生理育种3个方面：提出以常规育种和生物技术相结合,开展转C4光合固碳相关基因水稻的生理育种,是培育优质、高产超级稻的有效途径。