AAV在基因治疗中的靶向修饰研究进展

安全、有效、具有靶向性的病毒载体是基因治疗药物在临床上得以应用的关键。AAV是微小病毒科的一种,它能以其低的免疫原性及广泛的宿主性对人及灵长类进行感染,并且经过改造后的AAV病毒能更有效的靶向性特定组织及肿瘤细胞。重点对AAV病毒载体的衣壳蛋白基因工程修饰、转录调控修饰和转录后microRNA干扰表达修饰及衣壳蛋白化学修饰靶向机理,以及改造方法进行介绍。修饰后的AAV能改善其感染引起的性免疫反应、转染效率和肿瘤靶向性。     

抗AAV2单克隆抗体的制备及特性研究

以纯化的重组AAV2病毒颗粒为抗原免疫小鼠,获得7株稳定分泌抗AAV2衣壳蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,其中B10和G4两株单克隆抗体具有中和活性,抗体亚型分别为IgG1和IgG2a型。对这两株单克隆抗体与rAAV病毒结合的特性进行了研究。单克隆抗体B10和G4对rAAV2病毒颗粒的结合均具有良好的血清型特异性,并且这种特异结合作用不被肝素阻断。这两株抗体都不阻断AAV2病毒与敏感细胞的结合,提示它们与病毒颗粒的结合位点都不处于AAV2病毒与主要受体结合的部位内。Western blotting检测结果显示,B10与AAV2的三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3均能结合,而G4不能与AAV2的这三种衣壳蛋白结合。这说明B10与AAV2结合的位点位于衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的重叠部分处并且可能是线性表位,而G4则可能是针对AAV2病毒颗粒构象表位的抗体。这两种结合特性不同的单克隆抗体为研究AAV2病毒颗粒的表面特性和感染特性提供有用的工具。     

腺相关病毒介导的小鼠IX因子在血友病B小鼠体内表达研究

通过重组HSV/AAV辅助病毒方法制备出高滴度(>10~(12))的重组AAV/mFⅨ病毒颗粒,并注射到血友病B小鼠的后肢骨骼肌中,获得了稳定的高水平小鼠Ⅸ因子表达(>370ng/mL),持续时间超过350d。治疗组小鼠体内的Ⅸ因子活性达到正常值的30％,而且出血症状得到显著改善。在小鼠血浆中未发现抗Ⅸ因子的中和抗体,第1次注射后抗AAV抗体的水平也非常低。重复注射AAV/mFⅨ病毒后,不同剂量组的小鼠体内的抗AAV抗体出现了不同的结果。组织分析结果证实了血浆中有功能的FⅨ因子确实来源于骨骼肌。以上结果显示,AAV介导的基因转移是血友病B基因治疗的极有前途的方法。     

腺相关病毒介导的小鼠Ⅸ因子在血友病B小鼠体内表达研究

通过重组HSV/AAV辅助病毒方法制备出高滴度(>10¹²)的重组AAV/mFⅨ病毒颗粒, 并注射到血友病B小鼠的后肢骨骼肌中, 获得了稳定的高水平小鼠Ⅸ因子表达(>370 ng/mL), 持续时间超过350 d. 治疗组小鼠体内的Ⅸ因子活性达到正常值的30%, 而且出血症状得到显著改善. 在小鼠血浆中未发现抗Ⅸ因子的中和抗体, 第1次注射后抗AAV抗体的水平也非常低. 重复注射AAV/mFⅨ病毒后, 不同剂量组的小鼠体内的抗AAV抗体出现了不同的结果. 组织分析结果证实了血浆中有功能的FⅨ因子确实来源于骨骼肌. 以上结果显示, AAV介导的基因转移是血友病B基因治疗的极有前途的方法.     

8型AAV重组病毒介导的凝血因子的基因表达

8型AAV重组病毒载体是新型的基因转移载体,能高效转染肌肉细胞和肝细胞.AAV转染细胞的效果与注射病毒的途径有很大关系.与门脉注射和肌肉注射相比,经腹腔注射的rAAV8病毒能经血液循环转运到全身其他组织器官,形成更加广泛和持久的基因转导.通过腹腔途径把5×1010gc的8型重组病毒载体注射到小鼠体内,2周后,小鼠血浆中有明显的基因表达,1个月至2个月期间多数小鼠表达量达到高峰,然后表达水平下降,直到4个月后血浆中尚维持明显的表达量.凝血实验显示,表达的人凝血因子Ⅸ具有生物活性.免疫组化实验显示,病毒载体已进入体内多组织器官中表达.说明8型AAV病毒载体经腹腔注射后已经血液循环运送到其他组织,并在肌肉、肝脏、肾脏和心脏等器官明显表达,表达产物具有凝血活性.     

AAV介导的hFⅨ基因在血友病B小鼠骨骼肌中特异性表达研究

采用重组腺相关病毒(rAAV)介导人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)微基因在Ⅸ因子基因剔除小鼠骨骼肌中有效表达.在构建的质粒中,rAAV两侧反转重复末端顺序中插入肌酸肌酶增强子(MCK)和β肌动蛋白启动子(βA)调控下的hFⅨ微基因(hFⅨm1).直接肌肉注射高滴度rAAV(2.5×1011/mL),血友病B小鼠血浆hFⅨ最高表达量256ng/mL,凝血活性明显改善.从hFⅨ表达时效曲线来看,hFⅨ水平在第15天达到高峰,随后因血循环中抗hFⅨ抗体的出现而渐次下降.该结果提示采用rAAV系统,体内直接途径开展血友病B基因治疗是值得进一步探索的方向.     

重组HIV-1 gp120 AAV2/1在小鼠和恒河猴体内的免疫原性

本文旨在研究表达HIV-1中国流行株gp120基因的重组腺相关病毒疫苗在小鼠和恒河猴体内的免疫原性。用rAAV2/1-gp120免疫BALB/c小鼠和恒河猴,分别用ELISA和HIV-1假病毒中和试验检测免疫动物血清中HIV-1特异性IgG抗体水平和中和抗体水平,用ELISPOT方法和体内杀伤实验检测HIV-1特异性细胞免疫应答水平。结果显示在小鼠体内用rAAV2/1-gp120仅免疫一次就能诱导较高水平的IgG抗体,IgG抗体至少能持续21周,但没有检测到中和抗体。rAAV2/1-gp120在小鼠体内诱导微弱水平的HIV-1特异性细胞免疫应答。rAAV2/1-gp120在恒河猴体内诱导的HIV-1特异性细胞和抗体反应均很弱,且检测不到中和抗体。提示rAAV2/1载体在诱导抗体反应方面具有特殊优势,但若希望诱导HIV-1特异性中和抗体,则需要改造env基因以提高其免疫原性。     

AAV载体的最新研究进展

腺相关病毒(AAV)是细小病毒家族一员,为无包膜的线形单链DNA病毒。由于AAV有长期潜伏于人体而不具有任何致病性等优点,人们对AAV作为基因治疗载体,基因打靶载体等方面的应用给予了很大的希望。AAV载体的安全性能已经用于帕金森病和囊性纤维病一期的治疗。目前通过不断的发展、改造病毒载体的基因结构,扩大其载体容量,提高病毒产率和转染效率,以使腺相关病毒载体更加符合实际需要。     

H9N2型禽流感病毒核蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的:利用大肠杆菌表达H9N2禽流感病毒(AIV)核蛋白(NP)与GST的融合蛋白并分离纯化,进行动物免疫制备多克隆抗体。方法:根据AIV NP基因序列设计引物,将已经获得的NP基因定向克隆到GST融合原核表达载体pGEX-KG并转化大肠杆菌,在IPTG诱导下获得高效表达。经谷胱甘肽层析柱分离纯化蛋白,制备抗原免疫家兔,得到pGEX-KG-NP多克隆抗体。结果:SDS-PAGE分析显示融合表达蛋白GST-NP相对分子质量约82 000,表达量约占菌体总蛋白的20%。Western-blot和ELISA检测结果表明,重组NP能与鸡抗AIV抗体发生明显的抗原抗体反应。自制的多克隆抗体能特异地与NP相互作用,可用于AIV病原诊断。结论:获得了NP基因的高效表达产物;制备了效价和特异性良好的抗重组NP多克隆抗体。经实验验证表达产物具有活性,多克隆抗体效价高,特异性强,为AIV病原诊断试剂的研发奠定了基础。     

AAV介导的RNAi对SARS-CoV-2 S基因表达的抑制作用

旨在研究AAV介导shRNA在体内、体外特异性抑制SARS-CoV-2 S基因的表达,为抑制SARS-CoV-2感染提供参考。设计了7条靶向SARS-CoV-2 S基因的shRNA,分别构建了shRNA1-7的质粒表达载体,与S基因表达载体共同转染体外培养细胞,通过qRT-PCR和Western blot分析其对S基因表达的抑制作用,筛选出抑制效率最高的shRNA1;构建包装表达shRNA1的重组腺相关病毒(rAAV)载体,将rAAV-shRNA1与S基因表达质粒共同转导293T细胞,S基因表达的抑制率为65.6%;两者通过滴鼻或肌肉注射方式共同转导小鼠,qRT-PCR检测其在体内对S基因表达的抑制率分别为36.8%和90.3%。     

Nurr1基因、AAV载体在帕金森病基因治疗的可能应用

Nurr1属于孤儿核受体家族,目前认为它对中脑多巴胺能神经元的发育、存活和成熟后的表型维持发挥重要作用。Nurr1基因可以提高多巴胺转运体(DAT)基因和酪氨酸羟化酶(TH)基因的转录。在人类,与年龄相关的DA表型标志物TH的降低与黑质部位Nurr1表达的下调有关。Nurr1有望成为帕金森病基因治疗的候选基因。腺病毒伴随病毒(AAV)是目前公认的较有希望的病毒载体,它可以感染非分裂细胞,由AAV-Ⅱ型改造的重组AAV载体可以定点整合于宿主细胞染色体,可以特异性感染神经元,适合对中枢神经系统的治疗。重组AAV应该是能够良好携带Nurr1基因进行帕金森病基因治疗的载体。     

表达重组抗CD52单克隆抗体CHO细胞灌流培养基的筛选

目的筛选重组抗CD52单克隆抗体CHO细胞株培养和连续灌流表达用培养基,以提高抗体表达量。方法通过调整原有批培养用培养基中谷氨酰胺和植物水解蛋白,获得5种培养基配比。使用模拟灌注方式进行细胞培养,分析细胞密度、活细胞比率和目标蛋白表达,筛选连续灌流细胞培养和表达用培养基。最后在7 L反应器中采用灌注培养方式对筛选获得的培养基进行验证。结果使用50 mL细胞培养管进行模拟灌注培养时,活细胞比率较高,达到90%以上;CHO细胞在添加谷氨酰胺至4.0 mmol/L和植物水解蛋白至5.0 g/L的批培养用培养基中生长速度最快;在基础培养基中抗体表达量比优化前高15%。20 d培养周期内,优化的培养基在7 L反应器中可以维持CHO细胞密度在(2 727±253)万个/mL,活细胞比率在95%以上。结论通过模拟灌注培养,筛选获得了一种在7 L反应器灌流培养中适宜于重组抗CD52单克隆抗体CHO细胞表达的培养基。     

重组HIV-AEgp145和SIV-envT基因的rAAV8在小鼠体内的免疫原性研究

病毒性载体疫苗是一种有前途的艾滋病疫苗.为了构建以重组腺相关病毒8型(recombinant adeno associated virus type 8,rAAV8)为载体,表达HIV或SIV包膜蛋白的艾滋病疫苗.同时在小鼠体内对其免疫原性进行评价,为下一步研究奠定基础.本研究分别构建了表达HIVAE亚型和SIVmac239株包膜蛋白(不含胞内区)的rAAV8-AEgp145和rAAV8-SIVenvT两种重组病毒,并通过PCR和WesternBlot方法对重组病毒进行了体外鉴定.将两种重组病毒分别接种BALB/c小鼠,应用ELISA和ELISPOT方法检测小鼠的HIV/SIV特异性抗体滴度和细胞免疫应答强度.结果显示,rAAV8能够在293T细胞中高效表达HIV AEgp145和SIVenvT基因.小鼠接种两种重组病毒3-5W后,均能检测到gp120特异性抗体和env特异性细胞免疫应答,并且在16-20W后反应强度仍显著高于对照组.以上结果提示,携带HIVAEgp145和SIVenvT基因的rAAV8载体能够在小鼠体内诱导中等强度并且持续时间较长的特异性体液和细胞免疫应答.     

一种包装AAV2/5的重组单纯疱疹病毒的构建

为了得到一种可以包装AAV2/5和表达绿色荧光蛋白的重组单纯疱疹病毒,设计并构建了一个由AAV2rep基因和AAV5cap基因嵌合而成的rep2cap5基因,然后,利用一套携带HSV1基因组的粘粒系统(cos6、cos28、cos14、cos56、cos48),将rep2cap5基因插入cos6粘粒上HSV1基因组片段的UL2基因中,而将EGFP的表达单位插入cos56粘粒上HSV1基因组片段的UL44基因中,用这2个重组粘粒与其它3个粘粒(cos14、cos28、cos48)共转染BHK-21细胞获得了重组病毒HSV1-r2c5-EGFP并进行了空斑纯化。HSV1-r2c5-EGFP病毒能够在BHK-21细胞连续传代,并且可以观察到几乎所有的感染细胞都能产生绿色荧光。用PCR方法以及Southern杂交方法表明所获得的HSV1-r2c5-EGFP中携带有rep2cap5基因,用HSV1-r2c5-EGFP感染携带报告基因LacZ的AAV载体细胞株,获得了具有感染性的重组AAV2/5-LacZ。结果表明,所获得的重组单纯疱疹病毒HSV1-r2c5-EGFP可提供AAV2/5载体包装所需的全部辅助功能,是一种能简便、高效制备重组AAV2/5病毒的通用性辅助病毒。     

2型腺相关病毒载体介导正常人β珠蛋白基因在重型地贫流产胎儿造血细胞中的表达

目的:探讨2型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus 2,rAAV2)载体介导人β-珠蛋白基因转染地贫患者造血细胞治疗β-地中海贫血的可行性.方法:分离β 41-42/β 654杂合子型重型β-地贫流产胎儿造血细胞,经rAAV2-β-globin病毒转染(MOI=50)后移植入经X射线照射的BALB/c裸小鼠体内,分别于移植后14d、21d处死受体小鼠,RT-PCR及等位基因特异性PCR法检测人珠蛋白基因在受体小鼠体内的表达.结果:RT-PCR方法于3只受体小鼠骨髓样本中成功检测到人β-actin和人β-珠蛋白基因的表达,而21d处死的转染与对照小鼠外周血样本中未检测到人β-珠蛋白基因表达;等位基因特异性PCR方法在所有受体鼠体内同时检测到β 41-42和β 654突变基因,以及正常β-珠蛋白基因的表达,但rAAV2-β-globin转染组小鼠体内正常人β-珠蛋白基因表达水平明显高于对照组.结论:rAAV2可有效转染β 41-42/β 654杂合子型重型地中海贫血患者造血细胞,并通过exvivo途径介导β-珠蛋白转基因的体内表达,提高红系细胞内正常β-珠蛋白基因的表达水平.     

禽流感病毒H5HA、H7HA、H9HA亚型血凝素基因在毕赤酵母中的表达

利用毕赤酵母表达系统进行了禽流感病毒H5HA、H7HA及H9HA亚型血凝素基因的真核表达研究。首先将H5HA、H7HA及H9HA基因片段分别插入酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC9K-H5HA、pPIC9K-H7HA和pPIC9K-H9HA;再将所获重组质粒分别经SacⅠ、BglⅡ及SalⅠ线性化后,电转化GS115感受态细胞,以插入/替换的方式进行重组,并经MD平板与MM平板筛选,及PCR鉴定,得到重组酵母工程菌GS115/pPIC9K-H5HA、GS115/pPIC9K-H7HA及GS115/pPIC9K-H9HA;用甲醇诱导分泌表达目标蛋白。经SDS-PAGE和Western-blotting检测,结果表明,H5HA、H7HA及H9HA蛋白在毕赤酵母中均获得表达。酵母表达了上述目的蛋白,可直接进行抗原检测,并可用于抗体检测试剂盒及亚单位疫苗制备的辅助研究。     

禽流感病毒H7N2血凝素HA1基因在大肠杆菌中的表达

目的　表达H7N2亚型禽流感病毒 (AIV)HA1基因 ,用于感染H7亚型禽流感病毒抗体的检测和HA1蛋白功能研究。方法　采用RT PCR方法对H7N2亚型AIVHA1基因进行扩增 ,将PCR产物克隆于pGEM T Easy载体 ,将该基因插入pGEX 4T 2中构建HA1基因原核表达载体 ,转化BL2 1大肠杆菌后 ,在IPTG诱导下表达HA1蛋白 ,Westernblot鉴定表达HA1蛋白。电洗脱方法纯化表达HA1蛋白 ,建立间接ELISA方法 ,对感染AIVH7、H9、H5亚型AIV阳性血清进行检测。结果　成功克隆H7N2亚型AIV的HA1基因 ,其核苷酸序列长度 96 6bp ,编码 32 2个氨基酸残基。构建HA1基因原核表达载体在大肠杆菌内表达出约 6 1× 10 3的HA1融合蛋白。Westernblot和ELISA方法鉴定表明 :表达HA1蛋白与感染H7亚型AIV鸡血清有反应 ,与H5、H9亚型AIV阳性血清没有反应。结论　本研究在大肠杆菌中成功表达了H7N2亚型AIVHA1基因蛋白 ,具有与感染H7亚型AIV阳性血清反应原性 ,不与H5和H9亚型AIV感染阳性血清发生反应。     

甲型H7N9流感疫苗的临床研究进展

2016年10月以来,我国感染甲型H7N9流感病例数量急剧增加,截至日前,内地已新增460例病例,已死亡78例,引起了国内外的密切关注。H7N9病毒一旦获得持续人传人的能力,将造成流感的大流行。因此,研发安全有效的H7N9流感疫苗具有重要意义。本文就国内外目前处于临床试验阶段以及已有临床试验结果的H7N9流感疫苗做一综述。     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白单链抗体基因的克隆及表达

构建并表达H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白单链抗体,为禽流感靶向治疗药物的研制制备靶向载体。从分泌血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取mRNA,采用RT-PCR法扩增出重链和轻链可变区基因,通过SOE-PCR法将重链和轻链通过Linker连接起来构建单链抗体基因,将获得的单链抗体基因装入原核表达载体pET28a(+)中,构建重组质粒并表达,以Western blot鉴定单链抗体的特异性。结果成功构建了单链抗体基因,全长714bp,经原核表达,所构建的单链抗体可与H5亚型禽流感病毒HA蛋白特异结合,为禽流感的靶向治疗奠定了基础。