一种可诱发高滴度的针对人乳头瘤病毒HPV16,HPV52,HPV58中和抗体反应的HPV16嵌合病毒样颗粒疫苗的研究

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)主要衣壳蛋白L1病毒样颗粒(VLP)主要诱发型别特异性中和抗体,增加L1VLP型别虽可扩大保护范围,但疫苗生产成本显著增加。HPV16,HPV52及HPV58是我国的主要高危型别。本文将HPV58次要衣壳蛋白L2aa.16～37多肽(与HPV52L2aa.16～37序列相同)插入HPV16L1的h4-βJ coil区,利用昆虫表达体系构建获得16L1h4-58dEVLP,协同人用佐剂氢氧化铝和单磷酰脂质A(Alum-MPL)免疫小鼠。活性检测结果显示16L1h4-58dE VLP免疫血清可中和17种HPV假病毒中的16种,其中针对HPV16的平均中和抗体滴度最高(滴度,76 800),与HPV16L1VLP对照组的相当(P0.05);重要的是,针对HPV58及HPV52的平均中和抗体滴度均大于10~3(分别为4 050和1 725);另外,还可中等滴度中和HPV45(550),HPV18(506),HPV33(500),HPV39(463),HPV68(431),HPV6(300),HPV57(150),HPV11(125)及较低滴度的中和HPV2/HPV27(40),HPV35(38),HPV5(25),HPV31(13),但对HPV59没有中和活性。因此,以本研究构建16L1h4-58dE VLP进行广谱HPV疫苗的研究,可望降低疫苗成本,具有应用前景。     

重组人乳头瘤病毒6型病毒样颗粒诱导中和抗体

为研究重组病毒样颗粒（virus-like particle,VLP)免疫血清的抗感染作用,用重组杆状病毒在昆虫细胞中表达制备的人乳头瘤病毒6型（human papillomavirus type 6,HPV-6)L1 VLP的HPV－6L1＋L2 VLP免疫BALB／c小鼠,获得抗血清,ELISA法测定抗体滴度,在细胞水平和裸鼠异源组织移植模型中评价了免疫血清的中和病毒抗感染作用。VLP诱导了高滴度（＞1：10000）的血清抗体,抗血清可以特异地阻断人胚上皮细胞对VLP的摄入,并且能抑制从尖锐湿疣活检标本提取的HPV对人上皮细胞的感染。重组HPV－6VLP免疫小鼠诱导的血清抗体具有中和病毒、抑制感染的作用。提示重组VLP可以用于研制HVP预防性疫苗。     

乙肝病毒核心抗原作为载体用于病毒样颗粒疫苗研究的主要进展

乙肝病毒核心抗原(Hepatitis B virus core antigen,HBcAg)是乙肝病毒的核壳结构蛋白,由183～185个氨基酸组成,大小约21～23kD。HBcAg由于其能自我组装成病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)、高表达、易纯化以及强免疫原性等特点,使其成为一个高效安全且应用广泛的VLP载体,可用于各种病原的疫苗研发。发展至今已有数十种病毒、细菌以及寄生虫的相关基因的抗原表位成功表达在HBcAg VLP颗粒上,成为新型疫苗研发的重要平台。     

病毒样颗粒抗原的表达、纯化、组装和鉴定

病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是由一种或多种病毒结构蛋白组装成的的颗粒,具有与病毒颗粒相似的外部结构和抗原性,但不含病毒基因。以预防乙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和戊型肝炎病毒感染为目的的三种VLP疫苗已被批准在人体应用。可采用细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞系统表达VLP抗原。表达的VLP抗原可经裂解、粗提、浓縮和精制四个基本步骤纯化。解聚/重组装处理可能增强VLP抗原的效力和稳定性。在研制和生产VLP疫苗的过程中要对VLP抗原的品质、含量、效力和纯度进行检测。     

靶向小衣壳蛋白L2的具有广泛保护性的VLP型HPV疫苗的临床前优化

正理想的预防人类乳头瘤病毒(HPV)疫苗应该具备以下特性,即能够提供广泛的保护性和持久的免疫应答,能够应对所有高危人乳头瘤病毒类型,单一剂量注射后即产生免疫效果,在无需制冷的条件下能够长期保存。基于以上要求,作者已经研制出由噬菌体病毒样颗粒(VLPs)组成的HPV候选疫苗,该噬菌体病毒样颗粒具有广泛的HPV16次要衣壳蛋白L2来源的中和表位。免疫接种16L2 VLPs     

原核表达系统制备HPV58L1 VLP可诱发高滴度且持久的中和抗体

目的:采用大肠杆菌表达系统制备人乳头瘤病毒58型(human papillomavirus type 58,HPV58)病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)疫苗。方法:合成法获得HPV58 L1大肠杆菌密码子优化基因,构建HPV58 L1重组原核表达质粒mpET22b/HPV58 L1,检测其在BL21(DE3)中表达水平,饱和硫酸铵沉淀加阳离子交换层析法纯化蛋白后进行动态光散射(dynamic light scatter,DLS)分析。小鼠免疫后,检测免疫血清针对HPV58假病毒的中和抗体水平。结果:HPV58 L1蛋白在BL21(DE3)细胞中大部分以可溶形式表达,纯化获得的HPV58 L1蛋白可组装成水动力学直径约为74 nm的VLP。0.5μg的HPV58 L1 VLP可诱发小鼠产生高滴度的HPV58特异性中和抗体,可维持至少20周。结论:原核表达系统制备的HPV58 L1 VLP可诱发高滴度且持久的中和抗体,可用于成本低的HPV58疫苗的研究。     

HPV 58 L1改造基因的表达及其VLP产物抗血清制备

高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）慢性持续性感染是诱发宫颈癌的主要病因．体外表达的HPV主要衣壳蛋白（L1）可自组装成病毒样颗粒（virus-like particle, VLP）,免疫后可诱导产生型别特异性中和抗体,有效保护机体免受同型病毒的感染,因此可望预防病毒感染及感染相关的宫颈癌等病变．HPV 58是诱发我国妇女宫颈癌的主要高危型病毒之一,目前尚无针对HPV 58的疫苗问世．本研究联合采用多种策略对HPV 58 L1野生型基因进行改造,获得HPV 58 L1改造基因,命名为HPV 58mL1,用杆状病毒 昆虫细胞表达系统进行HPV 58 mL1的表达,CsCl密度梯度离心法纯化获得HPV 58 mL1重组蛋白,电镜分析结果显示,重组蛋白形成直径约55 nm的VLP．皮下免疫新西兰兔和豚鼠,ELISA检测显示,免疫动物产生高滴度针对HPV 58 mL1 VLP的抗血清,免疫斑点印迹检测显示,抗血清是针对VLP表面表位的．本研究表达了均一性好的HPV 58 mL1 VLP,并获得两个种属的HPV 58 mL1 VLP抗血清,为进一步研究有效预防HPV 58感染的疫苗打下基础．     

Cervarix人乳头瘤病毒疫苗诱导的交叉中和抗体表现α-9种系型间特异性

正高度有效的人乳头瘤病毒(HPV)疫苗含有包括HPV16型和HPV18型两种基因型的病毒样颗粒(VLP),覆盖子宫颈癌病例的70%。疫苗型的保护被认为是由高滴度的型特异性中和抗体所介导的。该疫苗还可以针对某些来自于α-9(HPV16样:HPV31、HPV33、HPV35、HPV52、HPV58)和α-7(HPV18样:HPV39、HPV45、HPV59、HPV68)种群的相关基因型产生一定程度的交叉保护力。交叉保护     

抗Ⅱ型HPV的重组类病毒颗粒的I期试验

在动物模型中证实某些乳头瘤病毒的L1蛋白衍生的类病毒颗粒(VLPs)能够保护抗活病毒攻击。作在人类志愿中测定了Ⅱ型人乳头瘤病毒L1　VLP候选制剂的安全性和免疫原性。结果表明这种疫苗具有良好的耐受性,并且能够诱导高水平的结合抗体和中和抗体,抗Ⅱ型乳头瘤L1抗原的淋巴细胞增生于第二剂接种后明显出现。此外,在用6型和16型乳头瘤病毒的异源性L1　VIP刺激后外周血单核细胞中呈现淋巴细胞增生,从外周血单核细胞培养上清中可测出乳头瘤病毒抗原特异性γ干扰素及IL—5的产生具有统计学意义的显增加。这种乳头瘤病毒VLP疫苗候选制剂既诱导强有力的B细胞应答,又诱导T细胞应答,而且协助性T细胞表位似乎是保守的。     

两种高危型HPV假病毒的构建及其在血清中和抗体测定中的应用

目的 构建人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)16型(HPV16)和18型(HPV18)假病毒,探索优化假病毒制备的条件,并利用制备的假病毒评价HPV疫苗血清抗体的中和活性。方法 将优化后的HPV16和HPV18 L1、L2和EGFP基因片段分别插入pcDNA3.1+载体中,通过多质粒共转染293FT细胞制备假病毒。对转染试剂、多质粒共转染比例、转染时间和细胞裂解时间进行摸索优化,通过测定假病毒的滴度,确定假病毒制备的最佳条件。收获的假病毒用30%的碘克沙醇作为介质进行超速离心纯化,纯化后的假病毒用于电镜观察。利用假病毒中和试验对制备的原核表达复性蛋白HPV16 L1免疫血清以及HPV16和HPV18病毒样颗粒(virus-like particles, VLP)免疫血清进行中和活性评价。结果 成功构建了假病毒,并确定了假病毒制备的最佳条件:pL1∶pL2∶pEGFP等3种质粒共转染比例为1∶0.1∶0.5,总量为4μg;转染时间为72 h,细胞裂解时间为24 h时获得的假病毒滴度最高。透射电镜观察结果显示,HPV16和HPV18假病毒颗粒基本呈规则圆形,形态上与天然病毒颗粒相似。中和试验结果显示,当用原核表达复性蛋白HPV16 L1免疫血清中和HPV16假病毒时,并不能抑制假病毒的感染活性;但HPV16和18 VLP免疫血清能明显的抑制HPV16和HPV18假病毒的感染活性。结论 成功构建并制备了2种高危型HPV假病毒,并可用于中和试验评价HPV疫苗血清抗体的中和活性。     

人乳头瘤病毒中和表位及抗体中和作用机制的研究进展

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)是一类无包膜的小DNA病毒,其衣壳蛋白由主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2组成,持续感染HPV将引起宫颈癌和尖锐湿疣等多种疾病。HPV衣壳蛋白L1和L2中分布着大量中和表位,并具有较强的免疫原性,HPV疫苗可诱导机体产生高滴度的中和抗体并阻碍病毒感染,进而预防宫颈癌等疾病的发生。分析阐述HPV衣壳蛋白中和表位及抗体的中和作用机理,有助于阐明HPV疫苗预防病毒感染的作用机制,为今后设计新一代保护范围更广的HPV疫苗奠定良好的基础。本文就HPV衣壳蛋白中和表位及抗体的中和作用机制进行综述。     

发展中国家接种人乳头瘤病毒疫苗的影响因素

当前,宫颈癌仅次于乳腺癌成为威胁全世界女性健康的第二大恶性肿瘤。宫颈癌的产生和发展与人乳头瘤病毒(HPV)感染密切相关,在宫颈癌患者中几乎100%能检测到HPV感染。接种人乳头瘤病毒疫苗是预防宫颈癌前病变及宫颈癌的主要方法。欧美等发达国家宫颈癌死亡率相对较低,主要是因为他们建立了完善的宫颈癌筛查项目和HPV疫苗接种项目。而发展中国家的宫颈癌死亡率较高,发展中国家缺乏自主研发的HPV疫苗,人们对HPV和宫颈癌认知水平偏低,直接影响HPV疫苗的接受度。本文综述了影响发展中国家接种HPV疫苗的因素,主要包括人们的宫颈癌和HPV感染相关知识水平、文化背景、HPV疫苗安全性与局限性、接种费用等方面。通过加大宣传HPV感染和HPV疫苗的相关知识,由政府和正规医疗机构提供疫苗渠道,同时国家承担全部或部分接种费用,将会大大提高发展中国家人群接种HPV疫苗,有效降低宫颈癌的死亡率。     

人乳头瘤病毒疫苗对宫颈以外部位肿瘤的保护效果研究

人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染可导致肛门-生殖器及口咽等多部位肿瘤.近年来,随着对HPV研究的深入及多种HPV疫苗陆续上市,HPV疫苗对于多部位肿瘤的保护效果受到越来越多的关注.已有大量研究证明HPV疫苗能够有效预防宫颈癌的发生,而近年也逐渐积累了一些HPV疫苗预防宫颈以外部位肿瘤的证据.本文拟综述HPV疫苗对于头颈、肛门、外阴与阴道、阴茎部位肿瘤保护效果的研究进展.     

子宫颈癌预防用人乳头瘤病毒疫苗及其展拓

人乳头瘤病毒(HPV)是人子宫颈癌病原体,这一发现奠定了子宫颈癌预防用人乳头瘤病毒疫苗得以问世的科学基础。临床实践证明,默克(Merck)公司的Gardasil和葛兰素史克(GSK)公司的Cervarix这两种疫苗可预防由HPV16和HPV18引起的子宫颈癌,有效率几乎达100%。Gardasil和Cervarix的成功激动了围绕Gardasil和Cervar-ix的展拓研究。     

人乳头瘤病毒（HPV）58型中和单克隆抗体的制备及初步应用

人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）58型是宫颈癌的主要诱因之一. HPV58在亚洲地区宫颈癌组织中的检出率仅次于HPV16/18. HPV58中和单克隆抗体可用于 HPV病毒样颗粒（virus-like particle,VLP）疫苗的研究,并为病毒感染入侵机制的 研究提供实验材料. 本研究采用HPV58 L1 VLP免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞进行杂交瘤 细胞的制备,通过VLP-ELISA和假病毒中和实验筛选杂交瘤细胞株;经rProtein A纯化 阳性杂交瘤细胞培养上清获得单抗;采用ELISA测定型别特异性中和单抗的亲和力,采用相加实验及变性VLP-ELISA分析单抗识别表位的性质;选取高亲和力单抗建立定量分 析HPV58 L1 VLP的ELISA方法. 获得了2株HPV58特异性中和单抗XM-22和XM-23,亲和常数分别为2.7×107 mol-1·L和1.9×106 mol-1·L,二者识别表位可能不同. 同时获得2株具有交叉中和活性的单抗XM-21和XM-24,除可较高水平中和HPV58外,还可分别交叉 中和亲缘关系较远的HPV18和HPV6. 以XM-22建立的ELISA方法定量分析HPV58 L1 VLP的检测范围为0.05 μg/mL~0.40 μg/mL. 本研究建立的ELISA方法可用于HPV58 L1 VLP疫苗生产的质量控制研究,获得的4株具有不同特点的中和单抗可用于HPV58感染入侵机制 的研究.     

HPVl6和11型Ll基因双价重组质粒的构建

目的　人乳头瘤病毒 (Humanpapillomavirus ,HPV)是一种性传播疾病的病原体 ,由于HPV目前在体外无法进行大量有效地繁殖 ,所以国内外专家都将重点放在基因工程疫苗的研制上。而HPV各型别之间不具有明显的交叉性 ,为防止各型别混合感染 ,联合不同型别的多价基因工程疫苗的研制势在必行。HPV基因组晚期基因L1主要编码主要衣壳蛋白L1,可以自我组装成病毒样颗粒 (virus likeparticles,VLP) ,并可刺激机体产生中和抗体 ,对病毒的攻击起到保护作用。本研究构建HPV16 11L1双价真核表达质粒 ,为制备一种同时可以预防宫颈癌和尖锐湿疣的基…     

中国人乳头瘤病毒6型L1、L2表达及产物自动装配成病毒样颗粒

为研究我国人乳头瘤病毒 6型 (HPV 6 )基因组晚期区序列变异及衣壳蛋白装配特性 ,从中国尖锐湿疣患者病损组织克隆了HPV 6L1和L2序列 ,经测序、拼接 ,获得HPV 6基因组晚期区序列。获得的两条长 2 86 9bp的序列 (GenBank登录号为AY0 15 0 0 6和AY0 15 0 0 8) ,属于HPV 6b亚型 ,与原型序列比较 ,在L1和L2ORF中共有 9个核苷酸变异 ,其中错义突变 4个。将L1和L2分别重组到杆状病毒 (AcNPV)表达载体 ,在Sf9细胞中探讨L1和L2的表达及装配规律。当L1和L2分别表达于Sf9细胞时 ,L1可以在细胞核中装配成病毒样颗粒 (VLP) ,而L2不能。从L1重组杆状病毒单独感染和L1、L2重组杆状病毒同时感染的细胞分别纯化VLP ,获得L1 VLP和L1 L2 VLP。二者在大小及形态上无明显差异 ,直径约 5 0nm ,与真实的病毒粒子相似。L1 L2 VLP包含摩尔比例约为 4∶1的L1和L2 ,具有HPV 6L1VLP构象表位。当用不同比例重组病毒同时感染细胞时 ,一定水平的L2表达可以使L1表达量及VLP产量提高。HPV 6基因组晚期区序列变异率 <0 .2 8% ,70 81位的A→G和 70 99位的G→A两处突变在我国HPV 6分离物中具有代表性。克隆的HPV 6L1和L2序列可以用于表达 ,表达产物 (L1或L1 L2 )可以自发装配成VLP。     

人乳头瘤病毒16型预防性疫苗的研究进展

人乳头瘤病毒16型(HPV16)与宫颈癌的发生关系密切,由于该病毒尚不能在体外有效培养,而限制了预防性疫苗的研究进展.目前通过分子生物学方法在体外表达HPV16病毒样颗粒(VLPs)成为预防性疫苗研究的热点.研究表明VLPs可诱导机体产生抗病毒攻击的细胞免疫和体液免疫应答,从而为预防性基因工程亚单位疫苗的研究提供了重要科学依据.     

人乳头瘤病毒及宫颈癌疫苗的研究——解读2008年诺贝尔生理学或医学奖

德国科学家Harald zur Hausen因发现人乳头瘤病毒（HPV）导致子宫颈癌,与另外两位科学家共享了2008年的诺贝尔生理学或医学奖．HPV是一组小DNA病毒,目前己鉴定有118型．HPV感染人的上皮组织,诱发产生包括妇女宫颈癌和尖锐湿疣在内的多种良恶性增生性疾病,目前已有两种人乳头瘤病毒预防性疫苗上市．对病毒的生物学特性、致癌机制及相关的疫苗的研究进行综述．     

人乳头瘤病毒16型E5与IL-12联合基因疫苗的免疫活性

为了研制人乳头瘤病毒16型(HPV16)防治性疫苗,分析了HPV16 E5与IL-12联合基因疫苗的免疫活性。将构建的pcDNA3.1(+)/E5与pcDNA3.1(+)/IL-12联合免疫BALB/c小鼠,以ELISA测定小鼠血清中抗HPV16 E5 IgG水平、小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4含量;MTT法检测脾淋巴细胞增殖反应。结果显示末次免疫后,联合基因疫苗组和单基因疫苗组血清IgG A450值分别明显高于pcDNA3.1(+)组、pcDNA3.1(+)/IL-12组和PBS组(P<0.01);且联合基因疫苗组显著高于单基因疫苗组(P<0.01)。联合基因疫苗组和单基因疫苗组的IFN-γ和IL-4含量分别均明显高于pcDNA3.1(+)组、pcDNA3.1(+)/IL-12组和PBS组IFN-γ和IL-4含量(P<0.01),且联合基因疫苗组含量显著高于单基因疫苗组(P<0.01)。联合基因疫苗组和单基因疫苗组脾淋巴细胞刺激指数(SI)分别显著高于pcDNA3.1(+)组、pcDNA3.1(+)/IL-12组和PBS组(P<0.01);联合基因疫苗组与单基因疫苗组比较,SI差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明HPV16 E5单基因疫苗以及与IL-12联合基因疫苗均能刺激机体产生较强的免疫应答,且联合基因疫苗优于单基因疫苗。