板桥党参多糖提取工艺优化及对肝癌细胞HepG2的抑制

本文采用星点设计-效应面优化法和正交设计优化板桥党参多糖的提取工艺,并对两种工艺进行比较,同时初步考察了板党多糖对肝癌细胞HepG2细胞的细胞毒作用.本实验的两种方法均以粗多糖得率为因变量,以液料比、提取时间、提取温度为自变量对提取工艺进行系统考察.星点设计优选的最佳工艺为提取时间154.6 min,料液比1∶12.3(m/v),提取温度91.5℃,板党多糖得率为(18.67±1.23)％;正交设计优选的最佳工艺为料液比1∶12(m/v),提取时间3.0h,提取次数2次,板党多糖提取率为(15.49±1.36)％;板党多糖对HepG2细胞细胞毒作用采用噻唑蓝(MTT)法进行检测,结果24 h抑制HepG2细胞的IC50值为346.322 μg/mL,48 hIC50值为325.609 μg/mL.同时检测了板党多糖对HepG2细胞的凋亡诱导作用,结果显示浓度为400 μg/mL时对细胞的凋亡诱导作用最强.实验结果表明两种实验设计方法所优化工艺条件基本相近,但是星点设计-效应面优化法精度更高,可用于指导制剂生产;细胞毒作用的结果表明板党多糖具有抑制HepG2细胞增殖的能力.     

优化脂质体对肝癌细胞株HepG2细胞转染效率

摸索用Lipofectamine 2000(Lipo)转染质粒pEGFP-C1到肝癌细胞HepG2较为合适的转染条件。以HepG2细胞为研究对象,采用脂质体Lipofectamine 2000转染pEGFP-C1质粒,在24孔板先按每孔0.5μg固定pEGFP-C1质粒用量,摸索Lipo在1μL、1.5μL、2μL、2.5μL量上较为合适的用量,确定Lipo用量后,然后固定Lipo为1μL,摸索质粒用量0.5μg、1μg,确定脂质体与质粒的最佳比例。此外,对转染中培养基是否含血清,Lipofectamine 2000与pEGFP-C1质粒比例为1:0.5的基础上,扩大用量,即Lipofectamine 2000 2μL和pEGFP-C1质粒1μg,以及脂质体复合物孵育细胞时间进行优化。最后,采用荧光倒置显微镜观察细胞转染效率和方差分析及秩和检验的统计学方法进行统计分析。结果显示,pEGFP-C1质粒固定为0.5μg时,Lipo用量在1μL及1.5μL用量组转染效率最好,之后随着Lipo用量加大,转染效率下降;固定Lipo用量1μL,pEGFP-C1质粒0.5μg时转染效率最好(p0.05),比例不变,扩大Lipo和质粒用量,并不增加转染效率。转染后于3 h、6 h、8 h、12 h、24 h换成正常培养基培养,转染6 h后换液较好。此外,研究发现培养基是否含血清不影响转染效率。本研究表明在24孔板板中用Lipofectamine 2000转染HepG2细胞时较为合适的转染条件为每孔1μL Lipofectamine 2000和0.5μg质粒,脂质体与质粒的最佳比例为2:1,血清不影响转染效率,用含血清培养基转染后6 h换液培养。     

细胞因子组合对肝癌细胞HepG2生长的影响

目的:探讨细胞因子组合在体外对肝癌细胞HepG2生长的抑制作用。方法:采用正交试验法,3种细胞因子(IFN-α2a、IL-2和GM-CSF)分别选择3种浓度,共分为9组组合,利用MTT比色法,检测细胞因子组合处理96 h后,对HepG2细胞生长的抑制作用,筛选3种细胞因子最佳组合,并进行形态学观察。结果:处理96 h后,不同浓度细胞因子组合对HepG2细胞的生长均有抑制作用,最佳组合为A1B1C1,其抑制率为64.61%。显微镜下可见,细胞变圆,胞浆中颗粒增多,增殖变慢,细胞间接触不紧密,细胞周围碎片增多。结论:已筛选到3种细胞因子的最佳组合,其在体外能够抑制HepG2细胞的生长。     

Nucleostemin siRNA对肝癌细胞HepG2增殖的影响

Nucleostemin(NS)作为核仁蛋白,在神经干细胞、胚胎干细胞以及某些肿瘤细胞中均高表达,在多种肿瘤细胞增殖和凋亡调控中具有重要作用.本文通过瞬时转染NS siRNA降低NS的表达,以探究NS对HepG2细胞增殖和凋亡的影响.结果显示,下调NS表达使HepG2细胞增殖加快,G₁期细胞减少,S期及G₂/M期细胞增加,凋亡减少. 激光共聚焦实验表明,NS与S期激酶相关蛋白2 (S-phase kinase associated protein 2,Skp2)在HepG2细胞中存在共定位现象; Co-IP实验证明,NS与Skp2能相互作用|NS下调后,Skp2出核仁的数量增加,p27和p53表达降低. 总之,下调NS可促进HepG2细胞中Skp2从核仁逸出,p27降解增强,同时p53表达下降,或由此促进HepG2细胞增殖,抑制其凋亡.     

鸡蛋参多糖提取工艺优化及其抗氧化活性研究

目的：优化鸡蛋参多糖水提工艺,并研究其抗氧化活性。方法：在单因素试验结果的基础上,以多糖提取率为指标,采用响应面法优化鸡蛋参多糖的水提工艺;以自由基清除率为指标,采用自由基清除试验考察鸡蛋参多糖体外抗氧化活性。结果：鸡蛋参多糖最佳水提条件为提取时间90 min、提取温度63℃、液料比25 mL/g,在此条件下鸡蛋参多糖提取率达到52.43%;该多糖质量浓度为4 mg/mL时,对DPPH自由基、ABTS自由基和羟基自由基清除率分别为38.13%、54.37%、54.89%。结论：鸡蛋参多糖水提优化工艺可行,该工艺下提取的多糖具有一定抗氧化活性。     

板桥党参最佳采收期的研究

研究了二年生、三年生板桥党参(Codonopsis tangshenO liv.)的产量、多糖含量以及总皂苷含量的动态变化。结果表明:二年生、三年生党参产量在8~10月份都较高,与相同月份之间存在极显著差异(p<0.01);二年生、三年生党参多糖含量在7~9月份都较高,与相同月份之间不存在显著差异(p>0.05);二年生的党参总皂苷含量在11月份最高(1.11%),6月份次之(0.90%),9月份最低(0.77%);三年生的党参总皂苷含量在6月份最高(1.07%),8、9、10月份之间差异不显著(P>0.05),7月份最低(0.72%)。综合考虑产量、多糖及总皂苷含量,板桥党参于栽培第三年8、9月份采收比较合理。     

Sal B对肝癌细胞株HepG2的促凋亡作用

目的揭示丹酚酸B(Salvianolic Acid B,Sal B)对肝癌细胞株HepG2的杀伤作用。方法用不同浓度的丹酚酸B处理HepG2细胞,37℃培养24h。用RT-PCR检测促凋亡基因Bax的转录水平,并用流式细胞术检测细胞凋亡的水平。结果①100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L等浓度的Sal B处理都能使HepG2细胞促凋亡基因bax的转录水平升高,其中100μmol/L处理组最为明显。②不同浓度的Sal B处理都能使HepG2细胞发生凋亡,其中100μmol/L处理组最为明显。结论 Sal B有促进HepG2细胞凋亡的作用。     

提取防风多糖的工艺优化

采用超声波强化和微波辅助提取2种方法提取防风多糖,并与传统热水浸提法在多糖的提取率上进行比较。防风多糖超声提取的最佳工艺条件为超声功率1 000 W、提取时间25 min、液固体积质量比为25,防风多糖微波提取的最佳工艺条件为微波功率560 W、液固体积质量比为30、提取时间10 min,在最佳提取工艺下,2种方法的提取率分别为6.103%和7.639%。与传统热水浸提法相比,超声法和微波法提取防风多糖具有迅速、节能、高效、提取率高等诸多优点。     

鸟氨酸脱羧酶基因反义RNA对肝癌细胞HepG2的影响

目的：探讨鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase,ODC）基因反义RNA对肝癌细胞HepG2的影响。方法：构建ODC反义RNA的真核表达质粒,将此质粒转染HepG2细胞后,RT-PCR和Western印迹法筛选ODC表达抑制的细胞株。以此细胞株为模型,分析ODC反义RNA对细胞生长、细胞周期和对抗癌药物米托蒽醌敏感性的影响。结果：成功构建ODC反义RNA真核表达载体并获得稳定低表达ODC的肝癌细胞株Hr1。与对照细胞相比,ODC低表达引起HepG2细胞生长抑制,72h生长抑制率为31%;流式细胞术检测细胞周期发现,Hr1G1期细胞数（56.2%）显著性高于对照（48.2%）,而S期细胞（25.5%）则显著性低于对照（34.9%）,提示ODC低表达导致G1期阻滞;用米托蒽醌（100μg/L）处理两种细胞后发现,Hr1对药物的敏感性显著性高于对照细胞,处理48h后药物对HepG2和Hr1的抑制率分别是33.4%和60.6%,72h后的抑制率分别是60.8%和83.8%。结论：ODC反义RNA能抑制肝癌HepG2细胞生长,在抗肿瘤治疗中具有潜在的临应用价值。     

NOR1基因转染对肝癌细胞HepG2基因表达谱的影响

NOR1基因是一在正常组织中广泛表达且在肿瘤组织中表达下调的新基因.为进一步研究NOR1基因的功能和寻找其下游基因,利用脂质体技术将NOR1基因转染进HepG2细胞,采用cDNA微阵列技术分析其基因表达谱的改变.试验表明NOR1基因的转染能使Grb2,HBP17,TNFRSF11B等59个基因上调,同时也下调Bik,MAp2K6,ZFP95等103个基因.随后用实时荧光定量PCR对cDNA 微阵列结果中上述3个上调表达基因进行验证,结果表明,基因表达差异具有统计学意义(P<0.05),荧光定量PCR结果与微阵列结果相符.这些结果提示,NOR1基因对肝癌HepG2细胞的生物学行为的影响可能与它对细胞信号转导,细胞周期调控,转录、翻译调控相关基因的表达影响有关.     

NAIF1对肝癌细胞 HepG2 增殖与迁移能力的影响

目的:在肝癌细胞Hep G2中过表达外源NAIF1(核凋亡诱导因子1),探讨NAIF1的亚细胞定位以及对Hep G2增殖和迁移能力的影响。方法:以真核表达质粒p EGFP-N1为对照组,p EGFP-N1-NAIF1为实验组,瞬时转染肝癌细胞Hep G2,利用免疫印迹方法检测NAIF1蛋白表达效率;以DAPI染核,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白定位,确定NAIF1的亚细胞定位;通过MTT方法绘制细胞增殖曲线;通过transwell小室法检测NAIF1对Hep G2迁移能力的影响。结果:在肝癌细胞Hep G2中,外源表达NAIF1主要定位于细胞核;与对照组Hep G2/p EGFP-N1相比,Hep G2/p EGFP-N1-NAIF1的细胞增殖、迁移能力下降(P<0.05)。结论:外源表达NAIF1蛋白定位于Hep G2细胞核,过表达NAIF1抑制Hep G2的细胞增殖与迁移能力,NAIF1可能作为肝癌治疗的潜在靶点。     

封闭EFNA2 基因表达对肝癌细胞HepG2 的转移和运动的抑制作用

目的:构建Ephrin-A2(EFNA2)基因的干扰RNA重组腺病毒,并观察其对肝癌细胞HepG2转移能力的影响。方法:合成EFNA2基因的干扰RNA片段,用基因重组技术构建于腺病毒载体pAD-X,经293细胞包装得到高滴度重组腺病毒pAEFNA2/siRNA,并用real-time PCR进行EFNA2基因表达的验证。将重组腺病毒pAEFNA2/siRNA感染HepG2细胞,48h后用transwell小室法检测病毒对HepG2细胞侵袭和运动能力的影响。结果:经验证病毒正确构建,且HepG2细胞感染病毒pAEFNA2/siRNA后48小时的real-time PCR检测结果未见到有EFNA2基因的表达。病毒感染后transwell小室可见,HepG2细胞的侵袭和运动能力均受到显著的抑制(分别为105±12 v.s.21±7cells/孔和194±22 v.s.39±11,P<0.01)。结论:成功构建了重组EFNA2siRNA腺病毒,并观察到封闭EFNA2对肝癌细胞HepG2的侵袭和运动均有抑制作用。     

布洛芬对肝癌细胞HepG2增殖及wnt／β-catenin信号通路的影响

研究非甾类抗炎药布洛芬对肝癌细胞增殖和β-catenin信号通路的影响,探讨布洛芬影响肝癌细胞增殖的可能机制.体外培养HepG2细胞,MTT法检测不同浓度布洛芬分别作用24、48和96 h后细胞增殖情况;应用RT-PCR检测布洛芬处理HepG2 48 h后β-catenin、cyclin D1和c-myc转录水平的变化;western blotting检测布洛芬对HepG2中β-catenin1蛋白表达量的影响;免疫细胞化学法观察布洛芬处理组HepG2细胞β-catenin的亚细胞定位.结果表明0.7mmol/L的布洛芬处理细胞48 h后能明显见到细胞增殖受到抑制,抑制率达到53.8%,且抑制作用有时间、剂量依赖性:经布洛芬处理后细胞的β-catenin、cychn D1和c-myc转录也受到显著抑制;布洛芬处理组细胞β-catenin蛋白表达低于对照组;布洛芬处理后β-catenin在胞核中定位减少,胞浆定位增多.因此,布洛芬能抑制肝癌细胞的增殖,且随着处理时间和药物浓度的增加,其抑制作用逐渐增强,其抑制作用可能与调控β-catenin信号通路,影响β-catenin的表达和定位,调节下游相关靶基因的转录有关.     

亚麻酸对肝癌细胞HepG2节律的调控研究

目的:探讨多不饱和脂肪酸亚麻酸对肝癌细胞HepG2节律钟的影响。方法:通过50%的马血清刺激诱导HepG2细胞同步化,利用亚麻酸处理同步化后的HepG2细胞。进一步利用荧光定量PCR和western-blot检测节律钟关键基因的变化。结果:HepG2细胞经过亚麻酸处理后节律钟关键基因芳烃受体核转位蛋白3(brain and muscle Arnt-like protein-1,BMAL1)和蓝光受体蛋白1(Cryptochrome 1,CRY1)在转录水平的表达水平有所降低。与此一致的是,在蛋白质水平CRY1和BMAL1的表达同样受到亚麻酸的抑制。同时发现,CRY1的转录水平的节律周期有明显的缩短。进一步研究发现,亚麻酸对HepG2细胞的脂肪酸合成关键基因脂肪酸合酶(Fatty acid synthase,FASN)和硬脂酰辅酶A脱氢酶(Stearoyl-CoA desaturase 1,SCD1),以及免疫促炎因子白细胞介素-6(Interleukelin-6,IL-6)和白细胞介素-8(Interleukelin-8,IL-8)的mRNA的表达具有明显的抑制效应。结论:亚麻酸影响了肝癌HepG2细胞水平的节律基因的表达水平以及缩短了节律基因的周期,并且对于HepG2细胞的脂肪酸合成以及免疫促炎因子有明显的抑制效应。     

金针菇多糖的提取工艺优化及荧光标记研究

通过响应面法优化金针菇多糖热水浸提的最佳工艺,并用异硫氰酸荧光素(FITC)标记金针菇多糖(FVP),研究标记多糖的体外稳定性和细胞毒性。结果表明:优化的最佳浸提条件为液料比41∶1(m L∶g)、提取温度92℃、提取时间3 h,金针菇多糖的提取率为4.87%;通过还原胺化反应实现了金针菇多糖的FITC标记,FITC的取代度为0.90%,在24 h内标记的金针菇多糖体外稳定性良好,且不影响FVP的抑瘤活性。     

超声波法提取大枣多糖工艺的优化

为了进一步提高大枣多糖的提取效率,本文通过正交试验优化了超声波法提取大枣多糖的工艺条件。考察的因素包括料液比、超声功率、超声时间和浸提温度。结果显示超声波法提取大枣多糖的最佳提取工艺条件为:料液比1∶30、超声功率80W、超声时间10min,浸提温度80℃。在此工艺条件下大枣多糖的提取率达到6.97%。该工艺条件下提取率较高,因此适合于提取大枣中的多糖类化合物。     

有柄石韦中多糖提取工艺的优化

通过正交试验对有柄石韦中多糖提取工艺进行研究,为有柄石韦的深入开发利用提供基础材料。以多糖得率为指标,通过单因素和正交试验,对有柄石韦中多糖提取的工艺参数进行优化。超声时间、超声温度、料液比、水浴温度在多糖提取中影响因素的大小顺序为:提取时间温度料液比。有柄石韦中多糖提取最佳工艺参数组合为:超声温度40℃,提取时间60 min,料水比1∶8 g/mL,水浴时间130 min。以苯酚-硫酸法测定有柄石韦中多糖的提取率,方法可行,稳定。     

冷杉侧耳多糖提取工艺优化及体外抗氧化活性

【背景】冷杉侧耳（Pleurotus abieticola）是一种新型食药用真菌,具有潜在的经济价值。【目的】更好地开发利用冷杉侧耳中的多糖成分,挖掘潜在的功能性食品。【方法】采用响应面分析法对冷杉侧耳多糖的提取工艺进行优化,并通过设置不同浓度梯度的多糖和Vc （阳性对照）考察该多糖的1,1-二苯基-2-苦基肼自由基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl free radical,DPPH）、2,2''-联氮-双-3-乙基苯并噻唑林-6-磺硫（2,2''-azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate,ABTS）和羟基自由基（hydroxyl radical,·OH）的清除能力及铁离子还原能力来评价冷杉侧耳多糖的体外抗氧化活性。【结果】最佳提取工艺：提取时间122.62 min,提取温度60.27℃,液料比28.87：1（体积质量比）,在该条件下,冷杉侧耳纯多糖提取率达到极大值2.39%。该多糖在浓度为1 mg/mL时,DPPH自由基清除率为49.42%,ABTS自由基清除率为88.37%,羟基自由基清除率为19.87%,铁离子还原力为0.273。【结论】本研究为更高效地开发与利用冷杉侧耳多糖提供了理论依据,为进一步挖掘其生物活性及多糖产品打下了基础。     

肺形侧耳发酵培养基优化及多糖提取工艺

通过碳源、氮源单因素实验和正交实验,对野生肺形侧耳进行发酵培养基优化。选取浸提时间、浸提温度及液料比3个因素,以胞内粗多糖提取率为指标,采用正交实验设计确定菌丝体胞内多糖提取的最佳工艺。结果表明,适宜肺形侧耳深层发酵的培养基为蔗糖1.5%,麸皮5%,蛋白胨0.6%,KH₂PO₄ 0.15%,MgSO₄ 0.75%,VB₁ 0.01%。胞内多糖提取的最佳工艺为浸提时间2h,液料比50:1,浸提温度90℃,此条件下多糖提取率为34.35%。     

绵马贯众多糖超声提取工艺优化及抗氧化活性分析

绵马贯众是中国传统常用中药,本研究以温度、时间、超声功率、液料比为影响因子,多糖得率为评价指标,通过响应面法优化超声辅助提取绵马贯众多糖的工艺条件,同时测定其基本理化性质及抗氧化活性。研究结果表明,绵马贯众多糖的最佳提取工艺条件为:温度64℃、时间60 min、超声功率210 W、液料比27 mL/g。此时多糖得率为9.57%,与预测值接近。理化性质分析表明绵马贯众多糖为含少量蛋白的酸性多糖。体外抗氧化研究表明绵马贯众多糖具有很强的DPPH自由基清除活性,IC50值为0.29 mg/mL;较好的羟基自由基清除活性,其IC50值为1.10 mg/mL;对DNA的氧化损伤有显著的保护作用。绵马贯众多糖可以作为一种潜在的抗氧化剂应用于食品和化妆品等领域。