单纯疱疹病毒1型单链结合蛋白ICP8研究进展

在单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus 1,HSV⁃1)中,感染细胞蛋白8(Infected cell protein 8,ICP8)是由UL29基因编码的一种单链DNA结合蛋白(Single strand DNA⁃binding protein,SSBP),该蛋白在病毒复制中必不可缺,具有维持单链DNA的稳定性,并与其他病毒蛋白相互结合,促进病毒复制室的形成,介导晚期基因的表达。除此之外,ICP8还具有促进UL9编码的起源结合蛋白(Origin binding protein,OBP)和UL5/UL8/UL52蛋白的酶活性,与UL12蛋白共同介导链交换等功能。本文就上述目前国内外对HSV⁃1 ICP8的研究进展作一综述,以期为后续研究ICP8的作用机制提供参考。     

单纯疱疹病毒1型VP16蛋白和VHS蛋白研究进展

单纯疱疹病毒1型(HSV-1)为有包膜的DNA病毒,能引起皮肤性疱疹、角膜炎、脑炎等症状.HSV-1感染细胞后,要么进入裂解性感染阶段,要么进入潜伏感染阶段.受感染的细胞常会启动免疫系统抵抗病毒,而病毒却通过某种机制巧妙地逃避宿主的免疫反应并进入潜伏.进入潜伏感染阶段的病毒又会因机体受某种刺激而被激活进入裂解感染期.在这期间,有两个关键的病毒蛋白一间层蛋白(Viral protein 16,VP16)和内膜蛋白(Virion host shutoff protein,VHS)倍受关注,它们既是HSV-1的结构蛋白,在病毒复制晚期参与病毒颗粒的组装,同时又作为重要的功能蛋白,在病毒感染早期发挥重要的转录调节功能.下面就这两个蛋白相关功能的研究进展作一简要综述:     

单纯疱疹病毒1型VP16蛋白和VHS蛋白研究进展

单纯疱疹病毒1型(HSV-1)为有包膜的DNA病毒,能引起皮肤性疱疹、角膜炎、脑炎等症状。HSV-1感染细胞后,要么进入裂解性感染阶段,要么进入潜伏感染阶段。受感染的细胞常会启动免疫系统抵抗病毒,而病毒却通过某种机制巧妙地逃避宿主的免疫反应并进入潜伏。进入潜伏感染阶段的病毒又会因机体受某种刺激而被激活进入裂解感染期。在这期间,有两个关键的病毒蛋白一间层蛋白(Viral protein16,VP16)和内膜蛋白(Virion host shutoff protein,VHS)倍受关注,它们既是HSV-1的结构蛋白,在病毒复制晚期参与病毒颗粒的组装,同时又作为重要的功能蛋白…     

靶向ICP4的小干扰RNA对HSV-1病毒复制能力的影响

HSV-1是一种嗜神经病毒,能引起一系列神经系统严重症状,然而目前抗HSV-1药物易反弹、不能完全清除潜伏的病毒。ICP4对HSV复制、转录起主要调节作用,决定着溶细胞型感染或潜伏状态的平衡点。为了探寻新的抗病毒策略,本课题以HSV-1ICP4基因为靶点,设计合成2对siRNA,并构建重组真核慢病毒表达质粒pL-KO-puror-hU6-siRNA,通过脂质体转染和嘌呤霉素筛选建立靶向ICP4的4个siRNA单克隆细胞系,Real-timePCR法检测细胞系中ICP4的mRNA表达水平,TCID50法检测siRNA对HSV-1病毒复制能力的影响。结果显示靶向siRNA能有效抑制单克隆细胞系中的ICP4表达,并且抑制ICP4的表达后HSV-1病毒复制能力明显减弱,表明靶向ICP4的siRNA对HSV-1复制有明显抑制作用,且多位点siRNA联合干扰对病毒复制有协同抑制效果,有望应用于生物抗病毒药物的制备。     

特异性干扰ICP27基因的siRNA对HSV-1病毒复制的影响

针对单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus 1,HSV-1)的ICP27基因和其他疱疹病毒相关基因的高度保守区设计小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),研究其抑制病毒复制的效果。首先构建相应的小发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA),然后通过病毒滴度测定、real-time PCR和细胞致病变效应(cytopathic effect,CPE)检测所设计的siRNA抑制病毒复制的能力。结果显示,所设计的shRNA-2(靶序列起始位置815)和shRNA-3(靶序列起始位置1 367)具有明显地抑制病毒复制的效果。尤其是shRNA-3,抑制病毒复制的效果更明显,在病毒滴度实验中,与阴性对照相比,其抑制倍数为81,同时可以下调ICP27基因的mR NA表达水平。实验结果表明shRNA-3能够显著抑制HSV-1病毒复制的能力,可以作为HSV-1感染性疾病的补充治疗手段,其对应的靶序列可以作为抗HSV-1新的靶标。     

HSV1即刻早期基因产物ICP22对P53-mdm-2反式转录激活功能的抑制作用

Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV1)即刻早期基因产物ICP22在病毒感染细胞的过程中能够和细胞内的多种调控分子发生相互作用, 从而影响细胞内正常的分子生物学过程. 在转染细胞内表达的ICP22分子能够促进细胞进入S期, 这一作用可能是通过ICP22对mdm-2启动子的结合作用, 从而影响了P53对其的反式转录激活作用, 导致MDM-2结合P53并经泛素途径降解的效应降低, 间接地使细胞内P53水平增加而使细胞进入S期的过程加速.     

HSV-1立即早期蛋白ICP22与VP16共同参与α基因转录调控的初步分析

Ⅰ型单纯疱疹病毒（herpes simplex virus1,HSV-1）在宿主体内形成两种感染模式,不同感染模式的建立与病毒α基因的表达相关.作为病毒α基因表达产物之一的ICP22在病毒复制中发挥了多重作用,但其确切功能尚不清楚.实验利用氯霉素乙酰转移酶（chloram-phenicol acetyl transferase,CAT）报告系统发现ICP22非特异地抑制多种病毒或细胞启动子的转录启动作用,而且该抑制作用不受特定的病毒或细胞启动子上游调控元件影响.进一步的实验发现,HSV病毒蛋白VP16通过结合α4基因启动子上游特定元件解除ICP22对α4基因的转录抑制.这些结果提示,ICP22和VP16可能共同参与α基因的转录调控,从而建立HSV-1裂解性增殖或潜伏性感染.     

单纯疱疹病毒1型DNA聚合酶辅助亚基UL42的研究进展

单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type 1, HSV-1) UL42作为病毒编码的DNA聚合酶辅助亚基之一,是一种多功能蛋白,其在催化和调节病毒在细胞核内的有效复制发挥了重要的作用。已知UL42能提高DNA聚合酶催化亚基UL30的持续合成能力,激活病毒DNA聚合酶活性;介导DNA聚合酶的入核;与DNA模板链结合,提高病毒复制的保真度,以及含有抑制DNA聚合酶活性的肽段,提示其在病毒复制过程中也可能具有负调控作用。近期亦有报道显示,UL42能够阻断肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)激活的核转录因子(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路以及干扰素调控因子3(interferon regulatory factor 3, IRF-3)的功能,提示其在病毒逃逸宿主天然免疫反应中发挥了一定的功能,但具体的作用机制尚不明确。本文对目前国内外HSV-1 UL42的结构特点、主要功能、作用机制及其在抗病毒药物研发中的研究进展进行综述,为后续揭示病毒致病机制和抗病毒药物的研发提供参考。     

SiRNA干扰HSV-1即刻早期基因α22效应的初步分析

以HSV1即刻早期基因α22为靶点,应用T7RNA聚合酶体外合成siRNA1和siRNA2序列,脂质体转染法将其导入Hep2或KMB17细胞,再接种HSV1病毒,通过细胞形态和病毒滴度的测定,初步探索了siRNA干扰α22基因的的效应。结果表明,在Hep2中,转染siRNA的实验组与对照组的细胞病变时间相同,子代病毒的生长曲线也没有显著差异;而分别转染或共同转染siRNA1和siRNA2于“限制"性细胞KMB17中,接种病毒后,ICP22特异的siRNA对HSV1的复制则表现了相应的干扰作用,细胞病变慢,子代病毒的最高滴度峰值出现较晚。     

SiRNA干扰HSV-1即刻早期基因α22效应的初步分析

以HSV1即刻早期基因α22为靶点,应用T7 RNA聚合酶体外合成siRNA-1和siRNA-2序列,脂质体转染法将其导入Hep-2或KMB17细胞,再接种HSV1病毒,通过细胞形态和病毒滴度的测定,初步探索了siRNA干扰α22基因的的效应.结果表明,在Hep-2中,转染siRNA的实验组与对照组的细胞病变时间相同,子代病毒的生长曲线也没有显著差异;而分别转染或共同转染siRNA-1和siRNA-2 于"限制"性细胞KMB-17中,接种病毒后,ICP22特异的siRNA对HSV1的复制则表现了相应的干扰作用,细胞病变慢,子代病毒的最高滴度峰值出现较晚.     

人中性粒细胞多肽HNP1，3体外抗单纯疱疹病毒Ⅰ型的作用

体外观察人中性粒细胞多肽1,3(Humanneutrophilpeptide,HNP1,3)及阿昔洛韦(Acyclovir,ACV)对单纯疱疹病毒-Ⅰ型(Herpessimplexvirus1,HSV-1)的抑制作用。以Vero细胞为靶细胞,用各种浓度HNP1,3与游离病毒颗粒(直接失活组)及感染病毒后的靶细胞(复制抑制组)进行相互作用,镜下观察各药物对HSV-1致细胞病变效应的抑制作用,并采用ELISA法测定感染48h后药物对HSV-1囊膜糖蛋白分泌的抑制作用。MTT法检测各药物对细胞的毒性作用。结果显示直接失活组中,HNP1,3可使HSV-1的致细胞病变效应减轻,对HSV-1直接失活的50%有效浓度(EC50)为8.1μg/mL、10.03μg/mL;复制抑制组中,ACV使HSV-1的致细胞病变效应减轻,EC50为0.68μg/mL。MTT检测结果表明HNP1,3在治疗浓度范围内无明显细胞毒性。以上结果表明HNP1,3除具有较强的抗菌作用和抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(Humanimmunodeficiencyvirus1,HIV-1)活性外,还能失活HSV-1病毒颗粒,从而逆转病毒及其蛋白的病毒效应(致细胞病变)和抑制病毒蛋白质的合成。     

人中性粒细胞多肽HNP1,3体外抗单纯疱疹病毒Ⅰ型的作用

体外观察人中性粒细胞多肽1,3(Human neutrophil peptide,HNP1,3)及阿昔洛韦(Acyclovir,ACV)对单纯疱疹病毒Ⅰ型(Herpes simplex virus 1,HSV-1)的抑制作用.以Vero细胞为靶细胞,用各种浓度HN1,3与游离病毒颗粒(直接失活组)及感染病毒后的靶细胞(复制抑制组)进行相互作用,镜下观察各药物对HSV-1致细胞病变效应的抑制作用,并采用ELISA法测定感染48h后药物对HSV-1囊膜糖蛋白分泌的抑制作用.MTT法检测各药物对细胞的毒性作用.结果显示直接失活组中,HNP1,3可使HSV-1的致细胞病变效应减轻,对HSV-1直接失活的50%有效浓度(ECs0)为8.1μg/mL、10.03μg/mL;复制抑制组中,ACV使HSV-1的致细胞病变效应减轻,EC5o为0.68μg/mL.MTT检测结果表明HNP1,3在治疗浓度范围内无明显细胞毒性.以上结果表明HNP1,3除具有较强的抗菌作用和抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(Human immunodeficiency virus 1,HIV-1)活性外,还能失活HSV-1病毒颗粒,从而逆转病毒及其蛋白的病毒效应(致细胞病变)和抑制病毒蛋白质的合成.     

MEK1-ERKs级联激活方式是调控单纯疱疹病毒Ⅱ型复制的重要机制

本研究通过阐明MEK1和MEK2亚型在单纯疱疹病毒Ⅱ型(herpes simplex virus type 2,HSV2)复制中介导的Raf/MEK/ERK(简称ERK)通路活化中的作用,以期进一步阐明该通路调控病毒复制的机制.研究中应用了MEK抑制剂U0126、针对MEK1和MEK2的特异性小干扰RNA(small ...     

细胞MEK1/2蛋白及其相关通路在单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）复制中的作用

基于细胞Raf/MEK/ERK信号通路与病毒复制的关系,应用Western印迹检测 p-ERK1/2蛋白的表达、用终点滴定法测定病毒增殖量（TCID_５０）,以及观察感染细胞的细胞病变效应（CPE）等,揭示单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)复制与 ERK通路的关系. 结果表明,HSV-2的复制可引起细胞ERK通路的活化;用U0126预先抑制ERK通路的活化,或用特异性siRNA敲减MEK1/2基因的表达可显著地抑制病毒复制.提示ERK信号通路以及MEK1/2蛋白对HSV-2的复制具有重要的作用.该研究对进一步阐明细胞ERK通路各激酶蛋白在病毒复制中的作用机制、寻找抗病毒作用靶标等奠定了良好的基础.