发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒微复制子的建立

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)是我国新发现的一种布尼亚病毒,可引起人类严重发热伴血小板减少综合征。我们利用RNA聚合酶Ⅰ体系,分别构建SFTSV三个片段L、M、S微复制子,研究其非编码区调控功能。将报告基因绿色荧光蛋白(GFP)或荧光素酶(Luciferase)分别插入SFTSV三个片段5′和3′非编码区之间,所形成的嵌合cDNA反向插入含RNA聚合酶I的表达载体pHH21中,获得SFTSV微复制子重组质粒L-GFP-pHH21、M-GFP-pHH21、S-GFP-pHH21、L-Luc-pHH21、M-Luc-pHH21和S-Luc-pHH21,分别与成功表达SFTSV聚合酶蛋白(L蛋白)和结构蛋白(N蛋白)的质粒VR1012-L和VR-1012-NP共同转染293T细胞,24～48h后观察GFP表达情况或检测萤光素酶表达量。L、M、S片段GFP微复制子均可观察到特异性绿色荧光。荧光素酶定量结果显示其在不同节段非编码区中的表达量不同,提示SFTSV三个节段的非编码区启动微复制子转录和复制的强度不同。     

表达EGFP报告基因口蹄疫病毒亚基因组复制子的构建

【目的】构建含有EGFP报告基因的口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子系统。【方法】利用融合PCR方法,将EGFP报告基因替换O型FMDV全长c DNA克隆中的前导蛋白Lb和结构蛋白P1基因,构建含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDV-EGFP。复制子质粒连续转化、测序检验复制子载体的稳定性。Not I线性化的复制子FMDV-EGFP用脂质体介导法转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞后,不同时间段观察EGFP荧光表达情况。转染的细胞用流式、间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot检测该复制子载体的自主复制能力和口蹄疫病毒蛋白的表达情况。【结果】复制子质粒的连续转化及测序表明报告基因可以稳定存在。FMDV-EGFP复制子转染BSR/T7细胞3 h后在荧光显微镜下能够看到绿色荧光,EGFP荧光信号随着转染时间的延长逐渐增加,并且荧光信号可持续6 d以上。转染24 h后的细胞流式分析显示转染的细胞中有6.0%发出荧光,说明构建的复制子载体能够有效表达EGFP蛋白。另外,间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot方法也检测到该复制子RNA在BSR/T7细胞中能够进行自主复制,并且能够表达病毒的非结构蛋白。【结论】含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子的成功构建为进一步研究病毒复制、翻译机制及筛选抗病毒药物等奠定了坚实的基础。     

乙型脑炎病毒表达载体的研究

用RT-PCR方法分段扩增了乙型脑炎病毒SA14—14—2疫苗株5′、3′NCR,利用融合PCR技术在5′、3′NCR之间引入BamHⅠ酶切位点,将5′NCR置于T7启动子控制之下,构建乙脑病毒微复制子表达载体pMR。分别将绿色荧光蛋白(GFP)和汉滩病毒核蛋门编码区基因插入到pMR中,构建两种表达外源基因的乙脑病毒微复制子表达载体：pMR—GFP和pMR-84FliS。绎荧光显微镜直接观察、Western blot、ELISA等方法检测,证实外源基因能够在辅助病毒SA14—14—2感染的BHK-21细胞中表达。     

用表达T7RNA聚合酶细胞系拯救麻疹病毒微复制子

构建稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系,用于提高拯救麻疹病毒微复制子效率.PCR扩增T7RNA聚合酶基因,克隆到真核表达载体,转染Vero细胞,用G418筛选到稳定表达的细胞株Vero/pcDNA3-T7.用Westernblotting证明了T7RNA聚合酶在细胞中的表达.将T7启动子控制绿色荧光蛋白表达的质粒转染该细胞后,绿色荧光蛋白在细胞株中得到表达.反向插入报告基因的微复制子转染感染麻疹病毒的Vero/pcDNA3-T7细胞后,细胞中能够检测到报告基因的表达.用细胞系取代痘苗病毒系统,可以提高拯救效率.     

XJ—160病毒复制子型表达载体的构建

D-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,全基因组测序已经完成。本文利用该病毒全基因序列首先构建了全基因组cDNA克隆质粒,在此基础上,利用基因重组技术将病毒结构基因序列替换为含有多个单酶切位点的序列,得到复制子表达载体质粒pRepxjl60。为验证载体的功能,将报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)分别插入到载体的多克隆位点,得到两个表达质粒;经体外转录获得的转录体RNA转染BHK-21细胞后14h,可检测到报告基因的表达。结果表明我们构建的XJ-160病毒复制子型表达载体具有自主复制功能,可以表达异源基因。本研究为进一步开发具有我国自主知识产权的甲病毒载体奠定了基础。     

中蜂囊状幼虫病毒非编码区对蛋白翻译的影响

RNA病毒非编码区对病毒RNA的转译起始、稳定及病毒蛋白表达等方面均起着重要作用,为研究中蜂囊状幼虫病毒（Chinese sacbrood virus,CSBV）非编码区（Untranslated region,UTR）是否对蛋白翻译存在作用,将CSBV 5’UTR和3’UTR分别插入报告基因绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）5’端,通过观察绿色荧光强度研究CSBV非编码区对蛋白翻译的影响。此外,利用双荧光素酶检测试剂盒检测5’UTR和3’UTR对荧光素酶活性的影响。结果表明：CSBV 5’UTR和3’UTR能够有效抑制绿色荧光蛋白EGFP表达,其中3’UTR抑制绿色荧光蛋白表达作用更强;经双荧光素酶报告系统检测,质粒pGLl-3’UTR和pGL3-5’UTR中报告基因相对活性分别为对照质粒pGL3-control的0.39和0.69,差异极其显著（P<0.001）。由此可见,CSBV 5’UTR和3’UTR对其蛋白翻译存在抑制作用,且3’UTR作用更加明显。通过本研究,为深入认识CSBV 5’UTR和3’UTR在病毒复...     

人呼吸道合胞病毒微型复制子的构建

摘要：【目的】构建RSV微型复制子（minireplicon）并进行功能学研究。【方法】构建含RSV病毒前导序列（Leader, genomic promoter, Le）、转录起始信号（gene start, GS）、多克隆酶切位点、转录终止信号（gene end, GE）和尾随序列(Trailer, antigenomic promoter, Tr)的基因片段GSGE,通过引入T7 RNA多聚酶（T7 RNA polymerase, T7 RNP）启动子、克隆入载体px8δT和插入增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP）等多步操作,获得RSV微型复制子重组质粒px8δT/GSGE1/EGFP和px8δT/GSGE2/EGFP。同时构建可表达大蛋白（large protein,L）的质粒pcDNA3.1/L及表达转录延长/转录终止抑制因子（M2 ORF 1 protein,M2-1）的质粒pcDNA3.1/M2-1。通过脂质体法共转染RSV微型复制子质粒及四种RSV核壳体蛋白质粒至可表达T7 RNP的BSRT7/5细胞系,倒置荧光显微镜及流式细胞仪分析EGFP的表达情况。【结果】成功构建了px8δT/GSGE1/EGFP和px8δT/GSGE2/EGFP及pcDNA3.1/L和pcDNA3.1/M2-1,五质粒共转染BSRT7/5细胞,倒置荧光显微镜及流式细胞仪均观察到绿色荧光的表达。【结论】构建的RSV微型复制子具有转录和复制功能,将有助于进一步开展以RSV反向遗传操作为基础的RSV疫苗研究。     

绿色荧光蛋白分裂肽基因重组乙型肝炎病毒复制子模型的建立

为构建一种重组乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制子模型,使其能够在病毒感染的细胞中表达可视化报告基因蛋白,本研究删除HBV基因组核心蛋白(HBV core,HBc)编码区部分序列,构建HBV1.1-ΔHBc113复制子载体.利用内含肽(intein)介导蛋白拼接的特性,选取加强绿色荧光蛋白(...     

CMV与T7启动子对仙台病毒微小基因组拯救效率的比较

构建一种以分泌型荧光素酶基因(Gluc)作为报告基因的仙台病毒BB1株微小基因组质粒,比较了CMV启动子与T7启动子对仙台病毒微小基因组的拯救效率。首先设计并合成锤头状核酶序列,仙台病毒trailer、L基因非编码区、N基因非编码区和leader序列以及丁型肝炎病毒核酶序列,插入含有CMV和T7双启动子的质粒pVAX1中,获得仙台微小基因组的通用型载体pVAX-miniSeV。将Gluc基因插入pVAX-miniSeV中,分别获得正向插入的仙台病毒微小基因组载体pVAX-miniSeV-Gluc(+)和反向插入的pVAX-miniSeV-Gluc(-)。用pVAX-miniSeV-Gluc(+)转染BHK21细胞能在上清中检测到高水平的Gluc活性,表明其中的CMV启动子具有正常转录功能。将pVAX-miniSeVGluc(-)和仙台病毒N、P、L蛋白表达质粒共转染BSR T7/5细胞(稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞)检测到Gluc的高效表达,表明pVAX-miniSeV-Gluc(-)能够被有效拯救;但在BHK-21细胞中却未检测到Gluc的有效表达,提示该载体中的CMV启动子对仙台病毒微小基因组的拯救效率可能没有明显作用。为了进一步了解CMV与T7启动子各自对于仙台病毒微小基因组拯救的作用,本研究又构建了单独含有CMV或T7启动子的仙台病毒微小基因组载体pCMV-miniSeV-Gluc(-)和pT7-miniSeV-Gluc(-)。将这两种载体和仙台病毒N、P、L蛋白表达质粒分别共转染BSR T7/5细胞,结果pT7-miniSeV-Gluc(-)共转染组检测到了Gluc的高效表达,而pCMV-miniSeV-Gluc(-)共转染组未检测到,证实了通用型载体pVAX-miniSeV中仅T7启动子对仙台病毒微小基因组的拯救起了关键作用,而CMV启动子作用不明显。本研究成功构建了一种通用型双启动子仙台病毒微小基因组载体pVAX-miniSeV,并证明了T7启动子系统对仙台病毒微小基因组拯救的关键作用。本研究为下一步构建仙台病毒全基因感染性克隆打下了基础。     

一种基于塞姆利基森林病毒复制子的新型复制子载体

RNA复制子是能自主复制的病毒RNA。基于RNA复制子的表达载体和基因疫苗比常规真核表达载体和DNA疫苗具有更大的优越性。以塞姆利基森林病毒RNA复制子衍生的真核表达载体pSFV1为骨架 ,插入CMV立即早期启动子和SV40晚期Poly(A)信号 ,构建了一种完全基于DNA的复制型表达载体pSFV1CS ,将增强型绿色荧光蛋白基因EGFP插入其中 ,构建了重组质粒pSFV1CS EGFP ,通过转染 2 93T细胞 ,证实外源基因能在其中高效表达。该载体可用于表达真核蛋白和构建复制子载体疫苗。     

日本脑炎病毒(JEV)复制子表达载体的构建及其鉴定

在以往构建的JEV疫苗株SA14-14-2感染性克隆pBRkpn-JTF的基础上,构建了去除JEV结构区域基因(prM基因和E基因),保留非结构区域基因的复制子表达载体pCTCJEV、pCTMJEV,转染BHK-21细胞后,通过反转录PCR(RT-PCR)和间接免疫荧光实验(IFA)检测该载体的自主复制能力和蛋白表达情况,结果证实该载体在BHK-21细胞中能够自主复制并且表达非结构蛋白。进一步在该载体中插入报告基因EGFP,检测外源蛋白的表达情况,结果显示在转染复制子载体的24h后,荧光显微镜下能够看见绿色荧光蛋白的表达,阳性信号持续增强,能够维持10d左右,证实了构建的复制子载体pCTCJEV能够有效地表达外源蛋白,这为进一步建立以乙脑病毒复制子为基础的疫苗载体系统打下基础。     

XJ-160病毒复制子型表达载体的构建

XJ-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,全基因组测序已经完成.本文利用该病毒全基因序列首先构建了全基因组cDNA克隆质粒,在此基础上,利用基因重组技术将病毒结构基因序列替换为含有多个单酶切位点的序列,得到复制子表达载体质粒pRepxj160.为验证载体的功能,将报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)分别插入到载体的多克隆位点,得到两个表达质粒;经体外转录获得的转录体RNA转染BHK-21细胞后14h,可检测到报告基因的表达.结果表明我们构建的XJ-160病毒复制子型表达载体具有自主复制功能,可以表达异源基因.本研究为进一步开发具有我国自主知识产权的甲病毒载体奠定了基础.     

汉滩病毒微基因组的构建与评价

目的建立汉滩病毒(Hantaan virus, HTNV)微基因组系统,并进行初步评价。方法用分子克隆方法构建HTNV微基因组系统所需的微基因组质粒和表达核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, NP)、RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)的辅助质粒,转染HEK-293T细胞;并在辅助病毒添加与否的情况下进行验证。结果成功构建了基于HTNV L片段非编码区的绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)和Gaussia荧光素酶(gaussia luciferase, Gluc)的微基因组质粒,GFP微基因组在辅助病毒HTNV感染的情况下可观察到明显绿色荧光,Gluc微基因组在辅助病毒感染或者辅助质粒共转染情况下均可检测到Gluc的表达。结论成功建立了HTNV的微基因组系统,为研究HTNV的复制机理和抗病毒药物的筛选提供了重要工具。     

可用于辅助蛋白功能研究的人呼吸道合胞病毒双顺反子微型基因组的构建及拯救

【目的】构建可表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因的人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)双顺反子微型基因组cDNA克隆及重组质粒,并进行拯救,以探讨并验证RSV的聚合酶蛋白或辅助蛋白在RSV反向遗传学操作中的作用。【方法】利用全基因合成和分子生物学相结合的方法,在获得可分别表达EGFP和无生物活性蛋白的单顺反子微型基因组质粒pUC57-RSV-EGFP和pUC57-RSV-ORF1的基础上,进一步克隆至pBR322B载体,获得编码EGFP及无生物活性蛋白的双顺反子微型基因组质粒,经限制性内切酶和核酸序列分析正确后,与可表达4种辅助蛋白的辅助质粒共转染至BHK-T7细胞,通过荧光显微镜观察EGFP的表达以及RT-qPCR对EGFP mRNA的转录水平进行定量分析。【结果】成功构建了编码EGFP和无生物活性蛋白的RSV双顺反子微型基因组质粒pBR322B-RSVⅡ-EGFP,经与编码4种辅助蛋白的辅助质粒共转染至BHK-T7细胞,发现4种辅助蛋白对EGFP的表达具有不同的功能活性。【结论】以可表达EGFP报告基因的RSV双顺反子微型基因组重组质粒,实现了对4种辅助蛋白的功能验证,其中M2-1蛋白在双顺反子微型基因组拯救过程中具有转录延长的生物学活性。     

双报告基因真核表达载体的构建及其功能鉴定

目的:构建绿色荧光蛋白和海肾荧光素酶共同高效表达的双报告基因真核表达载体。方法:将增强型绿色荧光蛋白基因和海肾荧光素酶基因以昆虫病毒T2A序列相连接而后克隆进入pcDNA3.1(-)质粒,构建双报告基因真核表达载体。将该载体转染至COS-7细胞,通过荧光显微镜观察、照度计定量分析检测绿色荧光蛋白和海肾荧光素酶生物活性,Western Bolt检测T2A序列自剪切效率。结果:双报告基因真核表达载体能够同时表达非融合的绿色荧光蛋白和海肾荧光素酶,与单独表达载体产物具有相似的生物活性和表达效率。结论:双报告基因真核表达载体建立成功,为基因表达调控等相关领域研究提供辅助工具。     

T7 RNA聚合酶表达系统的真核化及其偶联表达系统的建立

为了使T7RNA聚合酶(T7RNAP)表达系统真核化,首先,利用两种方法建立能够表达T7RNAP的真核细胞:(1)共转染表达T7RNAP的真核表达重组质粒于靶细胞;(2)利用稳定表达T7RNAP的BHK-21细胞系。然后,将FMDV内部核糖体进入位点(IRES)序列和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因定向克隆进原核载体pET-40a-c( )的T7启动子下游,得到的重组质粒pIERS-EGFP-E。用该质粒分别转染上述两种细胞,在紫外显微镜下都能够观察到绿色荧光,表明真核化的T7RNAP偶联表达系统建立。并利用流式细胞仪对偶联表达水平进行了分析。这为利用该系统真核高效表达外源蛋白奠定了坚实的基础。用实验证明了FMDV5′端含有IERS具有介导非帽依赖性的翻译的功能,为以IERS为基础的双顺反子表达系统的建立及深入研究IERS与相关蛋白的功能奠定了基础。T7RNAP偶联表达体系是一种良好的外源基因表达体系。     

可诱导型CRISPRi系统的构建及其初步应用

[目的]构建可诱导型CRISPRi系统以特异性地抑制靶基因的表达。[方法]采用PCR技术将人ZNF10基因的KRAB结构域编码序列分别克隆至d Cas9蛋白编码基因的5’端(KRAB-d Cas9)与3’端(d Cas9-KRAB)。设计并构建靶向荧光素酶报告基因起始密码子附近序列的4种gRNA表达载体,其表达受到含有Tet O调控元件的H1启动子调控。分析共表达d Cas9蛋白和gRNA对共转染的荧光素酶报告基因表达水平的影响。在此基础上,设计并构建靶向人KLHL21基因转录起始位点附近区域的3种gRNA表达载体,将其与KRAB-d Cas9融合表达载体分别共转染HEK293T细胞,24h后收集细胞并采用荧光实时定量PCR与蛋白质印迹技术分析KLHL21基因表达水平的变化。[结果]CRISPRi系统有效地抑制HEK293T细胞中荧光素酶报告基因与内源性的KLHL21基因的表达。共表达TetR抑制蛋白可阻断CRISPRi对荧光素酶报告基因表达的抑制作用,在细胞培养基中加入1μg/ml盐酸四环素可解除这种抑制作用。[结论]成功构建了可诱导型CRISPRi系统,可有效抑制真核细胞基因的表达。     

表达绿色荧光蛋白的重组鸡传染性支气管炎病毒的构建

为探讨鸡传染性支气管炎病毒(IBV)作为载体表达外源基因的可行性,本研究根据IBV H120疫苗株的全基因组序列设计引物,采用RT-PCR方法分10个片段对其基因组进行扩增,并克隆至pMD19-T载体中;同时构建IBV基因组5a基因编码区被增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因替换的重组质粒。采用体外拼接策略,将BsaI酶切处理的10个基因片段顺序连接,构建5a基因编码区被EGFP基因替换的基因组全长cDNA,其5’端具有完整的T7 RNA聚合酶启动子核心序列,3’端具有polyA尾巴结构。然后通过T7 RNA聚合酶体外转录系统合成病毒基因组RNA,脂质体转染BHK-21细胞进行病毒拯救。结果表明成功的从基因组全长cDNA拯救出重组病毒H120-5a/EGFP株,其在鸡胚中能有效的复制和传代,并表达绿色荧光蛋白;5a基因的缺失并不影响病毒对鸡胚的致病性。本研究为进一步开展IBV的分子致病机理、载体疫苗等研究奠定了基础。     

小鼠T-bet启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性鉴定

为了研究T-bet在T细胞中的转录调控机制,并研究其在多发性硬化症中的信号通路,本研究构建小鼠TBX21(编码T-bet)基因启动子区和增强子区萤火虫荧光素酶报告基因载体。在对小鼠TBX21基因5?侧翼区进行详尽生物信息学特征分析后,设计相应引物,用PCR的方法从小鼠基因组中扩增出TBX21基因5?侧翼区–1 000 bp-28 bp片段长为1 028 bp的启动子区(以翻译起始点ATG为+1)和–3 308 bp-–2 000 bp片段长为1308 bp的非编码区保守序列(No-coding conserved sequence,CNS),再用定向克隆的方法将这两个片段定向重组入专门用于启动子活性研究的萤火虫荧光素酶报告基因载体(p GL4.10)中,构建出包含小鼠TBX21基因启动子区和CNS区的萤火虫荧光素酶报告基因载体(p GL4.10-TBX21pr-CNS),电泳与测序鉴定,最后再将p GL4.10-TBX21pr-CNS与内参p RL-TK用lipofectamine 2000共转染293T细胞和Jurkat细胞中,通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定p GL4.10-TBX21pr-CNS的启动子和增强子活性,并用独立样本t检验方法进行统计分析。对照组共转染p GL4.10与内参p RL-TK。结果表明,成功构建出荧光素酶报告基因重组质粒p GL4.10-TBX21pr-CNS。与转染空质粒p RL-TK组相比,293T细胞(P=0.012 2)和Jurkat细胞(P=0.002 2)中转染p GL4.10-TBX21pr-CNS组荧光素酶活性升高。研究结果表明在293T细胞和Jurkat细胞中p GL4.10-TBX21pr-CNS可以表现出启动子活性,为后续小鼠T-bet转录调控研究提供了基本材料。