抗Ⅰ型马立克氏病毒sorf2蛋白的多克隆抗体制备及其特异性鉴定

[目的]制备高效价鼠和兔抗Ⅰ型马立克氏病毒(Marek's disease virus,MDV) sorf2蛋白的多克隆抗体并对其特异性进行鉴定.[方法]以Ⅰ型MDV GX0101为模板,利用PCR扩增sorf2基因,分别克隆进原核表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21 (Rosetta),经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导后进行融合蛋白的表达和纯化.用纯化的融合目的蛋白常规免疫6-8周龄Balb/c小鼠和成年新西兰大白兔,制备抗sorf2蛋白的多克隆抗体.用Western blot和间接免疫荧光试验鉴定多克隆抗体的特异性.[结果]Ⅰ型MDV的sorf2基因在原核表达载体中能够正确表达,免疫小鼠和兔后能获得与sorf2蛋白发生特异性反应的高效价的多克隆抗体.[结论]制备的抗sorf2蛋白的多克隆抗体能够特异的鉴定MDV sorf2基因缺失株,有效的区分MDV疫苗株HVT(FC-126)与Ⅰ型MDV毒株,用于临床MDV野毒的分离鉴定.     

鸭瘟病毒UL35基因克隆、原核表达及在病毒感染宿主中的亚细胞定位

根据本实验室获得的鸭瘟病毒(DPV)UL35基因序列(GenBank登录号:EF643558),利用Oligo6.0和Prim-er5.0软件设计一对引物,PCR扩增出DPV CHv强毒株UL35基因,随后将其克隆至pMD18-T构建克隆质粒pMD18-T-UL35,经PCR和酶切鉴定后亚克隆至大肠杆菌原核表达载体pET-32a(+),获得表达质粒pET-32a(+)-UL35后将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),经1.0mmol/L的IPTG在34℃诱导5h获得最佳表达。SDS-PAGE分析表明UL35基因表达的重组蛋白(VP26)分子量约为33kD,薄层扫描分析结果显示VP26占菌体总蛋白的32.3%,主要以包涵体的形式存在。经Ni+-NTA琼脂糖凝胶亲和层析纯化后免疫家兔制备抗VP26重组蛋白血清,血清琼脂扩散试验抗体滴度检测结果达1:32。用High-Q阴离子交换层析纯化抗血清获得兔抗VP26重组蛋白IgG,经Western blot检测显示抗血清可与VP26发生特异性反应。通过免疫荧光技术进行DPVVP26亚细胞定位检测,结果表明DPV感染DEF后2～8h细胞核内荧光的量相对较少,12～36h逐渐增加,48～72h达到最多,并且在细胞核内的斑点区域聚集呈颗粒状分布;而在细胞质内12h才开始出现少量荧光,荧光量在DPV感染后24～48h期间随感染时间延长而增加,在感染后72h最多。以上结果为阐明和进一步开展DPVUL35基因的功能研究提供了重要数据和材料。     

马立克氏病病毒Md11株pp24基因的原核表达

通过PCR方法扩增MDVMd11株pp24基因的完整ORF,按正确的阅读框架将其克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中,重组质粒转化BL21宿主菌后,经IPTG诱导表达。诱导菌体裂解物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后,用山羊抗GST抗体进行Western-blotting试验,结果确证了GST-pp24融合蛋白的表达。将表达产物从凝胶中回收,免疫4周龄小白鼠,3次免疫后,采血分离血清。所得抗GST-pp24多克隆抗血清分别与GA株、Md11株和CVI988株MDV感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)进行间接免疫荧光试验(IFAA),结果表明大肠杆菌表达的pp24融合蛋白至少保留了部分天然pp24蛋白的抗原性。     

表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组马立克氏病毒的构建

用聚合酶链式反应(PCR)方法从真核表达载体pcDNA3.1-VP2中扩增出包含CMV和polyA的VP2表达盒基因片段,经琼脂糖凝胶电泳大小为2.4kb;将该基因片段插入马立克氏病病毒(MDV)CVI988//Rispens的非必需区US10片段中,经SphI酶切分析获得大小为6.0和2.4kb两个片段,表明成功构建出表达VP2基因的MDV CVI988转移载体pUC18-US10-VP2质粒.将质粒与CVI988/Rispens疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过免疫荧光方法筛选,结果获得了表达VP2基因的重组MDV(rMDV-VP2).用IBDV特异性单克隆抗体进行间接免疫荧光试验(IFA)证实,rMDV-VP2病毒传至第8代仍能稳定表达VP2蛋白,这为进一步研究其免疫学特性奠定了基础.     

马立克氏病病毒Md11株pp24基因的原核表达

通过PCR方法扩增MDV Md11株pp24基因的完整ORF,按正确的阅读框架将其克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中,重组质粒转化BL21宿主菌后,经IPTG诱导表达.诱导菌体裂解物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后,用山羊抗GST抗体进行Western-blotting试验,结果确证了GST-pp24融合蛋白的表达.将表达产物从凝胶中回收,免疫4周龄小白鼠,3次免疫后,采血分离血清.所得抗GST-pp24多克隆抗血清分别与GA株、Md11株和CVI988株MDV感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)进行间接免疫荧光试验(IFA),结果表明大肠杆菌表达的pp24融合蛋白至少保留了部分天然pp24蛋白的抗原性.     

马疱疹病毒1型囊膜蛋白gD多克隆抗体制备及亚细胞定位

本研究通过间接免疫荧光技术,确定了EHV-1囊膜蛋白gD单独表达于BHK-21细胞内的亚细胞定位情况,为其亚细胞定位机制及病毒二级囊膜的研究奠定了基础。以EHV-1基因组为模板,利用PCR方法扩增gD部分基因,并构建其原核表达载体pET28-gD,转入BL21(DE3)感受态细胞内进行诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析法纯化gD重组蛋白;以纯化的重组蛋白为抗原免疫实验小鼠并制备抗囊膜蛋白gD的多克隆抗体;分别以间接ELISA方法及Western blot方法检测抗体效价及反应性;人工转染pVAX-Kozak-gD重组质粒至BHK-21细胞,利用IF技术对囊膜蛋白gD进行亚细胞定位。结果表明:成功表达了大小约29kD的gD重组蛋白;制备的多克隆抗体效价为1∶102 400,能较好地与囊膜蛋白gD真核表达产物特异性结合;通过IF方法确定囊膜蛋白gD大部分呈斑点状分布于宿主细胞核周围的胞质中,极少量定位于细胞核内。     

表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组马立克氏病毒的构建

用聚合酶链式反应(PCR)方法从真核表达载体pcDNA3.1-VP2中扩增出包含CMV和polyA的VP2表达盒基因片段,经琼脂糖凝胶电泳大小为2.4kb;将该基因片段插入马立克氏病病毒(MDV)CVI988//Rispens的非必需区US10片段中,经SphI酶切分析获得大小为6.0和2.4kb两个片段,表明成功构建出表达VP2基因的MDVCVI988转移载体pUC18-US10-VP2质粒。将质粒与CVI988/Rispens疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过免疫荧光方法筛选,结果获得了表达VP2基因的重组MDV(rMDV-VP2)。用IBDV特异性单克隆抗体进行间接免疫荧光试验(IFA)证实,rMDV-VP2病毒传至第8代仍能稳定表达VP2蛋白,这为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。     

鸡马立克氏病病毒糖蛋白gB基因的表达及基因免疫

将马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)gB基因插入真核表达载体pcDNA3中,经酶切和PCR鉴定为正向插入了gB基因的重组质粒,命名为pcDNA3-gB.体外转染COS-7细胞,经间接免疫荧光染色证实转染pcDNA3-gB后的COS-7细胞内有糖蛋白B的表达.用pcDNA3-gB对AA肉用雏鸡腿部肌肉注射,进行一免.间隔2周后,用pcDNA3-gB再加强免疫一次.之后2周攻毒,观察免疫保护效果.结果表明,MDV gB基因DNA免疫可以诱导鸡体产生免疫保护,免疫保护指数为72.2%.     

Ⅰ型马立克氏病病毒pp38和pp24基因的真核共表达

本研究将Ⅰ型超强毒MDV Md11株的pp38和pp24完整基因分别克隆到真核双表达载体pBudCE4.1中,在脂质体作用下将阳性克隆DNA转染CEF,通过间接免疫荧光试验(IFA)用单克隆抗体H19和鼠抗GST-pp24血清分别检测到了pp38和pp24基因的单独表达.然后将MDV Md11株的pp38和pp24完整基因同时克隆到载体pBudCE4.1中,在脂质体作用下将阳性克隆DNA转染CEF,通过IFA检测和用抗pp24多克隆血清进行Western-blotting试验检测到了PP38和PP24磷蛋白的共表达.     

Ⅰ型马立克氏病病毒pp38和pp24基因的真核共表达

本研究将Ⅰ型超强毒MDVMd11株的pp38和pp24完整基因分别克隆到真核双表达载体pBudCE4.1中,在脂质体作用下将阳性克隆DNA转染CEF,通过间接免疫荧光试验(IFA)用单克隆抗体H19和鼠抗GST-pp24血清分别检测到了pp38和pp24基因的单独表达。然后将MDVMd11株的pp38和pp24完整基因同时克隆到载体pBudCE4.1中,在脂质体作用下将阳性克隆DNA转染CEF,通过IFA检测和用抗pp24多克隆血清进行West-ern-blotting试验检测到了PP38和PP24磷蛋白的共表达。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建马立克病病毒超强毒株原癌基因meq缺失株及其鉴定

近年来,CRISPR/Cas9基因编辑技术正迅速应用于大基因组DNA病毒的编辑,尤其是一些致瘤性疱疹病毒。马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)属于甲亚科疱疹病毒,血清I型MDV(MDV-1)感染自然宿主可诱导快速发作的T细胞淋巴瘤。meq基因是MDV-1致瘤的主要原癌基因,在马立克病(Marek’s disease,MD)肿瘤发生中具有重要作用。本文以超强毒MDV(very virulent MDV,vvMDV)国际代表株Md5和我国分离株GX0101为研究对象,设计合成了多组meq基因特异性gRNA,利用CRISPR/Cas9系统成功构建了两个meq基因缺失的毒株Md5△meq-C45和GX0101△meq-C56,并对病毒基因组相关区域进行PCR扩增和测序。结果证实,meq基因被完全编辑并敲除。间接免疫荧光实验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)显示,MEQ蛋白在两个meq基因编辑毒株感染的CEF细胞中均无表达,并且meq基因缺失经连续15次传代仍保持稳定。通过荧光定量PCR(quantitative PCR,...     

羊口疮024基因的表达、多抗制备及亚细胞定位

目的 克隆表达羊口疮病毒（Orf virus,ORFV）024基因,制备多克隆抗体,检测其免疫原性,并对其进行亚细胞定位分析。方法 根据GenBank中羊口疮病毒024基因序列设计引物,进行PCR扩增。将其亚克隆至表达载体,构建原核重组质粒pGEX-6P-1-024以及真核重组质粒pEGFP-N1-024。将原核重组质粒转化Rosetta(DE3)细胞,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定024蛋白的表达情况。纯化后的024蛋白免疫BALB/c雌鼠,获得血清并制备多克隆抗体,进行Western-blot分析。将构建的真核质粒转染MDBK细胞,24 h后通过免疫荧光观察其在细胞中的表达及亚细胞定位。结果 SDS-PAGE结果表明,羊口疮病毒024基因在Rosetta(DE3)细胞中正确表达,大小为59 kDa。Western-blot结果表明024蛋白能与制备的多抗发生特异性反应,具有良好的反应原性。荧光显微镜下结果表明024蛋白转染MDBK细胞后主要在细胞质中表达。结论 本实验为后续深入研究ORFV 024基因功能和致病机制奠定了基础。     

Ⅰ型马立克氏病病毒不同致病型参考株与中国分离株pp24基因的克隆与序列分析

为了比较Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV)的致病型与pp24基因的关系,将Ⅰ型MDV弱毒(mMDV)、强毒(vMDV)、超强毒(vvMDV)、特超强毒(vv MDV)等不同致病型的CVI988、GA、648A、RB1B、Md5和Md11等6个国际参考株,从中国河北、北京、广东和广西等地分离的7个中国分离株和1个中国疫苗毒814株的pp24基因分别做PCR扩增,并将其克隆到pMD-18载体中测序,与国外已发表的BC-1株进行序列比较.结果表明:Ⅰ型MDV的pp24基因非常保守,15个毒株中只出现5个碱基的随机变化,并引起相应的4个氨基酸改变,但与致病型无明显相关;pp24基因ORF的第81碱基出现差异,所有中国株为G,所有不同致病型国外参考株为C,但并未引起氨基酸改变,显示这一碱基差异只是作为MDV地域性分布的遗传标志,而与病毒分离的年代及致病型等因素无关.     

特超强毒型马立克病病毒囊膜糖蛋白Ⅰ基因序列及与其它致病型毒 …

特超强毒型６４８Ａ株马立克病病毒（ＭＤＶ）的囊膜糖蛋白Ｉ（ｇＩ）基因经ＰＣＲ扩增后克 进ｐＵＣ１８质粒载体,并对其ＯＲＦ完成了ＤＮＡ测序。与已发表的其它室致病型毒株的糖蛋白Ｉ的ＤＮＡ和氨基酸序列比较表明,６４８Ａ株的ｇＩ基因序列与超强毒ＲＢＩＢ株已发表的ＯＲＦ５’端７６１个碱基完全相同。查是在该基因中完整ＯＲＦ的１０６８个碱基中,６４８Ａ与强毒ＧＡ株间有８个碱基变异并导致７个氨基酸的变化,且这一变     

由反转录病毒载体转移的马立克病毒糖蛋白D基因在感染细胞中的表达

用ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ将已分离和克隆的马立克氏病病毒糖蛋白Ｄ基因从重组ｐＭｇＤ１８质粒中切出,克隆进反转录病毒质粒载体（ＲＣＡＳ）的连接质粒载全ＰＵＣＣｌａ１１２Ｎ的相同位点。用ＣｌａＩ再次ｇＤ基因切出,构建于ＲＣＡＳ的ＣｌａＩ位点。通过原位杂交筛选重组ＲＣＡＳ,并结合酶切分析鉴定出ｇＤ插入方向正确的重组ＲＣＡＳ。用磷酸钙沉淀法将ｇＤ重组ＲＣＡＳ转染鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）,转染后第９天收集细胞上     

马立克氏病病毒gB部分基因的原核表达

利用PCR技术扩增获得马立克氏病病毒(MDV)囊膜糖蛋白B(gB)基因部分片段,将其克隆入pET-28a载体中,获得表达载体pET-gB,将该载体转化宿主菌BL21,经1.0mmol/LIPTG诱导,外源基因以包涵体的形式获得高效表达。将包涵体溶解于8mol/L的尿素中,利用His·Bind试剂盒获得纯化的蛋白,将纯化的蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,间接ELISA法测得抗体的效价为1×10-5。此外,通过Western blot实验表明,该抗体具有较高的特异性,为进一步探讨MDVgB所引起的特异的免疫反应奠定基础。     

马立克氏病病毒pp38／pp24聚合体结构及其对pp38基因上游双向启动子活性的影响

前期以氯霉素乙酰转移酶（CAT）活性为指标的研究证明了,马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）的pp38和pp24的同时表达可显著增强基因组中pp38基因与1．8kb mRNA转录子之间双向启动子的转录活性．本研究又以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达水平作为pp38基因上游双向启动转录活性的标志,更直观地证明了只有当同一细胞内同时表达pp38和pp24时,该启动子活性才有完整的启动活性．为了证明这两个蛋白能否相结合,分别以单独表达pp38或pp24的重组质粒pcDNA-pp38或pcDNA-pp24及能同时表达这两个基因的重组质粒pBud-pp38-pp24质粒转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,用pp38特异的单克隆抗体H19对转染细胞的裂解标记物进行免疫沉淀实验．结果表明,H19可沉淀pp38,但pp24只是在pp38同时存在时才被H19沉淀,而在pcDNA-pp24单独转染的处理样品中不能显示pp24的条带．这证明了,pp24是通过与pp38的结合而被共沉淀下来的,显示pp24和pp38在天然状态下可以形成异二聚体或多聚体．上述两个独立的实验结果表明,pp38和pp24是以聚合体的形式结合于该双向启动子发挥作用的．     

表达禽流感病毒M2基因的重组马立克氏病病毒的构建

将禽流感病毒M2基因克隆于真核表达质粒pIRES-EGFP中,使其位于pCMV启动子的调控下,并与绿色荧光蛋白基因（EGFP）串联后,将上述串联基因插入到含MDV CVI988的非必需区US基因的重组质粒pUS2中,构建带标记的重组质粒,然后将此重组质粒转染感染了MDV CVI988的鸡胚成纤维细胞,利用同源重组的方法,筛选了表达禽流感病毒M2基因的重组病毒MDV1。经PCR、Dot-blotting,Western-blotting等实验的结果表明,禽流感病毒M2基因的确插入到MDV1（CVI988）基因组中并获得表达。重组MDV1免疫1日龄SPF鸡21天后,用ELISA可检测到M2蛋白的特异性抗体。接种了重组病毒rMDV的鸡体内针对H9N2疫苗血凝素的抗体滴度(p<0.05)明显提高,以禽流感病毒AIV A/Chicken/Guangdong/00（H9N2）攻毒后进行病毒重分离试验的结果发现,重组病毒能有效地降低病毒的排出量(p<0.01),说明该重组病毒可以用于防制禽流感的免疫。     

马立克病毒基因缺失疫苗与商品化疫苗的分子鉴别方法

为了对马立克病毒(MDV)meq基因缺失疫苗株SC9-1与商品化MD疫苗CVI988/Rispens株、814株和HVT FC-126株进行分子鉴别,本研究根据疫苗株SC9-1与其它MD疫苗株的基因组差异,分别针对I型MDVmeq基因以及SC9-1基因组中的禽网状内皮组织增殖症病毒-长末端重复序列(REV-LTR)插入片段,设计三对PCR扩增引物,同时合成针对meq基因和REV-LTR片段的地高辛标记探针,通过PCR扩增和斑点杂交方法区分SC9-1株与其他疫苗株。结果表明,使用针对meq基因的引物F1/R1进行PCR扩增,SC9-1株、CVI988/Rispens株、814株分别扩增出184bp、1 297bp、1 297bp目的片段,HVT FC-126株没有条带;使用针对meq基因的引物F2/R2进行PCR扩增,CVI988/Rispens株、814株均扩增出746bp目的片段,SC9-1株、HVT FC-126株均没有条带;使用针对REV-LTR片段设计的引物F3/R3进行PCR扩增,SC9-1株扩增出512bp目的片段,CVI988/Rispens株、814株、HVT FC-126株均没有条带。同时,使用针对meq基因的探针进行斑点杂交,CVI988/Rispens株、814株均显示阳性结果,SC9-1株、HVT FC-126株均为阴性;使用针对REV-LTR的探针进行斑点杂交,SC9-1株显示阳性结果,CVI988/Rispens株、814株、HVT FC-126株均为阴性。因此,利用本研究设计的特异性PCR引物以及探针,通过PCR扩增和斑点杂交方法可有效区分SC9-1与其他商品化MD疫苗。     

用杆状病毒为载体在昆虫细胞中表达马立克病病毒pp38基因

鸡马立克病病毒(MDV)38kd磷蛋白(pp38)基因中包括起始密码子和终止密码子的完整编码序列被整合进杆状病毒AcNPV的转移载体质粒pVL1392,用所得的含pp38基因的重组转移载体质粒pVLpp38I与野生型杆状病毒AcNPV的DNA共转染昆虫传代细胞系Sf9细胞后,用荧光抗体法以抗MDV单克隆抗体H_(19)筛选到能表达MDVpp38的重组杆状病毒克隆BP38 I。免疫印迹试验表明,在重组病毒BP38 I感染的Sf9细胞溶解物中,可表现一条分子量约为35—36kd的为单克隆抗体H_(19)识别的MDV特异性蛋白带。