环境水体中GⅡ型诺如病毒浓缩研究

自行设计一种适合野外现场采样的病毒采集浓缩仪,采用一种新型阳离子膜NanoCeram,进行环境水体中GⅡ型诺如病毒浓缩研究。通过预实验,考察了预处理膜、不同的二次浓缩方法、不同洗脱液对病毒回收率的影响,随后优化整个浓缩过程并确定最佳的病毒浓缩方法。结果显示,预处理膜对病毒回收影响较大,PEG-NaCl沉淀、硅藻土吸附这两种二次浓缩方法的效果相当,选择0.15mol/L Na2HPO4作为硅藻土洗脱液。确定了NanoCeram阳离子膜的病毒回收率为3.02%。最后对北京市丰台区洋桥生活污水进行现场采样,成功检测到GⅡ型诺如病毒,证明该方法有效可行,适合于环境水体中诺如病毒的浓缩分离和检测。     

水体病毒钙离子絮凝浓缩新方法研究

研究建立了一种从水体中浓缩病毒的新方法,即钙离子絮凝-柠檬酸缓冲液洗溶法,该方法的要点是先用一定量的钙离子溶液和钙离子絮凝剂絮凝水体中的病毒,再用pH5.0的0.3mol/L的柠檬酸缓冲液洗溶,然后再进一步超滤浓缩。此法可方便地将水体中的病毒浓缩10000倍以上。应用该法分别对人工播种于饮用水中的f2噬菌体和脊髓灰质炎疫苗病毒(PV1)进行了浓缩,结果发现f2噬菌体的平均回收率达96%,而PV1的回收率为100%,均显著高于阳电膜过滤法(P<0.05)。该方法快速、简便、有效。     

基于靶向结合的食源性诺如病毒富集与检测研究进展

诺如病毒(Noroviruses,NoVs)是全球急性胃肠炎的重要食源性病原。复杂基质的前处理技术一直是食品安全领域中病毒检测研究的重点和难点。除了絮凝沉淀、超速离心、超滤浓缩、电荷膜过滤等常用的非特异性富集技术外,基于分子互作的靶向病毒富集技术已成为了近年来的研究热点。常用的靶向结合种类包括抗原-抗体结合、病毒-受体结合、筛选特异性的核酸适配体、基于噬菌体表面展示技术筛选特异性的多肽、分子印迹等。因此,本文对近年来诺如病毒靶向富集技术的研究进展进行了综述,以期为完善食源性病毒快速检测技术提供参考。     

枸杞岛养殖贻贝中诺如病毒污染情况调查与分析

为了解养殖场内贻贝的诺如病毒（Norovirus,NoVs）污染情况和基因型分布特点,分别于2019年4月和9月在浙江省舟山市枸杞岛后头湾和龙泉村贻贝养殖场近岸和远岸区域进行贻贝样本采集及诺如病毒检测,共检测670只贻贝样本,诺如病毒阳性率约9.9%（66/670）。离人类活动区域较近的贻贝,诺如病毒阳性率占总阳性率的72.7%（48/66）,远岸的贻贝诺如病毒阳性率占总阳性率的27.3%（18/66）。共检测到6种诺如病毒基因型,分别为GI.3（36.4%）、GI.4（19.7%）、GII.12（18.2%）、GII.17（13.6%）、GII.3（10.6%）和GII.2（1.5%）。研究表明,枸杞岛养殖场中诺如病毒污染率较高,涉及基因型较多,人类活动对养殖场内贻贝中诺如病毒的富集量具有一定影响。     

2015年大连市急性胃肠炎病例中诺如病毒感染状况

摘要：目的 了解2015年大连市急性胃肠炎病例中诺如病毒的感染情况,及时掌握诺如病毒的流行趋势,提高防控能力。方法 对2015年大连市10家哨点医院采集的1 247份标本进行诺如病毒荧光定量RT-PCR检测。结果 诺如病毒核酸检测总阳性率为1.92%,其中GⅡ型 性率1.60%,GⅠ型阳性率0.32%。结论 大连市首次在急性胃肠炎病例中监测到GⅠ型诺如病毒,2015年大连市急性胃肠炎病例中诺如病毒感染以GⅡ型为主。     

毛蚶中肠道病毒检测方法的建立

本文建立了检测毛蚶中肠道病毒的方法。病毒在pH4.5时吸附于毛蚶组织,离心后用pH9.5甘氨酸盐水将病毒从毛蚶组织中洗脱出来,并用0.0005mol/L三氯化铝代替Johnson法中的Cat—Floc,达到去除细胞毒性物质的目的。经过再一次离心,利用牛肉浸膏在pH3.5—4.0时凝聚并吸附病毒的特性使洗脱液中的病毒得到浓缩。离心后沉淀溶解于0.1mol/L磷酸氢二钠溶液。用本法提取毛蚶中脊髓灰质炎病毒,当病毒含量为每克组织3.5×10~5至35PFU时,平均回收率为71.2％。     

发热伴血小板减少综合征病毒灭活病毒的纯化及免疫原性初步研究

为了解纯化后灭活发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV)的免疫原性,本研究通过超滤浓缩和分子筛层析相结合的方法对灭活的SFTSV进行纯化,采用Western blot和SDS-PAGE对灭活病毒的纯化样品进行分析和鉴定,采用双抗夹心ELISA方法对其中糖蛋白(Glycoprotein,GP)和核蛋白(Nucleoprotein,NP)的抗原含量进行检测。浓缩纯化的SFTSV灭活病毒,经电镜观察并通过BCA法测定其总蛋白浓度。然后,将纯化的灭活SFTSV按两种不同的免疫程序免疫新西兰兔,评价免疫原性和比较免疫效果。结果显示,SFTSV灭活并超滤浓缩后,分子筛层析可观察到两个洗脱峰,其中之一为灭活病毒颗粒,SDS-PAGE、Western blot和ELISA法分析均可检测到GP和NP抗原,而另一洗脱峰主要成分则为NP。浓缩后的纯化病毒纯度达90%以上,总蛋白浓度约为1.1mg/mL,且具有典型的布尼亚病毒电镜形态。纯化的SFTSV灭活病毒免疫实验动物后,可在血清中检出高滴度病毒特异性IgG和中和抗体,但抗体滴度受免疫程序的影响,0d、14d和28d天三针程序免疫动物的效果明显优于0d、7d和28d免疫程序组。本研究显示了灭活SFTSV培养液中除完整病毒颗粒外,还含有大量游离的NP,经分子筛层析纯化可获得高纯度灭活病毒,同时明确了纯化的SFTSV灭活病毒具有良好的免疫原性,可诱导产生高滴度中和抗体和病毒特异IgG抗体,可为灭活病毒疫苗的进一步研究提供重要的线索。     

水体病毒浓缩方法的建立和优化研究

采用氯化钙(CaC l2)、聚乙二醇(PEG,pH7.0)、聚乙二醇(PEG,pH11.5)、三氯化铝(A lC l3)沉淀、Am icon Utcra超滤离心装置和硝酸纤维素吸附膜6种浓缩方法,浓缩人工添加于水体的1型脊髓灰质炎疫苗病毒(PV1),并对浓缩实验条件进行选择和优化。结果表明,CaC l2和聚乙二醇(pH7.0)沉淀法适用于浓缩大容量水体中的病毒,而超滤离心管浓缩法适用于小容量水体,这3种浓缩方法的病毒回收率均达到100%。     

HAV病毒液的3种浓缩方法比较

目的:对HAV病毒液的3种常见浓缩方法进行分析比较,为HAV病毒研究及规模化疫苗生产提供参考。方法:使用MILLIPORE PELLICON超滤、PEG 6000沉淀、蔗糖-甘油垫三种方法对纯化HAV病毒液进行浓缩,用ELISA方法对浓缩液进行抗原滴度检测,计算不同浓缩方法的回收率。结果:HAV病毒液经过7次超滤循环浓缩,平均回收率为86%;PEG浓缩方法回收率平均72.5%;蔗糖-甘油离心浓缩方法平均回收率53.3%。结论:蔗糖/甘油超离心法,集纯化浓缩一体,适用于样品量较少,需要高浓度样品的试验;PEG浓缩得率适中,操作简单,应用范围较广;超滤膜浓缩在大规模疫苗生产或样品量较大时适用,但需控制样品浓度及浓缩倍数不能太高,以免样品损失。     

水标本中脊髓灰质炎病毒三种浓缩方法的比较及改进方法的建立

本文用三种浓缩方法对人工污染标本进行了病毒回收率的比较试验,三种方法结果基本相同(47—49％)。在被检脊髓灰质炎Ⅰ型病毒蒸馏水标本中加1％NaCl可提高滤膜法对水中病毒的回收率;在含脊髓灰质炎病毒的河水、污水标本中加1％NaCl及AlCl_3(河水为0.0005mol/L、污水为0.001mol/L),离心沉淀过程中,我们惊奇地发现病毒全在沉渣中,结果表明用该方法病毒回收率竟提高了一倍(92—99％)。     

诺如病毒在贝类中的富集特性与机制研究进展

诺如病毒是一种全球范围内重要的食源性病毒。贝类通过滤食作用可将诺如病毒富集在体内,成为诺如病毒感染传播的重要载体。研究表明,贝类对不同型别的诺如病毒富集能力不同,并呈现季节性、空间性差异,我们前期研究显示,贝类中存在不同类型的组织血型抗原,推测其与诺如病毒积累并呈现差异密切相关,但具体机理不明。本文综述了诺如病毒在贝类中的蓄积、分布、季节性差异及结合机制的研究新进展,以期为我国贝类中诺如病毒的控制、风险预警等研究提供参考。     

贝类中人源诺如病毒污染净化技术研究进展

人源诺如病毒是全球引起人急性胃肠炎的食源性病原体之一。牡蛎、贻贝等贝类消化腺组织中含有诺如病毒受体类似物,可从污染水体中富集高浓度病毒,因此,生食或食用加工不当的受污染贝类极易造成诺如病毒感染。污染贝类的净化处理技术已成为诺如病毒防控领域中的研究热点,例如消杀试剂、臭氧处理工艺、新型非热消杀技术以及最近报道的具有抗病毒作用的益生菌等。诺如病毒活性检测对确定贝类中的病毒污染水平和评价消杀技术效果有重要作用,只有完整和具有感染力的病毒才会对人体健康造成威胁。因此,本文在前期工作基础上,进一步对诺如病毒活性鉴定方法、贝类产品消杀技术以及贝类养殖净化工艺等研究进展进行综述,以期为完善食源性病毒防控技术提供参考。     

诺如病毒常见流行株胶体金免疫层析快速检测方法

【背景】诺如病毒是全球引发急性胃肠炎的最主要病原之一,具有丰富的遗传多样性。【目的】建立一种简便快捷、适用于诺如病毒常见流行株的胶体金免疫层析检测方法。【方法】将抗诺如病毒衣壳蛋白的单克隆抗体1B10作为金标抗体、抗诺如病毒衣壳蛋白的单克隆抗体1D6作为检测线、羊抗鼠抗体作为质控线组装成胶体金试纸条。对试纸条的组装条件进行优化,确定最佳标记pH、金标抗体最佳浓缩比例及检测线(test line,T线)、质控线(control line,C线)最佳划线浓度等。对新方法进行性能评价,包括灵敏性试验、特异性试验、保存期试验及符合率实验等。【结果】所建立的诺如病毒胶体金试纸条检测方法最低检测浓度为5.9×105copies/μL。本方法与常见的腹泻病毒,如轮状病毒、星状病毒、腺病毒、肠道病毒均无交叉反应。批次间与批次内重复较好,保存期试验表明试纸条至少可以室温密封干燥保存一年时间。应用所建立的胶体金检测方法对24份临床粪便样本进行检测,检测结果与实时荧光RT-PCR方法的阳性符合率约为83%(15/18),常见流行株GII.2型、GII.4型、GII.17型均被成功检出。【结论】建立的胶体金试纸条检测方法具有较好的特异性与稳定性,可用于诺如病毒常见流行株检测及大规模流行病学调查。     

钦州市售贝类GⅡ型诺如病毒污染调查

文章对钦州市售的16种贝类进行GⅡ型诺如病毒污染调查，在采集的342份贝类样品中，共检出阳性样品55份，平均检出率为16.08%。其中牡蛎的阳性率最高，检出率为33.33%；在阳性样品中，病毒平均感染强度为1.66×10⁵copies/g(消化腺)，病毒含量主要集中在104～105copies/g数量级之间，占比为45.45%。研究显示钦州市售贝类中存在较高的诺如病毒污染水平，需要加强对市售贝类诺如病毒污染的持续监测与风险评估，保障消费者的食品安全。     

病毒灭活和SD血浆的制备

建立制备病毒灭活SD血浆的方法。血浆内加入 1%TNBP/ 1%TritonX10 0 ,30℃保温 4h后用反相层析和超滤去除血浆中的TNBP和TritonX10 0。在 30℃保温 15min后血浆内脂包膜病毒全部被杀灭。超滤后的血浆内TNBP和TritonX10 0的含量都低于 5mg/L。SD血浆蛋白含量的改变都在准许的范围内。建立了一种病毒灭活血浆的制备方法。     

2010年深圳地区诺如病毒的基因分型

了解2010年深圳地区诺如病毒的基因型别及分子流行病学特点。 用诺如病毒特异性引物（GI-SKF/GI-SKR、COG2F/G2-SKR）,通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法进行诺如病毒核酸扩增,阳性产物回收纯化并测序,用Clustal W和MEGA4.0生物软件对诺如病毒序列进行序列比对和系统进化分析。 85份阳性标本中有79株诺如GⅡ型和6株诺如GⅠ型,其中55株为GⅡ/4(2006b)型,16株为GⅡ/4(2008variant)型,2株为GⅡ/1型,4株为GⅡ/5型,2株为GⅡ/11型,1株为GI/4型,2株为GI/5型,3株为GI/6型。 2010年深圳地区诺如病毒的主要型别是GI和GⅡ,并且以GⅡ/4型为主,流行优势株为GⅡ/4（2006b）。     

利用聚乙二醇(PEG8000)纯化小球藻病毒FJ-1

为了提取小球藻病毒基因组DNA,探索利用3%～10%的PEG8000加3%～7%的NaCl沉淀病毒。其中以7%的PEG和4%的NaCl沉淀效果最好,但其沉淀效率较低。     

离子交换层析纯化透明质酸

考察6种离子交换树脂的静态吸附解析效果,选出201＊7阴离子交换树脂填柱,确定洗脱流速为0.6mL/min,40mL0.3mol/LNaCl和50mL0.5mol/L NaCl双浓度洗脱,实现透明质酸和杂蛋白的分离。制得透明质酸产品蛋白含量为0.057%,葡萄糖醛酸含量为43%,平均相对分子质量大于1.1×10^6,收率为54%,符合医用级透明质酸行业标准的要求。     

水源性诺如病毒

诺如病毒是导致人类病毒性急性腹泻的主要病原,常常造成严重的公共卫生与食品安全事件,而水体是诺如病毒传播的重要载体。对水源性诺如病毒的环境抗性、浓缩和检测方法、流行病学以及目前对于水体中诺如病毒检测存在的突出问题和未来的发展方向进行了综述和展望。     

湖州市非细菌性急性胃肠炎暴发中诺如病毒的分子生物学特点初步研究

本文初步研究了湖州市非细菌性急性胃肠炎暴发中检出的诺如病毒的分子生物学特征。收集湖州市2008年和2009年2起非细菌性急性胃肠炎暴发疫情中采集的患者粪便标本,采用荧光定量RT-PCR方法对其进行诺如病毒核酸检测,并对核酸阳性标本进行RNA多聚酶部分区域的RT-PCR扩增。选取阳性扩增产物进行纯化及序列测定,结合诺如病毒GI、GII各基因型参考株进行核苷酸序列遗传进化分析。结果2起疫情均同时检出了GI和GII型诺如病毒。随后对其中4份RNA多聚酶区扩增阳性的标本进行测序及序列分析,结果发现2008年检出的2株GI型诺如病毒均为GI/2基因型;而2009年检出的1株GI型诺如病毒为GI/3基因型,另一株GII型诺如病毒则与近些年欧洲和亚洲相继出现的遗传组GII的新基因型GIIb的各代表株同源性最高,为GIIb基因型。这说明湖州地区流行的诺如病毒存在很高的遗传多样性,并且不同时间流行的基因型也存在一定差异。这也是国内首次在急性病毒性胃肠炎暴发中检出诺如病毒GIIb变异株。