自身互补型腺相关病毒载体发展趋势

重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)可以作为基因运载工具将目的基因运送入靶器官并对多种疾病发挥治疗作用。以rAAV为载体进行基因治疗的关键是病毒基因组由单链变为双链,否则不能适时、有效表达目的基因。自身互补型rAAV(scrAAV)载体基因组本身以双链形式存在,与常规的单链rAAV(ssrAAV)载体相比,无论在表达时间还是表达强度上都有十分明显改善,可显著降低在疾病治疗过程中由于载体本身所诱发的免疫反应。目前,scrAAV已经在肝脏疾病、中枢神经系统疾病、眼部疾病、干细胞修饰以及RNA干扰、核酶技术等领域得到应用。以下在介绍scrAAV载体构建、表达、定位的基础上,以血友病B为主要对象,阐述scrAAV的应用潜力及发展趋势。     

重组腺相关病毒载体基因表达效率与辐射的关系

重组腺相关病毒(rAAV)载体被认为是最有希望的临床应用基因治疗载体之一。rAAV载体基因传递的有效性与病毒衣壳蛋白的免疫原性之间的矛盾是制约该类基因药物开发的关键难题,提高其表达效率是rAAV载体研发的主攻方向之一。研究发现,紫外线、γ射线等辐射可以提高rAAV载体的基因表达效率,其作用效果与辐射种类和剂量、细胞种类和状态、载体感染指数和感染时间等因素有关。其机制可能与DNA损伤反应,特别是DNA双链断裂修复有关。对辐射与rAAV载体的表达效率之间关系的深入了解,为两者的联合应用打开方便之门。本文将对UV、γ射线等辐射提高rAAV载体表达效率的机制、影响因素及其在基因治疗领域的应用进展进行综述。     

重组腺相关病毒载体诱导的天然免疫反应及机制

重组腺相关病毒(rAAV)已成为基因治疗领域应用最广泛的载体之一。临床前研究显示其具有很高的安全性,但人体免疫毒性仍是制约其临床疗效的关键,因此有关rAAV免疫机制的研究成为近期热点。尽管天然免疫在获得性免疫反应中发挥重要作用,但与rAAV有关的天然免疫研究过去一直未被重视。直到最近,才确认有至少3种人体细胞(树突状细胞、巨噬细胞和内皮细胞)参与了rAAV的天然免疫,作用机制为可识别载体基因组的TLR9或病毒衣壳TLR2所介导,NF-κB或干扰素调节因子(IRFs)信号通路被激活,导致各种炎性因子及I型干扰素的大量表达。自身互补型rAAV诱导的TLR9依赖性天然免疫较单链rAAV更为强烈。本文重点对近期发现的激活天然免疫反应的宿主与rAAV的相互作用、涉及的信号通路、天然免疫对获得性免疫以及转基因表达的影响进行综述。     

重组腺相关病毒包装容量研究进展

在以病毒载体介导的基因治疗研究中,重组腺相关病毒(rAAV)因其疗效和安全性方面的优势,是最有临床应用前景的载体。但其转基因包装容量一般不能超过5.0kb,给需要转导大片段基因的应用带来了困难,限制了rAAV在基因治疗研究中的应用。随着对rAAV细胞转导生物学过程研究的不断深入,发现了一些可以突破rAAV包装容量限制的技术,如反式剪接和同源重组策略,为拓展该载体应用范围提供了可能性。另外,rAAV包装容量限制的特点还可以被用来减少生产过程中具有可复制能力的类病毒杂质的污染,为rAAV的临床安全性提供了保障。     

重组腺相关病毒生产方法研究进展

重组腺相关病毒(rAAV)作为基因治疗的载体,具有感染范围广、能在宿主细胞中长久稳定表达外源基因和非致病性等优点,因此在基因治疗领域倍受青睐。rAAV的大规模制备技术一直是限制其临床广泛应用的瓶颈。近年来,有许多改进rAAV制备工艺的尝试。我们在介绍rAAV载体制备所需各种元件的基础上,对这些方法进行了简要综述。     

化学修饰的重组腺相关病毒载体

重组腺相关病毒(Recombinant adenovirus-associated virus,rAAV)载体源于腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV),以其无致病性、低免疫原性、可定点整合及在宿主细胞内长期表达等优势,广泛应用于肿瘤和遗传疾病等基因治疗研究,被视为最有前途的基因治疗载体之一。但是人体内广泛存在AAV中和抗体,以及rAAV对体内特定组织或细胞的靶向性欠理想,限制了其在临床上的应用。经化学修饰的rAAV可以抵御血清中和抗体,提高转导靶向性,还可实现rAAV体内动态监测,这为解决当前rAAV载体的问题提供了新的思路和方法。本文对化学修饰的rAAV展开系统阐述,并对其未来发展趋势作出展望。     

重组腺相关病毒载体的研究进展

重组腺相关病毒(rAAV)载体作为基因治疗的工具,具有无致病性、长期表达、低免疫原性和感染多种细胞等特点.因此,rAAV载体越来越受到重视.就rAAV载体在生物学特性、构建、安全性和应用方面作一介绍.     

重组腺相关病毒规模化生物包装技术

重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)的诸多优点使其成为具有巨大潜力的人类基因治疗载体。人类基因治疗临床前和临床研究以及基因治疗产品的市场化要求rAAV载体生产的规模化。自1989年野生型的腺相关病毒序列被Samulski报道以来,rAAV的生产工艺已经从传统的质粒共转染发展到应用包装细胞系和生产细胞系,包装细胞也从"人体细胞"衍化到"昆虫细胞"。目前rAAV的生产规模和病毒载体质量都完全可以符合临床应用要求,有效地促进rAAV在基因治疗临床上的广泛运用。以下将着重介绍rAAV规模化生物包装技术的发展趋势,尤其各种规模化生产系统的要点。     

重组腺相关病毒载体的整合性研究进展

重组腺相关病毒(rAAV)载体是一种具有高靶向性和良好安全性的病毒载体,在基因治疗中得到了较为广泛的应用。目前全球范围内已有70余项以rAAV为基因药物的临床研究已经完成或正在进行中。与野生型AAV(wtAAV)定点整合不同,不表达Rep蛋白的rAAV载体与宿主染色体发生的是随机整合,而这给临床应用带来了可能的潜在的安全隐患。该文在综述wtAAV和rAAV整合机理的基础上对rAAV的因随机整合而可能导致的致癌性及其他后果进行探讨,并总结了相应应对策略,特别是目前利用Rep蛋白所开展的定点整合研究。     

腺相关病毒的衣壳装配和DNA衣壳化机制

重组腺相关病毒载体 (rAAV) 是基因治疗临床应用载体的选择之一。在简述野生型AAV基因组结构和复制机制的基础上,阐述了AAV包装过程中两个主要事件：衣壳蛋白的装配和基因组DNA的衣壳化。虽然对AAV的包装机制总体上已有一定的认识,但其详细的分子机制、构效关系仍需完善和充实。AAV病毒本身相关机制的深入研究有助于改善rAAV载体的制备技术,促进rAAV基因药物研发。     

重组腺相关病毒载体相关性杂质

可以稳定表达治疗基因而无明显不良反应的重组腺相关病毒 (rAAV) 载体被认为是最有发展前景的基因治疗载体。但如何建立可以有效去除rAAV载体内具有潜在致病危害的杂质、产品质量符合临床使用要求的纯化工艺是研究人员面临的巨大挑战。其中针对载体相关性杂质的纯化工艺尤为关键,因为该类杂质的性质与真正的rAAV载体极其相似,一旦存在便难以去除,且会引起严重不良反应。以下总结了该类杂质形成的过程及有别于rAAV载体的特点,并对可以防止其生成或将其与rAAV载体有效分离的技术手段进行了评价。     

重组腺相关病毒载体相关性杂质

可以稳定表达治疗基因而无明显不良反应的重组腺相关病毒(rAAV)载体被认为是最有发展前景的基因治疗载体。但如何建立可以有效去除rAAV载体内具有潜在致病危害的杂质、产品质量符合临床使用要求的纯化工艺是研究人员面临的巨大挑战。其中针对载体相关性杂质的纯化工艺尤为关键,因为该类杂质的性质与真正的rAAV载体极其相似,一旦存在便难以去除,且会引起严重不良反应。以下总结了该类杂质形成的过程及有别于rAAV载体的特点,并对可以防止其生成或将其与rAAV载体有效分离的技术手段进行了评价。     

重组腺相关病毒载体在肝疾病基因治疗中的应用及局限性

基因治疗(gene therapy)是近十年来随着现代分子生物学技术的发展而诞生的新的生物医学治疗技术.重组腺病毒伴随病毒是一种具有开发潜质的病毒载体,因此近年来对它的研究很是受人关注.肝炎、肝硬化、肝癌在我国乃至全世界是严重损害人们的健康,据此,国内外的研究人员对rAAV在肝疾病基因治疗方面做了大量的工作,本文对rAAV在肝疾病基因治疗中的应用和局限性研究进行综述.     

一种高效的重组腺伴随病毒载体生产系统

重组腺伴随病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)载体是目前较理想的基因治疗载体之一,但难以大规模制备一直是影响其广泛应用的主要因素.曾组建了一种表达2型腺伴随病毒(adeno-associated virus type 2,AAV-2) Rep和Cap的重组1型单纯疱疹病毒HSV1-rc/DUL2,现在此基础上,证实了该重组病毒支持rAAV的复制与包装,包装出的rAAV具有感染性;构建了携带新霉素抗性基因、适合多种外源基因插入的通用型rAAV载体质粒pSNAV-2及表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的rAAV载体质粒pSNAV-2-GFP,建立了稳定携带GFP基因表达盒的rAAV载体细胞株;确定了HSV1-rc/DUL2感染载体细胞株时的最佳感染复数(multiplicity of infection, MOI)为0.1;采用“一种病毒感染一个载体细胞株”的策略,用“感染”的方式代替传统的“转染”方式,使每个细胞产生的rAAV比传统方式提高了2个数量级以上,并实现了rAAV的规模化制备,为rAAV用于基因治疗的临床试验打下了基础.     

提高重组型腺相关病毒转导效率的研究现状

重组型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,r AAV)载体是目前基因治疗研究中常用的、非常有前景的载体之一。欧洲第一个批准上市的基因治疗药物正是基于r AAV。然而,r AAV的转导效率相对有限,导致其治疗成本过高;且过高剂量的r AAV可以激发人体的免疫反应,降低其疗效。因此,如何提高r AAV的转导效率一直是基因治疗领域研究的热点之一。目前常用的提高r AAV转导效率的方法有:使用组织特异性强的血清型/变体、应用蛋白酶体抑制剂、突变衣壳蛋白表面裸露氨基酸、增加单链DNA的第二链合成、构建自身互补型双链载体等。就这些方法各自的原理、应用现状及优劣势进行系统地综述。     

1型和2型外壳蛋白构建的AAV载体携带HIV-1 gag诱导免疫反应的比较研究

比较两种血清型的腺病毒伴随病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体携带HIV-1gag基因肌肉注射诱导小鼠免疫反应的特点。分别制备携带EGFP和HIV-1gag基因的重组AAV2/1(AAV1)和AAV2载体。小鼠肌肉注射rAAV1-EGFP和rAAV2-EGFP,观察注射局部EGFP的表达。将rAAV1-gag和rAAV2-gag分别以0、3周初免/加强方式肌肉注射免疫BALB/c小鼠以及新西兰白兔。ELISA法检测抗HIV-1 Gag P24蛋白的特异性抗体,细胞内细胞因子染色法检测Gag特异性的CTL反应。结果表明,rAAV1-EGFP在小鼠肌肉的表达强度显著高于rAAV2-EGFP;用Western blot法和间接免疫荧光法检测rAAV1-gag和rAAV2-gag体外转染的293细胞,均可检测到HIV-1 Gag蛋白的表达;在小鼠体内rAAV1-gag和rAAV2-gag组均可检测到特异性P24抗体,抗体滴度rAAV1-gag组显著高于rAAV2-gag组;而无论rAAV1-gag组还是rAAV2-gag组,特异性CTL反应均较低,与阴性对照组相比均无显著性差异;两种载体免疫兔子也都可检测到特异性P24抗体,同样地,rAAV1-gag组显著高于rAAV2-gag组。结论:携带HIV-1gag基因的rAAV1或rAAV2以肌肉注射方式免疫小鼠主要诱导特异Gag的体液免疫反应;且rAAV1可诱导很强的抗HIV-1 Gag特异性抗体,抗体水平显著高于rAAV2。     

测定重组腺相关病毒基因组滴度的qPCR新方法

腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)在基因治疗应用中具有很多优势,但是其生物学滴度的测定仍很繁琐,不同实验室使用各自的方法和参照,这些都影响了重组腺相关病毒(rAAV)载体在临床前和临床上的应用.反向末端重复序列(Inverted terminal repeats,ITR)是重组腺相关病毒载体中不可或缺的顺式作用元件,针对ITR2以及ITR2-CMV设计的qPCR检测方法可以快速、准确地得到rAAV2的基因组滴度,由于该方法可以广泛适用,因此对推动AAV滴度检测的标准化有重要意义.     

受体介导基因治疗存在的主要问题和可能的解决办法

载体是基因治疗的关键因素之一。从总体上来看 ,基因治疗的载体可以分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体介导的基因治疗取得了显著发展 ,是目前基因治疗的主要载体。但是病毒载体具有携带外源基因片段大小受到限制 ( 7ｋｂ左右 )、易引起机体收稿日期 :2 0 0 1 0 3 0 5作者简介 :孙兴会 (1975 - ) ,男 ,硕士生 ;朱运松 (1940- ) ,男 ,教授。免疫反应以及制备、贮存、质量控制比较困难等固有缺点 ,这促进了人们对非病毒载体介导基因治疗的研究。在过去的十多年里 ,人们对受体介导的基因治疗进行了广泛的研究 ,并取得了较大的进展。受体…     

DMD基因治疗中AAV载体优化的研究进展

杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy, DMD)是一种由抗肌萎缩蛋白(dystrophin)编码基因突变引起的进行性肌肉萎缩疾病,机体无法产生正常功能的dystrophin,最后由呼吸肌或心肌衰竭引发成年早期死亡。全身系统性基因治疗是最大程度治疗DMD的最有效方法。腺相关病毒(adeno-associated virus vector, AAV)是当前极具应用前景的基因治疗载体,在多种遗传性疾病的临床治疗中取得了前所未有的成功。然而,针对DMD的AAV载体基因治疗仍面临巨大挑战,包括无法容纳dystrophin全长编码序列,载体的肌肉靶向性不足且大量滞留在肝脏,AAV在体内大幅降解严重降低转导效率,机体对AAV衣壳蛋白产生免疫反应,AAV规模化制备的实施难度,以及安全性风险等。AAV载体优化旨在利用基因工程技术改变其相关特性以定制适用于DMD基因治疗的最佳载体。本文综述了AAV载体优化的方向及策略,以期跨越DMD基因治疗的障碍。     

利用BmNPV-家蚕表达系统包装重组腺相关病毒2型（rAAV2）研究

腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）是基因治疗中最常用的病毒载体之一,目前用于基因治疗的AAV多利用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒表达系统（AcMNPV-sf9）包装,但较高的包装成本限制了AAV在基因治疗中的广泛应用。家蚕杆状病毒表达系统与AcMNPV-sf9系统相比,具有包装量更高、成本更低的优势,因此更适用于包装重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus,rAAV）。首先,将AAV2功能基因cap和rep进行序列优化后合成,克隆到杆状病毒转移载体pVL1393上,将增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因和荧光素酶（luciferase,Luc）基因分别作为报告基因克隆到含有巨噬细胞病毒IE（cytomegalovirus-IE,CMV-IE）启动子的病毒转移载体pVL1393-ITRs-MCS上。随后,将构建好的转移载体分别与缺陷型家蚕杆状病毒reBmBac共转染BmN细胞系,获得分别重组有cap、rep和报告基因的家蚕杆状病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）。再将纯化的重组病毒（reBm-Cap2、reBm-Rep2）与reBm-EGFP、reBm-Luc分别混合后感染家蚕,收获其表达产物,纯化得到含有目的基因的rAAV病毒。利用rAAV病毒感染哺乳动物细胞后,通过检测EGFP、Luc的表达状态来验证rAAV包装成功与否。结果显示,利用家蚕杆状病毒系统成功包装了rAAV2,并且在哺乳动物细胞中实现了报告基因的表达。