人偏肺病毒融合蛋白F的原核表达及初步应用

为了探讨人偏肺病毒(hMPV)融合蛋白(F)在原核表达系统中的表达效果及其应用价值,用大肠杆菌表达系统表达hMPV F1亚单位蛋白并用镍柱(Ni-NTA)进行亲和层析纯化,并以其为抗原,用Western Blot方法进行人血清抗体检测的探索。根据F蛋白的疏水性、抗原位点和表面可及性的预测结果选择F1亚单位为目标区域,在大肠杆菌BL21中分别得到了带有6个组氨酸(His)标记的不同基因型hMPV的F1亚单位蛋白的高效表达,目的蛋白大小约37.0 kD,主要以包涵体形式存在。Western Blot检测显示表达的目的蛋白可以特异性地结合抗hMPV的豚鼠多克隆抗体以及确定为hMPV急性感染患者的血清,而且与副粘病毒科肺病毒属的呼吸道合胞病毒(RSV)和副流感病毒(PIV)(2和3型)之间没有交叉反应,显示表达的F1蛋白的特异性和抗原性良好。应用该表达蛋白进行部分人群血清抗体检测的探索,结果显示人群血清抗hMPV-F蛋白的IgG抗体总阳性率约为66%~67%,0~2岁组的血清抗体阳性率随年龄增长呈现逐渐下降趋势,新生儿的抗体阳性率最高,达85%左右,>1岁~2岁组幼儿阳性率最低,提示母传抗体的存在。随后各年龄组人群随年龄的增长血清抗体阳性率逐渐增高,>60岁年龄组人群抗体水平最高,上述结果提示<2岁儿童为hMPV的易感人群。     

呼吸道合胞病毒F蛋白研究进展

人类呼吸道合胞病毒(RSV)融合蛋白(F蛋白)为病毒表面结构蛋白,可以刺激机体产生保护性抗体。因此对F蛋白的深入研究将有助于了解病毒感染的机理,从而为诊断试剂和亚单位疫苗的研制提供帮助。本文就F蛋白结构及结构与功能关系的研究进展进行简要综述。     

基于融合前F蛋白呼吸道合胞病毒疫苗的研究进展

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)是引起婴幼儿和老年人下呼吸道感染(lower respiratory tract infection, LRTI)的主要原因,尚无可用于预防的疫苗。目前,WHO已将研发RSV疫苗确定为其疫苗研发和生物标准化倡议的优先事项之一。RSV融合蛋白(fusion protein, F)是病毒表面的主要保护性抗原,主要介导病毒包膜和靶细胞膜的融合。在感染过程中,F蛋白从亚稳态的融合前F蛋白(prefusion fusion protein, PreF)转变为稳定的融合后F蛋白(postfusion fusion protein, PostF)。近年来,研究发现PreF在体内诱导产生RSV中和抗体能力更强,适合作为免疫原用于RSV疫苗的研发。现就RSV PreF的结构、稳定策略及其作为疫苗候选抗原的应用作一概述。     

北京地区人偏肺病毒膜表面糖蛋白G编码基因和特征的分析

为了解北京地区人偏肺病毒(hMPV)膜表面糖蛋白G编码基因的特征,提取2003年和2004年各6份hMPV阳性的临床呼吸道标本中的RNA,经用随机引物合成cDNA后,用特异性引物扩增G蛋白全基因,克隆至pBS-T载体中并进行测序。用生物软件与GenBank中hMPV的基因序列进行比较和种系进化分析。12株hMPV可以分为两个主要的进化簇1和2。每个进化簇还可以再分为不同的亚进化簇。3株(2003年)hMPV属于进化簇1;9株(3株2003年和6株2004年)hMPV属于进化簇2。这12株hMPV G蛋白基因的核苷酸长度在624~711nt,使用了两种不同的终止密码,编码的氨基酸长度为208~236 aa,蛋白质分子量为22.9~25.8kD。与进化簇2相比,进化簇1的3株hMPV都出现了3个核苷酸的缺失,但未改变读码框架。同一进化簇内的hMPV G蛋白基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为95.7%~100%和91.8%~100%,不同进化簇间的核苷酸和氨基酸的同源性分别为56.3%~57.4%和34.3%~38.2%。疏水性分析表明这12株hMPV G蛋白是典型的Ⅱ型跨膜锚定蛋白,分别与两个进化簇代表株的疏水图一致。这些hMPV的G蛋白氨基酸的替换集中在胞外区。它们都含有高百分比的脯氨酸(P)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T),含有相当数量的位于胞外区的O-连接糖基化位点。这些hMPV的G蛋白的N-连接糖基化位点数目和位置不尽相同。通过对G蛋白基因的分析显示,2003年和2004年北京地区流行的hMPV分属于两种不同的进化簇。基因分析显示hMPV的G蛋白是高糖基化的膜表面蛋白,具有与同属于副粘病毒科、肺病毒亚科的人呼吸道合胞病毒(hRSV)的G蛋白相似的基因特征,推测其功能和在感染免疫中的作用相当于hRSV的G蛋白,但有待进一步深入研究予以证实。     

副粘病毒附着蛋白在病毒融合过程中的作用*

副粘病毒附着蛋白 (AP)是病毒表面的一种主要糖蛋白 ,它能够诱导机体产生中和抗体。近年来的研究表明附着蛋白在病毒融合过程中的作用不仅限于其对受体的识别和结合 ,它还促进融合蛋白 (F)介导病毒与宿主细胞的融合。由此可见 ,副粘病毒具有其特有的融合机理 ,因此研究附着蛋白在病毒融合过程中的作用是揭示副粘病毒融合机理的前提 ,同时也会为新型抑制药物的研究提供思路。     

实时聚合酶链反应方法检测人偏肺病毒的比较研究

人偏肺病毒(the human metapneumovims,hMPV)是2001年首次从荷兰儿童的鼻咽部吸出物中分离出来的,为一种负链RNA病毒,初步被归属于副粘病毒科偏肺病毒属。hMPV和流感病毒、副流感病毒、腺病毒、鼻病毒、冠状病毒、人呼吸道合胞病毒(hRSV)一样可导致儿童、成人及免疫功能受损患者的急性呼吸道感染(ARTI)。在儿童病原体不明的ARTI中,hMPV占1．5％-10％。但是,该病毒在     

稳定性改善的呼吸道合胞病毒融合糖蛋白疫苗的设计和特性鉴定

呼吸道合胞病毒(RSV)感染是幼儿和老年人下呼吸道感染的主要原因。目前,还没有能用的上市疫苗并且治疗这种疾病的选择相当有限。感染性RSV颗粒用I型病毒融合蛋白(F)糖蛋白修饰,其在结构上从亚稳态的融合前形态重排成高度稳定的融合后形态。在自然感染RSV的人群中,中和抗体主要识别病毒融合前构象。因此,基因工程制备的其融合前构象稳定的经RSV F蛋白一直是开发RSV F疫苗抗原的有前景的方向。在4 ℃或更高温度下长期稳定性是RSV F亚单位疫苗抗原的理想属性。     

人呼吸道合胞病毒小疏水蛋白研究进展

人呼吸道合胞病毒是人呼吸道感染病原中的重要病原。SH蛋白是人呼吸道合胞病毒粒子表面的一种小分子糖蛋白,可形成五聚体的离子通道结构。SH蛋白是人呼吸道合胞病毒复制的非必需蛋白,但可以影响病毒融合蛋白介导的细胞融合,近年研究发现SH蛋白胞外区与血蓝蛋白形成的复合物可作为人呼吸道合胞病毒疫苗的抗原,产生的抗体在体内能清除病毒感染的细胞。本综述旨在对人呼吸道合胞病毒SH蛋白最新研究成果进行总结和讨论,并对未来针对SH蛋白的研究方向加以展望。     

基于融合蛋白的呼吸道合胞病毒疫苗的研究进展

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是一种引起严重下呼吸道感染的病原体,易感人群为婴幼儿、老年人及免疫功能低下者。目前尚无有效的抗病毒药物和预防疫苗。RSV融合蛋白(fusion protein,F蛋白)具有高度保守性,其诱导的抗体可同时抑制A型和B型两个亚型的RSV感染。因此,以F蛋白作为靶抗原的RSV亚单位疫苗、颗粒样疫苗和病毒载体疫苗是目前研究的主要策略。现就基于F蛋白的RSV疫苗研究进展作一综述。     

副流感病毒5包膜糖蛋白的结构与功能

副流感病毒5(Parainfluenza virus 5,PIV5)属于单股负链不分节段的RNA病毒,迄今尚未发现PIV5与人类已知的疾病有关,主要被用作疫苗载体。其包膜上存在三种糖蛋白:融合(Fusion,F)蛋白、血凝素-神经氨酸酶(Hemaggulatinin-neuraminidase,HN)蛋白、小疏水性(Small hydrophobic,SH)蛋白。F蛋白能在同源性HN蛋白的协助下介导膜融合,HN蛋白具有受体识别、神经氨酸酶活性和促细胞融合活性,SH蛋白则在病毒致病机制中起作用。本文主要阐述了三种包膜糖蛋白的结构和功能,旨在为PIV5的研究提供一些参考。     

RSV初免后用表达RSV融合前F蛋白的副流感病毒载体加强免疫更有效

正人呼吸道合胞病毒(RSV)是一种重要的全球性儿童呼吸道病原体,目前缺乏已获许可的疫苗或合适的抗病毒药物治疗,针对RSV鼻内给药的儿童减毒活疫苗正处于研发之中。本文作者评估了一种序贯免疫策略,即RSV初次免疫后,用RSV或表达RSV融合前F蛋白的嵌合牛/人副流感病毒3型(rB/HPIV3)载体进行加强免疫。基因工程技术构建载体表达的F蛋白(DS-Cav1突变),提高了高免疫原性融合前F蛋白(pre-F)的构象稳定性。     

北京地区两株人偏肺病毒M蛋白基因的原核表达及抗原活性分析

人偏肺病毒(Human metapneumovirus,hMPV)是最近发现的可引起人类呼吸道感染的一种副粘病毒,现被归类于偏肺病毒属(Metapneumovirus),是至今发现的第一个与人类疾病相关的偏肺病毒属成员[1]。目前已经受到世界范围的重视,已有十多个国家报道了不同年龄组人群中hMPV的感染情况。     

2种检测人偏肺病毒感染的荧光定量PCR方法的应用比较

目的:比较基于人偏肺病毒(hMPV)N或L基因的2种检测hMPV感染的荧光定量PCR方法在207例临床呼吸道样本检测中的应用效果。方法:建立基于hMPV N或L基因片段的荧光定量PCR方法,检测2008年5月至2009年3月在北京儿童医院因急性呼吸道感染的住院患儿鼻咽拭子207份,比较2种方法检出率的敏感性和特异性。结果:在207份样本中,2种方法共检出38(18.36%)份阳性样本,基于N或L基因一种方法均检出32(15.46%)份阳性样本,总检出符合率为94.2%(195/207)。另外发现,基于L基因检测为阴性而基于N基因检测为阳性的样本在L基因与引物和探针结合的部分序列有核苷酸的突变。对19例阳性样本的F基因进行进化树分析发现,大多数hMPV属于A2和B2型,只有1例属于B1型。结论:2种荧光定量PCR方法的联合应用,对于临床样本中hMPV的检测更为敏感。     

人呼吸道合胞病毒亚单位疫苗的研究进展

呼吸道合胞病毒(RSV)是在世界范围内引起婴幼儿下呼吸道感染的重要病毒之一,WHO要求对RSV要严加监控。RSV是副粘病毒科肺炎病毒属的单股负链非节段性RNA病毒。RSV疫苗的研制已有40多年的历史,但至今未被批准使用其疫苗。RSV膜表面融合蛋白F和黏附蛋白G两种糖蛋白,是激发机体产生保护性抗体的最主要的病毒抗原,亚单位疫苗的开发主要针对这两个蛋白。目前研究的有纯化的F糖蛋白(PFP)、BBG2Na、嵌合型F-G糖蛋白及纯化的F、G和基质蛋白M。本文就目前国内外所研究的RSV亚单位疫苗作一综述。     

呼吸道合胞病毒F蛋白抗体的研究进展

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染,是造成婴幼儿、学龄前儿童、免疫缺陷患者、老年人等高危群体住院治疗及死亡的重要病因。目前,多个预防RSV感染的候选疫苗正处于研发中,尚无安全、有效的疫苗面世。对RSV感染的处理仍以治疗为主,使用帕利珠单抗(Palivizumab)是当前仅有的预防药物。在过去数年间出现的新型抗体药物,如多克隆抗体、单克隆抗体、纳米抗体等有些已进入了临床前或I、II、III期临床试验阶段。融合蛋白(fusion protein,F蛋白)在RSV感染过程中是不可或缺的,它介导病毒包膜与宿主细胞膜的融合。在感染过程中,F蛋白从亚稳态的融合前构象状态(prefusion fusion protein,pre F)转变为热力学稳定的融合后状态(postfusion fusionprotein,post F)。近年来,研究人员通过不断筛选,获得了多株针对pre F的抗体。与结合post F的抗体相比,这些抗体具有更强的RSV中和活性。一些更新的抗体药物候选品,在实验中显示出了效力强、药代动力学特征明显、半衰期长等特点,并能以其他途径给药,而且能降低其制备成本。现就抗RSV pre F的抗体研究进展作一概述。     

偏肺病毒对副粘病毒细胞融合的新注释

对于副粘病毒科中的大多数病毒而言,细胞融合过程需要病毒的融合蛋白和吸附蛋白共同参与,其中吸附蛋白负责与受体结合,吸附蛋白与融合蛋白的相互作用激活融合蛋白进而激活细胞融合。而偏肺病毒介导的细胞融合则与上述副粘病毒的融合显著不同,所有已报道偏肺病毒介导的细胞融合不需要吸附蛋白的参与,其融合蛋白可单独完成与受体结合和融合。并且近年研究发现有些人偏肺病毒毒株介导的融合需要低pH条件,禽偏肺病毒A型具备极强的融合能力,而禽偏肺病毒B型则较弱。原有的副粘病毒细胞融合理论模型均不能解释上述现象,偏肺病毒介导的这种融合机制目前还不清楚,其研究在近几年日趋成为细胞融合机制研究的热点。近年发现的偏肺病毒介导的融合现象打破了人们对副粘病毒融合的固有理解,拓展了人们对副粘病毒介导的细胞融合的认识。本文旨在对偏肺病毒介导的细胞融合的最新成果和进展加以综述和讨论。     

030儿童人偏肺病毒的感染:与呼吸道合胞病毒和流感病毒感染的比较分析

人偏肺病毒（hMPV）是2001年荷兰学者从急性呼吸道感染的儿童和成人中分离到的一种与禽肺病毒密切相关的RNA病毒。研究表明hMPV是婴幼儿期急性呼吸道感染的新现病原。作者为全面评估该病毒在儿童及其家庭成员等感染的情况，采集了1505例已排除外科疾患的15岁以下急诊儿童的咽拭样品，进行hMPV、呼吸道合胞病毒（RSV）和流感病毒核酸的检测，并对包括症状、体征、治疗等方面作了对比研究。     

住院肺炎患儿偏肺病毒和呼吸道合胞病毒感染研究

为探讨沈阳地区肺炎患儿中偏肺病毒(hMPV)和呼吸道合胞病毒(RSV)感染情况,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法对部分因肺部感染住院患儿进行了病原学研究。结果显示,hMPV感染率为9%;而RSV感染率为46%,其中A型占40%,B型占60%。研究结果表明,在婴幼儿肺炎患儿中RSV感染率高于hMPV感染率,两者所致肺炎在发病年龄、性别及临床症状上无显著区别。     

副粘病毒附着蛋白在病毒融合过程中的作用

副粘病毒附着蛋白（AP）是病毒表面的一种主要糖蛋白,它能够诱导机体产生中和抗体。近年来的研究表明附着蛋白在病毒融合过程中的作用不公限于其对受体的识别和结合,它还促进融合蛋白（F）介导病毒与宿主细胞的融合。由此可见,副粘病毒具有其特有的融合机理,因此研究附着蛋白在病毒融合过程中的作用是揭示副粘病毒融合机理的前提,同时也会为新型抑制药物的研究提供思路。     

呼吸道合胞病毒融合蛋白F1和截短F1蛋白的表达差异研究

目的构建呼吸道合胞病毒融合蛋白F1和截短F1蛋白的原核表达载体,并对它们在大肠杆菌中的表达差异进行了初步研究。方法用DNAstar软件对呼吸道合胞病毒F1蛋白进行亲疏水性和抗原表位可能性分析后,将其两端的疏水区域截去之后与pET-42b(+)构建表达载体,同时用相同的表达系统构建F1蛋白的表达载体并将2种重组蛋白进行诱导表达。实验对2种蛋白在Rossata/pET-42b(+)菌株中的表达难易度、表达形式及初步洗涤的包涵体纯度进行了比较。结果与F1蛋白相比,截短的F1蛋白相对更容易表达,表达的可溶性蛋白含量更高,洗涤纯化后的包涵体纯度也更高。结论呼吸道合胞病毒F1蛋白截去两端疏水氨基酸后更容易表达,为后期蛋白的大量制备及其免疫原性研究奠定了基础。