白色念珠菌CYP51蛋白功能性氨基酸残基定点突变、蛋白表达及活性测定

实验设计了白色念珠菌CYP51蛋白功能性氨基酸残基突变体Y118A、Y118F、Y118T、S378A、S378T、H310A、H310R, 并转入基因工程菌D12667中表达。用Western及紫外分光光度法定性、定量检测蛋白, 用GC-MS法测定蛋白代谢活性。结果表明, 成功表达目标蛋白, 蛋白诱导表达量接近微粒体蛋白总量的25%。活性测定表明, 表达的野生型蛋白保持其对天然底物的代谢能力; 相较于野生型蛋白, 突变体蛋白代谢活性不同程度改变, 最多可下降1/2左右。因此, 本研究中成功表达了野生型和     

基于Hog-MAPK信号通路探讨白念珠菌氟康唑耐药机制的实验研究

目的探讨Hog-MAPK信号通路在白念珠菌氟康唑耐药机制中的作用。方法通过Real-Time PCR、Western blot等方法比较白念珠菌氟康唑敏感株与耐药株Hog-MAPK信号通路相关的HOG1等基因的mRNA表达,以及磷酸化p38 MAPK蛋白表达的差异,并应用微量液基稀释法检测白念珠菌HOG1基因缺陷株及其原始亲代菌株/标准株对氟康唑MIC值的差异。结果白念珠菌氟康唑敏感株与耐药株之间Hog-MAPK信号通路相关基因mRNA表达和蛋白表达存在一定差异性,敏感株的表达在一定程度上低于耐药株,HOG1基因缺陷株对氟康唑更为敏感。结论白念珠菌氟康唑耐药性可能与Hog-MAPK信号通路中部分基因和蛋白表达有关,这些基因和蛋白表达的降低可能使耐药性发生改变。     

稻瘟菌CYP51蛋白F螺旋区保守氨基酸残基与

【目的】研究稻瘟菌CYP51蛋白F螺旋区保守氨基酸残基与烯唑醇的相互作用机制,为稻瘟病菌新型高效特异杀菌剂的开发提供理论依据。【方法】设计稻瘟菌CYP51蛋白F螺旋区保守氨基酸残基突变体P222C、P222H、I223A、I223W、N224A、N224S,截去N端跨膜区36个氨基酸后,在大肠杆菌BL21(DE3) Rosetta菌株中过量表达,采用结合光谱法分析诱导蛋白对烯唑醇的结合能力。【结果】表达的目标蛋白均保持了对药物的结合能力,呈现出II型的结合光谱曲线。相对于野生型蛋白,突变体I223W和I223A对烯唑醇的结合常数Kd值基本不变,N224S、N224A、P222C的Kd值都略有增大,无显著性差异(P>0.05),但是,P222H的Kd值有了显著的增大(P<0.05),表明突变体P222H对烯唑醇的亲和能力显著降低。【结论】稻瘟菌CYP51 P222位点的疏水性与药物结合密切相关。     

P48L和D74N突变对p16基因功能的影响

应用DNA聚合酶链式反应(PCR)技术,对p16抑癌基因(CDKN2)进行体外定点突变,在p16cDNA中引入第48位密码子CCG(Pro)→CTG(Leu)和第74位密码子GAC(Asp)→AAC(Asn)突变,构建了p16-P48L和p16-D74N突变体。野生型和突变型p16 cDNA克隆于pcDNA3构建pCMV-p16、pCMV-p16P48L和pCMV-p16D74N真核表达载体,导入纯合缺失p16基因的人肺癌细胞株H460,经RNA点杂交、RNA印迹和细胞免疫化学染色,检测到P16表达。通过比较表达野生型和突变型P16的H460细胞在~3H-TdR掺入及细胞所在周期的差异,证实P16表达抑制细胞进入S期,而P48L和D74N突变体对细胞进入S期没有什么影响,提示P48L和D74N突变导致P16蛋白功能丧失。     

白念珠菌SSK1突变株对氟康唑敏感性的初步研究

目的探讨氟康唑作用于白念珠菌双组分信号传导途径SSK1突变株SSK21后药物敏感性的变化。方法采用微量液体稀释法和固醇测定法测定野生株(CAF2-1)和突变株(SSK21)的最小抑菌浓度(MIC);并应用RT-PCR观察氟康唑作用前后,SSK1的表达变化。结果氟康唑对CAF2-1的MIC为16μg/mL,对SSK21为0.032μg/mL。加入氟康唑后,CAF2-1的SSK1表达明显增加,60min时达到最多。结论 SSK21对氟康唑高度敏感,SSK1基因及其相关的重要基因与药物敏感性的关系值得进一步研究,从而为新的抗真菌药物和治疗途径的研发提供参考。     

突变型人TRBP 基因的构建及表达

目的:探讨RNAi过程中TRBP传递双链RNA的机制,构建RNA结合结构域突变的人TRBP基因真核表达载体。方法:设计突变引物,通过拼接PCR将突变型TRBP基因克隆入pFLAG-CMV4真核表达载体,经双酶切和测序鉴定正确后,命名为pFLAG-CMV4-TRBPm。瞬时转染HEK-293细胞,western-blot检测目的蛋白表达。结果:成功扩增了突变序列,构建了突变型TRBP基因的真核表达载体,转染HEK-293细胞后检测到带标签的目的蛋白表达。结论:突变型TRBP基因真核表达载体的成功构建,为进一步研究TRBP的生物学效应奠定了基础。     

弓形虫MIC6突变体的构建及其特性分析

目的:体外构建弓形虫微线体蛋白6(MIC6)突变体并分析其特性。方法:利用基因定点突变的方法,将MIC6蛋白羧基端(MIC6C)的348位色氨酸的碱基突变为缬氨酸的碱基,PCR扩增MIC6C W/V突变体基因片段;构建MIC6C W/V/pGEX-4T-1重组原核表达系统,IPTG诱导表达GST-MIC6C W/V突变体蛋白。以该蛋白为探针蛋白与弓形虫裂解液进行GST沉降实验,SDS-PAGE及Western blot分析。结果:获得了MIC6C W/V突变体基因片段,制备了GST-MIC6C W/V突变体蛋白;MIC6C W/V突变体蛋白的沉降产物中未见蛋白条带,而MIC6C蛋白(未突变蛋白)的产物中有一蛋白条带,且能被抗醛缩酶抗体识别。结论:在体外获得了MIC6突变体;MIC6突变体失去了与醛缩酶作用的特性。     

具有抗HIV活性的突变型天花粉蛋白TCSYFF-KR的构建及原核表达

目的：构建具有抗HIV活性的突变型天花粉蛋白（TCS）,并将其在原核系统内进行表达与纯化。方法：借助计算机预测TCS分子上可能的抗原决定簇（YFF81-83和KR173-174）,并依此设计适当的突变引物;以栝楼基因组DNA为模板,利用重组PCR技术扩增双突变型TCS全长基因,经BamHI和EcoRI双酶切后与原核表达载体pRSET-A连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及测序;将所获阳性重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行Western印迹鉴定;用Ni-NTA亲和层析柱对所获突变型TCS蛋白进行纯化。结果：构建了突变型TCSYFY-KR,并获得了该蛋白在大肠杆菌内的可溶性高效表达;经Ni-NTA亲和层析柱纯化,产生大量均一的突变型TCS蛋白。结论：TCS的定点突变及其在原核系统内的表达,为基因工程方法改造TCS提供了一条新途径。     

白色假丝酵母氟康唑耐药株的筛选

采用美国国家临床实验标准化委员会(NCCLS)推荐的最小抑菌浓度(MIC)测定方法,从保藏的50多株白色假丝酵母(Candida albicans)(均分离自临床病人)中挑选出两株氟康唑(FCZ)敏感株:编号为BMU8945(MIC值为0.125μg/ml)和BMU8977(MIC值为0.25μg/ml)。同时选择一株白色假丝酵母ATCC14053(MIC值为0.5μg/ml)作为实验原始菌株。经紫外线(UV)和硫酸二乙酯(DES)诱变后,获得近千个FCZ耐药突变菌落(MIC值在64μg/ml以上)。经传代培养,突变茵落的耐药特性能稳定遗传。     

重组K-Ras突变基因在胰腺癌Bxpc-3细胞株中的表达及其对化疗药物药效的影响

K-Ras是Ras基因家族中的一员,在细胞生存、增殖和分化过程中发挥重要作用.当Ras基因发生突变时,其表达的Ras蛋白可能被过度激活,从而导致肿瘤的产生和发展.胰腺癌中K-Ras的突变频率较高,但其对胰腺癌化疗药物药效的影响尚不明确.本文以p Ac GFP1-C3质粒为载体构建了含有5种不同基因型K-Ras序列的重组质粒,分别为野生型和G12V,G12R,G12D,G13D 4种突变型.将上述重组质粒转入人胰腺癌Bxpc-3细胞株并筛得稳转株.结果显示,转染野生型和突变型K-Ras的细胞株具有相似的生长速度,且细胞中K-Ras-GFP融合蛋白的表达量也一致.药效学研究显示,转染突变型K-Ras基因的细胞对吉非替尼、5-氟尿嘧啶、多西他赛和吉西他滨的药物敏感性降低,而对厄罗替尼和顺铂的药效则无显著影响,这可能与转染突变型K-Ras基因的细胞中K-Ras下游信号p-Akt和p-Erk的水平升高有关.此外,转染不同突变型K-Ras导致的药效及p-Akt,p-Erk的表达变化也不同.体外研究结果表明,K-Ras突变细胞对多种化疗药物的药效敏感性降低,同时不同突变型细胞之间药效也有差异,该结果有待进一步深入研究.     

人朊蛋白不同N-糖基化修饰突变体的构建及其在哺乳动物细胞中表达

构建并表达人朊蛋白N-糖基化修饰位点突变的真核表达载体,有助于进一步研究朊蛋白N-糖基化修饰的生物学功能。定点突变野生型人朊蛋白基因PRNP,将获得的突变体亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,并在人宫颈癌细胞株HeLa中瞬时表达各种朊蛋白糖基化修饰位点突变体,利用免疫印迹和糖苷酶消化等糖蛋白分析方法鉴定表达产物的糖基化形式。经Western blot鉴定,野生型和突变型朊蛋白表达产物出现不同形式的泳动特征,分别出现特异性糖基化修饰的多个条带,单糖基化修饰的两条条带和无糖基化修饰的一条条带。经PNGase F糖苷酶消化,野生型和糖基化单点突变型表达产物均能被糖苷酶消化,其分子量下移,去糖基化突变型表达产物的分子条带位置不变。通过突变野生型人朊蛋白基因PRNP的N-糖基化修饰位点,获得单糖基化修饰和去N-糖基化修饰的6种人朊蛋白突变体,并能够在HeLa细胞株中瞬时表达单糖基化修饰和去N-糖基化修饰朊蛋白,为进一步研究朊蛋白的相关功能建立良好基础。     

SEMA3C/SEMA3D基因错义突变对蛋白稳定性和受体亲合力的影响

目的:明确先天性巨结肠患者携带的5个SEMA3C/SEMA3D基因错义突变对Semaphorin 3(Sema3)蛋白自身稳定性和受体亲合力的影响作用。方法:构建Sema3-Neuropilin-Plexin配体-受体复合物蛋白质模型,对全部5个错义突变进行定位,通过计算标准能量功能赋值(△△G)和复合物界面值(△I_sc)预测突变对Sema3的影响作用。将野生型和突变型AP-tagged Sema3质粒分别转染HEK293T细胞,72 h后收集含有融合蛋白的细胞培养液上清并与分别表达Neuropilin 1(Nrp-1)或Neuropilin 2(Nrp-2)的COS-7细胞孵育,洗脱未结合的蛋白后加入碱性磷酸酶底物显色拍片,或提取细胞总蛋白,利用融合蛋白N-末端含有的碱性磷酸酶在底物PNPP存在时可以发生颜色变化的特性,对与受体结合的野生型和突变型AP-Sema3蛋白进行定量。结果:5个错义突变中的4个都会不同程度地影响相应Semaphorin 3蛋白与其受体Neuropilin的结合(与Nrp-1的结合:SEMA3C S329G,V337M,SEMA3D H424Q,V457I,P615T分别与野生型相比:1.12±0.15,0.37±0.03,0.56±0.07,0.51±0.05,0.66±0.05;与Nrp-2的结合:SEMA3C S329G,V337M,SEMA3D H424Q,V457I,P615T分别与野生型相比:1.18±0.09,0.37±0.03,0.76±0.01,0.65±0.06,0.85±0.03,n=3,单因素方差分析,差异有统计学意义),说明它们可能通过严重影响分子通路的信号转导而妨碍蛋白功能的正常行使。结论:先天性巨结肠患者携带的SEMA3C/SEMA3D基因错义突变可不同程度影响蛋白与其受体的结合,提示Semaphorin 3这类经典的神经元轴突导向因子在功能失常的情况下可能参与先天性巨结肠的发生。     

穿心莲内酯联合氟康唑抗耐药白假丝酵母菌作用机制研究

目的探讨穿心莲内酯联合氟康唑抗耐药白假丝酵母菌作用及其机制。方法采用微量稀释法检测穿心莲内酯（AG）及联合氟康唑（FLC）对耐药白假丝酵母菌的MIC;采用罗丹明6G（Rh6G）检测AG对耐药白假丝酵母菌CDR外排功能的影响;利用罗丹明123评估AG对耐药白假丝酵母菌MDR外排功能的影响：采用二氢罗丹明检测AG单用及联合FLC对耐药白假丝酵母菌活性氧（ROS）的影响;采用实时荧光定量PCR（qRT—PCR）检测AG联合FLC对耐药白假丝酵母菌外排泵相关基因CDR1、CDR2和MDR1表达的影响。结果AG联合FLC抗耐药白假丝酵母菌呈相加作用;AG对CDR外排功能无影响;AG可抑制MDR外排功能;AG联合FLC能显著提高耐药白假丝酵母菌细胞ROS水平;AG与FLC联合作用于耐药白假丝酵母菌可下调CDR1和MDR1的表达量,上调CDR2的表达量。结论AG联合FLC抗耐药白假丝酵母菌具有相加作用,其机制可能与抑制外排泵及相关基因表达,提高胞内ROS水平有关。     

EMA3C/SEMA3D基因错义突变对蛋白稳定性和受体亲合力的影响

目的：明确先天性巨结肠患者携带的5 个基因错义突变对Semaphorin 3（Sema3）蛋白自身稳定性和受 体亲合力的影响作用。方法：构建Sema3-Neuropilin-Plexin 配体-受体复合物蛋白质模型,对全部5个错义突变进行定位,通过计 算标准能量功能赋值（驻驻G）和复合物界面值（驻I_sc）预测突变对Sema3 的影响作用。将野生型和突变型AP-tagged Sema3 质粒分 别转染HEK293T 细胞,72 h后收集含有融合蛋白的细胞培养液上清并与分别表达Neuropilin 1（Nrp-1）或Neuropilin 2（Nrp-2）的 COS-7 细胞孵育,洗脱未结合的蛋白后加入碱性磷酸酶底物显色拍片,或提取细胞总蛋白,利用融合蛋白N- 末端含有的碱性磷 酸酶在底物PNPP 存在时可以发生颜色变化的特性,对与受体结合的野生型和突变型AP-Sema3 蛋白进行定量。结果：5 个错义突 变中的4 个都会不同程度地影响相应Semaphorin 3蛋白与其受体Neuropilin 的结合（与Nrp-1 的结合：SEMA3C S329G,V337M, SEMA3D H424Q,V457I,P615T 分别与野生型相比：1.12± 0.15,0.37± 0.03,0.56± 0.07,0.51± 0.05,0.66± 0.05;与Nrp-2 的结合： SEMA3C S329G,V337M,SEMA3D H424Q,V457I,P615T 分别与野生型相比：1.18 ± 0.09,0.37 ± 0.03,0.76 ± 0.01,0.65 ± 0.06,0.85± 0.03,n=3,单因素方差分析,差异有统计学意义),说明它们可能通过严重影响分子通路的信号转导而妨碍蛋白功能的 正常行使。结论：先天性巨结肠患者携带的基因错义突变可不同程度影响蛋白与其受体的结合,提示 Semaphorin 3这类经典的神经元轴突导向因子在功能失常的情况下可能参与先天性巨结肠的发生。     

玉米黑粉菌CYP51稀有密码子和mRNA二级结构分析及与杀菌剂戊唑醇分子对接

通过截短玉米黑粉菌CYP51(P450-14DM,UmCYP51)基因(去除编码跨膜区部分)和选取不同的表达载体,构建了9种重组表达质粒,在大肠杆菌中进行UmCYP51基因的表达,发现只有BL21(DE3)/pET32-Um-35重组表达工程菌获得了表达.对稀有密码子和mRNA翻译起始区二级结构进行分析,结果表明稀有密码子和mRNA翻译起始区二级结构对UmCYP51蛋白的表达都有影响.适用于稀有密码子表达的菌株Rosetta(DE3)不利于UmCYP51蛋白的表达;同时只有翻译起始区二级结构自由能值最低的重组载体pET32-Um-35可以表达.为了设计以UmCYP51为靶标的新型抗真菌抑制剂,基于最新解析的真核生物人类的CYP51晶体结构,利用同源模建的方法构建了UmCYP51的三维结构并进行了分子动力学模拟优化.通过与商品化杀菌剂戊唑醇进行分子对接获得了此类抑制剂与UmCYP51的理论结合方式,阐述了戊唑醇分子的杀菌机理,为开发新型的抗真菌抑制剂奠定了基础.     

耐氟康唑的白假丝酵母菌主动外排机制初探

目的:了解对氟康唑耐药的白假丝酵母菌主动外排系统及主动外排基因CDR1的表达水平。方法:检测氟康唑敏感性和耐药性白假丝酵母菌对罗丹明6G主动外排情况,筛选出主动外排系统功能增强的菌株;采用Northern blot技术检测主动外排系统功能增强的菌株的CDR1基因的表达。结果:在由葡萄糖提供能量的体系中,5株耐药菌株外排罗丹明6G较敏感菌株明显增加,Northern blot发现其中4株CDR1基因表达水平升高。结论:耐氟康唑白假丝酵母菌主动外排基因CDR1表达升高。     

p16抑癌基因定点突变及其在大肠杆菌中的表达与纯化

为了研究错义突变对ｐ１６功能的影响,应用ＰＣＲ体外定点突变方法对ｐ１６ｃＤＮＡ进行体外定点突变,并将野生型和突变型ｐ１６ｃＤＮＡ克隆于ｐＧＥＸ－５Ｔ载体,在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达,Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹鉴定确证表达．而后用谷胱甘肽－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化野生型和突变型ｐ１６融合蛋白．得到了第４８位密码子ＣＣＧ（Ｐｒｏ）→ＣＴＧ（Ｌｅｕ）突变的ｐ１６－Ｐ４８突变体,并在大肠杆菌中表达了４２ｋＤ的ＧＳＴ－ｐ１６和ＧＳＴ－ｐ１６Ｐ４８Ｌ融合蛋白．最后经纯化得到了野生和Ｐ４８Ｌ突变的ｐ１６融合蛋白     

V1C、G116D、N171H定点突变对黑曲霉(Aspergillus niger)XZ-3S木聚糖酶XynZF-2热稳定性的影响

[目的]探索V1C、G116D、N171H定点突变对木聚糖酶Xyn ZF-2热稳定性的作用。[方法]生物信息学方法确定木聚糖酶Xyn ZF-2可突变位点,引入Cys、Asp、His;定点突变V1C、G116D、N171H,PCR扩增突变基因xyn CDH,构建大肠杆菌表达载体,转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达目的蛋白并测定酶活,分析酶学性质。[结果]突变酶Xyn CDH的最适温度由40℃上升到45℃。40℃条件下突变酶Xyn CDH半衰期t40℃1/2由55 min延长到60 min;在45℃条件下,突变酶Xyn CDH的半衰期t45℃1/2由7min提高到15 min。[结论]定点突变V1C、G116D、N171H能增强木聚糖酶Xyn ZF-2热稳定性,为加深木聚糖酶分子改造的研究提供参考。     

二氢生物喋呤还原酶参与调控HEK293T细胞自噬作用的初步研究

目的探讨二氢生物喋呤还原酶（dihydropteridine reductase,QDPR）对HEK293T细胞自噬作用的影响。方法构建野生型QDPR和突变型QDPR重组质粒分别转染HEK293T细胞,并设空载体对照组。采用RT-PCR及Western blot方法检测空载体组,野生型QDPR组和突变型QDPR组自噬相关蛋白LC3和Beclin 1的表达量变化。结果 1）测序结果证实PCR扩增得到编码正常QDPR的cDNA序列正确以及突变的cDNA也在正确的位置突变;2）磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞后,野生型QDPR和突变型QDPR融合蛋白成功表达;3）RT-PCR结果显示,与对照组相比,野生型QDPR组LC3基因水平明显上调（P〈0.05）,突变型QDPR组LC3基因水平与对照组相比无统计学差异;与对照组相比,野生型和突变型组Beclin1基因水平无统计学差异;4）Western blot结果显示,与对照组相比,野生型QDPR组LC3-II和Beclin1的蛋白表达量明显上调（P〈0.05）,但LC3-I的蛋白表达量无统计学差异,突变型QDPR组与对照组相比LC3-I,II和Beclin1的蛋白表达量均没有统计学差异（P〉0.05）。结论二氢生物喋呤还原酶能增强HEK293T细胞自噬相关基因LC3和Beclin 1的表达,提示其可能具有激活自噬作用的功能;二氢生物喋呤还原酶93位氨基酸的突变影响了其对细胞自噬作用的调控,降低了自噬标志分子LC3-I和Beclin1的基因表达。     

定点突变Ca~(2+)平衡位点对粘质沙雷氏菌脂肪的影响

为了研究粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)脂肪酶lip A中的Ca~(2+)对酶活力的影响,采用定点突变的方法对平衡Ca~(2+)的位点D388进行定点突变,对突变体进行诱导表达后,纯化目的蛋白并进行酶学性质分析。与野生酶相比,突变酶的最适温度由40℃降低到25℃,最适p H值由8.5降到8.0,T_(1/2)值比野生酶提高了2℃。由此可知,该Ca~(2+)对脂肪酶lip A酶学性质有着至关重要的作用。