不同信号肽及分子伴侣对中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中分泌表达的影响

通过筛选5个不同的信号肽基因(AmyE、AprE、NprE、SacB、YncM)代替对照质粒pHT43-npr上原始的信号肽基因,整合2个不同的分子伴侣(PrsA、DnaK)到pHT43-npr质粒上,构建重组质粒并转化到枯草芽孢杆菌WB800N中进行诱导表达。结果表明,构建了5株信号肽重组菌株,通过牛奶平板验证无明显水解圈,通过酶活性比较,5株重组菌株中性蛋白酶活性均显著低于对照菌株;成功构建了2株整合分子伴侣的重组菌株,通过牛奶平板验证有水解圈,通过酶活性比较,两株菌株均表达中性蛋白酶,其中重组菌株WB800N/pHT43-npr-PrsA产蛋白酶活性比对照菌株WB800N/pHT43-npr提高了23%,重组菌株WB800N/pHT43-npr-DnaK产蛋白酶活性比对照菌株提高了33%。     

Bt杀虫基因在桑粒肩天牛幼虫肠道内生优势菌中的转化研究

桑粒肩天牛(Apriona germariHope,Ag)幼虫是一种营钻蛀性生活的重要林业害虫,通过传统纯培养、生理生化鉴定和16SrDNA分子生物学分析等方法分离、鉴定出其肠道优势内生菌溶血葡萄球菌(Staphylococcus haem olyticus,S.haem olytic-us)Ag06菌株和人葡萄球菌(Staphylococcus hom is)Ag08菌株。从中筛选菌株S.haem olyticusAg06进行质粒消除后作为出发菌株,利用电转化技术将含有对鞘翅目昆虫具专一性毒力B t杀虫基因cry3A的Escherichia coli-Bacillus thuringiensis穿梭表达质粒pHT305 a和pHT7911分别转入其中。经质粒稳定性试验、转化子生长特性测试等分析,结果显示cry3A基因已经成功转入Ag幼虫的优势内生菌溶血葡萄球菌中。     

乳酸菌受体菌株的筛选、鉴定及特性研究

从乳酸菌保健品中分离筛选到一株能作为受体菌的乳酸菌菌株COCC101,经鉴定为粪肠球菌(Enterococcusfaecali)。抗药性实验显示这株粪肠球菌对多数药物敏感或中度敏感;粪肠球菌中没有质粒存在,转化效率和电场强度有对应的正相关,最高达到2×104转化子/μgDNA,并且能广泛接受不同来源的质粒;在Nisin诱导下可表达外源的绿色荧光蛋白(GFP)。这些结果显示COCC101菌株在乳酸菌基因工程研究中有望成为受体菌。     

犬细小病毒VP2基因在枯草芽孢杆菌中的表达及鉴定

从犬细小病毒/犬瘟热二联苗中提取CPV基因组,根据GenBank发表的CPV-VP2基因序列设计一对引物,对VP2基因进行PCR扩增,并克隆至TA Cloning(R) Kit Dual Promoter( pCRⅡ),获得克隆栽体pCRⅡ-VP2.将重组质粒亚克隆到枯草芽孢杆菌表达载体pHT43上,获得重组表达栽体pHT43-VP2.经双酶切鉴定及序列比对分析后,将pHT43-VP2载体转化入枯草芽孢杆菌WB600中进行诱导表达,产物使用PAGE胶蛋白回收法纯化.结果表明,在69 kD处存在目的蛋白,ELISA检测发现,纯化后的目的蛋白与阳性血清存在特异性反应.     

绿色荧光蛋白基因原核表达载体的构建及其在昆虫肠道短短芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌中的表达

【目的】构建带有苏云金芽孢杆菌cry3a基因非芽孢依赖启动子和绿色荧光蛋白基因gfp(Green Fluorescent Protein)的原核表达载体,并转化从桑粒肩天牛幼虫肠道分离的两株常驻细菌短短芽孢杆菌CQUBb和苏云金芽孢杆菌CQUBt,以检测cry3a启动子在昆虫肠道常驻菌中的启动子活性,获得GFP标记菌株,为常驻菌在昆虫幼虫肠道中的定殖情况和杀虫工程菌的构建奠定基础。【方法】采用重叠延伸PCR将cry3a基因启动子和gfp基因进行融合,并与pHT304载体连接构建重组质粒pHT3AG,获得的重组质粒以电脉冲转化肠道常驻菌短短芽孢杆菌CQUBb和苏云金芽孢杆菌CQUBt,于可见光和荧光显微镜下观察荧光并通过SDS-PAGE分析重组菌株的蛋白表达情况,然后对重组菌株进行生长动力学分析和稳定性测试。【结果】重组菌在营养期大量组成型表达GFP,经电泳分离在凝胶上出现约29kDa的特异蛋白条带;重组菌生长曲线与出发菌没有显著差异,说明外源质粒未对宿主菌的生长带来明显不利影响;抗性条件下传代30次后两菌株外源质粒稳定性仍可达95%、67%;两个菌株比较,CQUBb比CQUBt质粒转化率高、重组菌GFP表达时间长、表达量大,并且重组菌株稳定性好。【结论】成功地将cry3a基因核心启动子和gfp基因转入桑粒肩天牛幼虫肠道常驻菌,实现了该启动子在Bt之外的菌株中发挥作用,构建了两个GFP标记菌株;重组基因工程菌株表达量大,稳定性好,可以用作昆虫肠道内微生态研究和芽孢杆菌表达系统以及杀虫菌株的构建。     

B.t.c. cry1C全长基因的克隆及其在增产菌中的表达*

设计的一对引物 ,对苏云金芽孢杆菌科默尔亚种 (Bacillusthuringiensissubsp .colmeri)1 5A3菌株中的cry1C基因进行PCR扩增 ,得到包括结构基因 ,调节基因在内的全长为40kb的PCR产物。经两步克隆 ,将此基因连接至穿梭表达载体pHT315上 ,得到重组质粒pHT 1C。通过电转化将其导入一株增产菌蜡状芽孢杆菌 (Bacilluscereus) 9509菌株 ,SDS-PAGE检测到 1条 60kD左右的蛋     

苏云金素合成基因簇中非核糖体肽合成酶基因thu2功能的初步分析

对苏云金素生物合成基因簇中编码非核糖体肽合成酶基因thu2进行基因缺失插入失活的研究。用温敏型质粒pHT304-TS构建基因thu2的插入缺失质粒pEMB1434,电转化苏云金芽胞杆菌菌株CT-43后,通过抗性筛选和PCR验证得到thu2基因同源双交换基因敲除突变株CT-43-22。HPLC(高效液相色谱,High Performance Liquid Chromatography)检测发现CT-43-22没有苏云金素特征吸收峰;用pHT304构建得到含有完整thu2基因的回补质粒pEMB1435,电转化CT-43-22后得到互补重组菌CT-43-22b,发现其恢复了苏云金素的产生。显微镜观察突变株和互补重组菌均能产生正常的晶体和芽胞。thu2的基因敲除和基因互补实验证明,thu2基因为CT-43苏云金素生物合成的必需基因,但对晶体和芽胞的形成没有影响。     

EcbCSL101菌株hrpN基因的克隆、表达及HarpinEcbCSL101蛋白的生物学活性

胡萝卜软腐欧文氏茵甜菜亚种(Erwinia carotovora subsp.betavasculorum)EcbCSL101菌株具有很强胞外酶分泌活性,接种非寄主植物烟草引起过敏反应.Southern blotting结果表明EcbCSL101菌株中含有hrpN基因.PCR扩增含EcbCSL101完整开放阅读框的DNA片段并克隆到表达载体pET28a( )中.核苷酸序列分析表明,EcbCSL101菌株的hrpN基因的ORF为1113 bp,编码36.65 kD HarpinEcbCSL101蛋白(GenBank,DQ355519),与其它几种软腐欧文氏菌Harpin蛋白有较高的同源性.将含有hrpNEcbCSL101基因的重组质粒转化到大肠杆菌JM109(DE3)中进行表达,纯化后的HarpinEcbCSL101能诱导烟草发生过敏反应.     

多粘芽孢杆菌质粒的研究——Ⅱ.多粘芽孢杆菌原生质体形成、再生与转化

多粘芽孢杆菌P250-2完整菌体不能作为质粒DNA的转化受体,但其质粒消除菌株P_0250-5制成的原生质体,可接受多粘芽孢杆菌的pBD2502及枯草杆菌的pUB110质粒DNA转化。在高渗蔗糖再生培养基上,原生质体再生率为20％左右,形成率在95％以上。在含新霉素(10μg/ml)、青霉素(25μg/ml)、四环素(12.5μg/ml)的高渗蔗糖再生培养基上分别获得了转化子。多粘芽孢杆菌的转化频率为3.29×10~(-3),枯草杆菌为4.4×10~(-4)。转化子的形态表现、生化特性和抗菌谱与给体菌株一致,表明多粘芽孢杆菌株间及多粘芽孢杆菌和枯草杆菌种间的质粒可以进行转化。     

EcbCSL101菌株hrpN基因的克隆、表达及HarpinEcbCSL101蛋白的生物学活性

胡萝卜软腐欧文氏菌甜菜亚种(Erwinia carotovora subsp. betavasculorum) EcbCSL101菌株具有很强胞外酶分泌活性, 接种非寄主植物烟草引起过敏反应。Southern blotting结果表明EcbCSL101菌株中含有hrpN 基因。PCR扩增含EcbCSL101完整开放阅读框的DNA片段并克隆到表达载体pET28a(+)中。核苷酸序列分析表明, EcbCSL101菌株的hrpN 基因的ORF为1113 bp, 编码36.65 kD HarpinEcbCSL101蛋白(GenBank, DQ355519),与其它几种软腐欧文氏菌Harpin蛋白有较高的同源性。将含有hrpNEcbCSL101基因的重组质粒转化到大肠杆菌JM109(DE3)中进行表达,纯化后的HarpinEcbCSL101能诱导烟草发生过敏反应。     

稳定表达MVA途径基因提高番茄红素产量

萜类化合物的直接前体物质异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)可以由2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途径(MEP途径)和甲羟戊酸途径(MVA途径)合成。在已经优化MEP合成途径、番茄红素合成途径关键基因表达的重组大肠杆菌LYC101中,引入MVA途径基因,进一步提高重组大肠杆菌合成萜类化合物的能力。质粒pALV23和pALV145是本实验室在研究MVA途径基因协调表达时,用核糖体结合位点(RBS)文库连接MVA途径各基因构建质粒文库,而筛选到的有效提高β-胡萝卜素产量的质粒。首先比较了两个质粒分别在低产和高产番茄红素的菌株中对番茄红素合成的影响。结果表明,两个质粒在高、低产番茄红素的菌株中都可以有效提高番茄红素产量。在高产菌LYC101中pALV23比pALV145使番茄红素产量更高。然后,用CRISPR-Cas9系统辅助同源重组的方法,将MVA途经基因和启动子一共6.7kb的条带整合到LYC101菌株的染色体上,得到遗传稳定的菌株LYC102。LYC102的番茄红素产率达40.9mg/g,是出发菌株LYC101产率的2.19倍,比用质粒表达MVA途径基因的菌株提高了20%。在重组大肠杆菌中同时表达MVA途径和MEP途径,可以有效提高萜类化合物产率;文中构建了不含质粒的、遗传稳定的高产番茄红素菌株,为产业化合成番茄红素提供基础;同时构建平台菌株,可以用于其他萜类化合物合成。     

应用电激法在大肠杆菌中导入外源性DNA

本文报道用国产基因导科脉冲仪(LN－101型),采用高压脉冲电场,将质粒DNA和噬菌体DNA成功地转化或转导人大肠杆菌。该电场单次电压脉冲范围1．Okv一2．5kv(初电场强度2,8kV／cm一16kV／cm)、电容范围5—20μF,用质粒pUC18和受体菌株DH5α,获得10　9－10　10转化子／μgDNA。电场强度、电容及脉冲时间等不同的因素影响转化效率。转化率与DNA的强度呈线性关系,与受体细胞密度成正比。 DNA和受体菌混合物在电激前,后的孵育时间,对转化效率影响不明显。用噬菌体M13mp 19 RF及受体菌株JMl09,同样可获得较高的转化效率。     

插入烟草叶绿体启动基因片段的重组质粒转化大肠杆菌和枯草杆菌感受态与原生质体的比较

大肠杆菌(E.coli)N100携带的pK01-26质粒插入烟草(Nicotiana tobacHm var.)叶绿体启动基因片段的重组质粒。该质粒以大肠杆菌HB101为受体可以再转化,转化频率为4.93×10^-6,以枯草杆菌168为受体不能实现转化。上述两种受体菌株的原生质体,经处理,再生细胞壁后,分别获得转化子。经原生质体转化,以大肠杆菌HB101为受体的转化频率为2.7×10^-4频率为2.6×10^-5。以H     

一株高效降酚菌的质粒特性及柠檬酸细菌表达的研究

在焦化废水处理厂的活性污泥中筛选的降酚效果较好的菌株H,研究其质粒特性并提取其降解质粒将其转入柠檬酸细菌进行表达。结果表明H菌株具有质粒,且质粒片段较大最大的超过10 kb,最小的2 kb左右。通过SDS和原生质体再生法分别对H菌进行质粒消除,结果发现质粒去除的菌株降酚能力也随之消失。说明H菌株的质粒上有控制酚降解基因存在;提取H菌的质粒将其转入柠檬酸细菌进行表达,获得了转化子。转化子具有较好的降酚效果12 h可达77.34%,但转化子的降解速率较小。另证明了转化子内含有与H菌株相同特性的质粒得到具有降酚能力的柠檬酸细菌表达体系。     

苏云金芽胞杆菌中荧光分析融合杀虫晶体蛋白的形成

为研究苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白在细胞中的定位及在细胞中的形成, 构建了Cry1Ac-GFP融合蛋白, 大小约为160 kD. 将携带cry1Ac启动子的cry1Ac-gfp融合基因片段克隆到pHT304载体上, 获得融合表达载体pHTcry1Ac-gfp. pHTcry1Ac-gfp转化到无晶体突变株HD-73 cry-中, 获得融合表达菌株HD-73-(pHTcry1Ac-gfp). gfp基因通过同源重组插入到HD-73内源大质粒pHT73上cry1Ac基因的3′端, 获得原位融合表达菌株HD-73Φ(cry1Ac-gfp)3534. 激光共聚焦显微镜和Western杂交分析表明, 不对称隔膜形成时, HD-73-(pHTcry1Ac-gfp)和HD-73Φ(cry1Ac-gfp)3534细胞中检测到Cry1Ac-GFP融合蛋白的表达. 融合蛋白颗粒在细胞中的聚集存在一定的极性, 分布于母细胞不对称隔膜附近. Cry1Ac-GFP和Cry1Ac蛋白对小菜蛾的杀虫活性在95%置信区间内没有明显差异.     

转录因子cpcR同源基因cpcR-c1和cpcR-t的功能鉴定

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt） LM1212菌株与典型的Bt菌株表型不同,可分化形成芽胞、形成细胞和晶体产生细胞。在LM1212菌株中,转录因子CpcR不仅参与了细胞分化过程,而且能够激活晶体蛋白基因cry35-like的启动子(P₃₅)。【目的】筛选cpcR同源基因,验证其生物学功能。【方法】本研究克隆了2个cpcR同源基因,来源于蜡样芽胞杆菌的cpcR-c1和来源于东洋芽胞杆菌的cpcR-t,将cpcR及其同源基因分别构建在pHT304-P₃₅-gfp、pHT304-P₃₅-lacZ报告载体上,获得的重组质粒转入无cpcR基因且无晶体蛋白基因的Bt HD73^–菌株中。利用激光共聚焦显微镜观察重组菌HD^–(cpcR-c1-P₃₅-gfp)和HD^–(cpcR-t-P₃₅-gfp)的细胞表型并进行芽胞计数实验。测定HD^–(cpcR-c1-P_35<...     

甾醇酰基转移酶基因高表达对酵母菌麦角甾醇合成的影响

通过PCR扩增克隆到含酵母菌甾醇酰基转移酶基因ARE2编码序列和上游调控序列的DNA片段ARE21及仅含编码序列的DNA片段ARE22。分别以ARE2启动子,乙醇脱氢酶基因ADH1启动子和铜抗性基因CUP1启动子及ADH1终止子为调控元件构建了酵母菌表达质粒pHX2,pHXA2和pHXC2。表达质粒分别转化酿酒酵母单倍体菌株YS58和以前通过细胞杂交构建的麦角甾醇高产菌株YEH56。通过营养缺陷互补和铜抗性筛选到转化子,质粒上的ARE2基因在YS58和YEH56中都实现了活性表达,使细胞内甾醇酯化水平升高,并导致细胞麦角甾醇含量的提高。对转化菌株的培养条件进行了初步研究,在优化条件下,重组转化菌株YEH56(pHX2)、YEH56(pHXA2)和YEH56(pHXC2)的麦角甾醇含量分别是受体菌YEH56 的13、13和14倍。     

柯萨奇病毒B3 cDNA生物素探针的制备研究

本文将柯萨奇B组3型病毒(CVB3)cDNA的重组质粒DNA(pGP51B)转化到E.coli HB101菌株中.筛选转化阳性菌株,经培养扩增后,提取重组质粒DNA,用缺口求移法制备生物素标记探针,通过原位杂交技术检测CVB1.CVB3感染的Hela细胞及正常Hela细胞对照.结果该探针只与CVB杂交,而不与细胞对照杂交,且可检测出病毒感染5h尚未出现病变细胞中的病毒核酸.表明该探针具有良好的特异性和敏感性.     

Bt4.0718 cry1Ac基因的克隆与表达分析

在基因库中比对14种cry1Ac基因序列,发现了同源性很高的上游启动子区域和下游终止子区域。根据这一同源序列设计引物,从B t4.0718中扩增出包含双启动子和终止子的4.2 kb片段,用PCR-RFLP检测确定其中含有cry1Ac基因。然后将此片段克隆到穿梭载体pHT304中,转化大肠杆菌DH5α和B t无晶体突变株XZM-101。同时,利用原子力显微镜观察发现重组菌株BXZM34能够产生菱形晶体。     

一株产ε-聚赖氨酸的白色链霉菌遗传转化体系

为了更好地研究ε-聚赖氨酸(ε-PL)生物合成的分子机制以及构建ε-PL高产基因工程菌株,拟建立一株ε-PL产生菌株Streptomyces albulus PD-1的遗传转化体系。通过对培养基类型、孢子预萌发处理、培养基中Mg2+浓度等条件进行考察,以Escherichia coli ET12567(p UZ8002)为供体菌,成功地将p IB139质粒导入S.albulus PD-1中。结果表明:质粒转化效率达到(3±0.4)×10-6个接合转化子/受体。接合子传代实验和PCR结果发现,p IB139质粒能够稳定整合在S.albulus PD-1染色体的att B位点上。本研究建立了一株ε-PL生产菌株的遗传转化体系,为从分子水平上研究ε-PL的合成及ε-PL高产菌株的构建奠定了基础。