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日本血吸虫中国大陆株28kDa GST基因在大肠杆菌中的表达 总被引:11,自引:0,他引:11
在大肠杆菌TB1中表达含日本血吸虫中国大陆株28kDa抗原基因的重组质粒,表达产物是融合蛋白,分子量来33kDa。采用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱纯化表达产物。2,4-二硝基氯苯/谷胱甘肽分光光度测定法和琼脂糖-淀粉凝胶电泳显示重组抗原具有较高的谷胱甘肽S-转移酶活力。 相似文献
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日本血吸虫中国大陆株22.6kD膜相关蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌?… 总被引:1,自引:0,他引:1
以日本血吸虫mMRA为模板,用RT-PCR法快速克隆到一大小约600bp的DNA片段,DNA序列分析证实,所扩增到的DNA片段中含有日本血吸虫22.6膜相关蛋白基因,将该基因重组到表达型质粒pGEX-4T中,表达的GST融合蛋白分子量约48kD,用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化的重组蛋白不仅纯度好,而且得率高,纯化产量可达40mg/L培养物,免疫试验结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性,为其在血吸 相似文献
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羧端部分缺失的HCV核心蛋白的融合表达,免疫原性及其应用 总被引:1,自引:0,他引:1
构建了丙型肝炎病毒核心蛋白的全长及N端和N端与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的融合表达克隆,比较了在不同大肠杆菌中的表达。表达蛋白为水溶性,经ELISA和蛋白质印迹分析,GSTC191的表达和稳定性都较差,GSTC69和GSTC40具有良好的稳定性,用GST亲和柱一步纯化,纯度可达90%,免疫小鼠可产生高滴度的抗体。应用表达的GSTC69和GSTC40抗原,检测人血清中的HCV核心蛋白抗体,初步结果 相似文献
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日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因的克隆及其在大肠杆 … 总被引:3,自引:2,他引:3
用PCR法从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中快速克隆出一大小为600bp左右的DNA片段,DNA序列分析证实,所扩增到的DNA片段中含有日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(Sj-14FABPc)基因,将该基因重组到表达型质粒pGEX-2T中,表达的GST融合蛋白分子量是41kD,用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化的重组蛋白不仅纯度好,而且得率高,纯化产量可达25mg/L培养物,免疫试验结果表明该重组蛋 相似文献
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小麦丛矮病毒M蛋白基因的序列测定,表达和鉴定 总被引:2,自引:2,他引:0
从小麦丛矮病毒(WRSV)基因文库含磷蛋白NS基因的质粒中,经亚克隆、测序,得到NS蛋白基因的下游序列,其中含有一读框453nt、编码一分子量约17kD蛋白。用PCR方法获得该读框全长片段并克隆到表达载体pGEX-3X,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以IPTG诱导表达,产物由谷胱甘肽S-转移酶(GST)亲和层析柱纯化后,用蛋白质印迹分析鉴定,结果表明,该读框为编码病毒基质蛋白M的基因。 相似文献
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日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 总被引:5,自引:0,他引:5
用PCR法从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中快速克隆出一大小为600bp左右的DNA片段,DNA序列分析证实,所扩增到的DNA片段中含有日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(Sj-14FABPc)基因,将该基因重组到表达型质粒pGEX-2T中,表达的GST融合蛋白分子量是41kD,用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化的重组蛋白不仅纯度好,而且得率高,纯化产量可达25mg/L培养物,免疫试验结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性,为其用作疫苗分子创造了条件。 相似文献
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以日本血吸虫mRNA为模板,用RTPCR法快速克隆到一大小约600bp的DNA片段,DNA序列分析证实,所扩增到的DNA片段中含有日本血吸虫226膜相关蛋白(Sj226(Ch))基因,将该基因重组到表达型质粒pGEX4T中,表达的GST融合蛋白分子量约48kD,用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化的重组蛋白不仅纯度好,而且得率高,纯化产量可达40mg/L培养物,免疫试验结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性,为其在血吸虫病抗感染中的免疫作用研究创造了条件。 相似文献
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吲哚3甘油磷酸合酶(IGS,indole3glycerolphosphatesynthase,EC4.1.1.48)在色氨酸与吲哚乙酸的生物合成途径中,催化生成吲哚3甘油磷酸。研究该基因的表达调控,对于阐明高等植物是如何调控色氨酸及生长素合成是十分重要的。利用已克隆的IGScDNA,构建了谷胱甘肽转移酶(GST,glutathioneStransferase,EC2.5.1.18)与吲哚3甘油磷酸合酶融合蛋白的表达质粒,并将其导入到在异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下能高效表达的IGS基因缺陷菌株trpC9800λKC大肠杆菌中。高表达的融合蛋白通过谷胱甘肽琼脂糖(glutathioneagarose)亲和层析和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后,用以免疫兔子制备抗血清。免疫印迹法分析表明拟南芥(Arabidopsisthaliana(L.)Heynh.)四种常用生态型只合成一种分子量约为40kD的吲哚3甘油磷酸合酶蛋白。在Ag+、紫外线等逆境条件下,IGS含量都有较大幅度的增加,这说明IGS可能与植物的防御反应紧密相关。 相似文献
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日本血吸虫中国大陆株TPI基因的克隆及其表达产物特性 总被引:2,自引:2,他引:2
磷酸丙糖异构酶(TPI)是血吸虫病疫苗重要的候选抗原基因之一。参考日本血吸虫已发表的TPIcDNA序列,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板,用RT-PCR法快速克隆出一大小约800bp的DNA片段。DNA序列分析证实,所扩增到的DNA片段即为日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶(SjTPIc)基因。将该基因重组到表达型质粒pGEX-4T中,表达的GST融合蛋白分子量约54kD。用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化的重组蛋白不仅纯度好,而且得率高,纯化产量可达30mg/L培养物。免疫试验结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性,是一种较为理想的抗原分子。 相似文献
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基因工程表达产物的体外酰胺化加工 总被引:5,自引:0,他引:5
以C端为甘氨酸的修饰型人降钙素(mhCT-Gly)的融合蛋白为底物和利用重组酰胺化酶,研究建立基因工程表达产物的体外酰胺化加工系统。首先,人工合成mhCT-Gly基因,并构建其融合表达质粒pGEXCT,在大肠杆菌中获得了高效表达并通过新和层析分离纯化获得谷胱甘太S-转移酶(GST)融合蛋白(GST-mhCT-Gly)。同时,从稳定表达在鼠酰胺化酶的CHO细胞株中制备了重组酶腕化酶。然后,利用此重组 相似文献
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p16抑癌基因定点突变及其在大肠杆菌中的表达与纯化 总被引:1,自引:0,他引:1
为了研究错义突变对p16功能的影响,应用PCR体外定点突变方法对p16cDNA进行体外定点突变,并将野生型和突变型p16cDNA克隆于pGEX-5T载体,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达,Western印迹鉴定确证表达.而后用谷胱甘肽-Sepharose4B亲和层析纯化野生型和突变型p16融合蛋白.得到了第48位密码子CCG(Pro)→CTG(Leu)突变的p16-P48突变体,并在大肠杆菌中表达了42kD的GST-p16和GST-p16P48L融合蛋白.最后经纯化得到了野生和P48L突变的p16融合蛋白 相似文献
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大分子量重组蛋白在丝状噬菌体表面的展示表达及其与小分子相互作用的初步研究 总被引:3,自引:0,他引:3
利用pHEN1KM13噬菌粒系统表达融合蛋白,进而确定大分子量重组蛋白在丝状噬菌体表达的部位及其表达后的生物活性。通过蛋白酶切处理前后噬菌体侵染细菌能力的变化快速地检测大分子蛋白质能否在噬菌体表面展示表达;比较了谷胱甘肽S转移酶及其与三个不同长度连接臂融合的外源蛋白在噬菌体表面的表达和组装,确定了不大于40kD的重组蛋白分子能展示表达在丝状噬菌体表面;并利用已知的小分子化合物与蛋白质的相互作用证明了组装在噬菌体表面的谷胱甘肽S转移酶重组蛋白仍保持其天然的结合活性,为利用噬菌体展示系统研究蛋白质与小分子化合物的相互作用建立了基础。 相似文献
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人谷胱甘肽硫转移酶A1在乳酸乳球菌中的表达及活性研究 总被引:11,自引:0,他引:11
用RTPCR技术从人肝总RNA中分离扩增了人谷胱甘肽硫转移酶A1基因的cDNA序列,克隆至大肠杆菌表达质粒pET23b,采用蛋白表达筛查法及DNA测序证明该cDNA序列完全正确。重组质粒pET23bhgst转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导获得高效表达的可溶性hGSTA1产物,其表达量约为大肠杆菌可溶性总蛋白的40%。将hGSTA1cDNA亚克隆至乳酸乳球菌表达载体pMG36e,电穿孔法转化乳酸乳球菌MG1363获得hGSTA1乳酸乳球菌表达株。SDSPAGE及Western杂交分析表明该菌株表达预期大小的hGSTA1融合蛋白,经谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化获得的hGSTA1蛋白具有较高的谷胱甘肽硫转移酶活性。具hGSTA1酶活性的乳酸乳球菌工程菌可望应用于研制防癌保健乳制品。 相似文献
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以日本血吸虫成虫RNA为模板逆转录合成cDNA链,设计合成引物,用PCR法扩增谷胱甘肽转移酶(GST) 基因编码序列,将其克隆入pGEM—T载体,并进行初步鉴定。pGEM—T—GST克隆载体的成功构建,为进一步选择在不同表达系统中表达GST及其在血吸虫病免疫诊断、免疫预防中的作用研究提供了条件 相似文献
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从大鼠的肝脏克隆胰岛素受体底物1(IRS-1)的PH结构域基因并进行谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合表达,研究该结构域与蛋白激酶C(PKC)的结合情况,并为进一步寻找其新配基打下基础,研究采用一步法从大鼠新鲜肝组织中提取总RNA,以RT-PCR的方法扩增目的基因片段,测序证明序列正确,再将正确的目的基因片段定向克隆到表达载体pGEX-4T-1中,以IPTG在26℃下诱导,获得与GST的融合表达,表 相似文献
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化学合成虎纹捕鸟蛛毒素—Ⅰ基因的克隆和表达 总被引:2,自引:0,他引:2
本文报道了全化学合成虎纹搏鸟蛛毒素-Ⅰ基因在大肠杆菌中的表达,表达产物为N-端是谷胱甘肽硫转移酶的融合蛋白。经GSH-Sepharose 4B亲和层析纯化,凝血酶酶解融合蛋白,得到重组HWTX-Ⅰ(rHWTX-Ⅰ)。普和氨基酸顺序分析均表明rHWTX-Ⅰ系正确表达产物。还原复性的rHWTX-Ⅰ表现出与天然HWTX-Ⅰ生物学活性的一致性。 相似文献
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酵母转录因子PHO81蛋白含有6个锚蛋白重复序列。将PHO81锚蛋白重复序列与谷胱甘肽转移酶(GST)融合表达(GST-ANK),表达产物以包含体形式存在。利用氧化型和还原型谷城肽系统对包含体进行复性,得到了可溶性蛋白,亲和纯化后,进行了活性分析。通过免疫共沉淀、分别制备了PHO85-PHO80和PHO85-PAP1激酶复合物,用重组的PHO4蛋白作底物,在激酶反应体系中加入GST-ANK,发现它 相似文献
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GST-HRB融合蛋白的表达与纯化 总被引:1,自引:0,他引:1
构建GST-HRB重组质粒,进行融合蛋白的表达、纯化及鉴定.利用PCR扩增及基因重组技术,以pcDNA-3.1-HRB为模板扩增出HRB全基因序列,并将其插入带有GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签的原核表达载体pGEX-6P-1中,构建GST-HRB融合蛋白表达质粒.然后,将重组质粒GST-HRB转化至大肠杆菌Rosseta进行融合蛋白的表达.利用GST琼脂糖珠进行融合蛋白的纯化,最后应用SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定纯化的融合蛋白.结果表明,成功构建pGEX-6P-1-HRB原核表达载体,表达及纯化了GST-HRB融合蛋白. 相似文献
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昆虫谷胱甘肽S-转移酶分离纯化的新方法 总被引:4,自引:0,他引:4
周先碗 《中国生物化学与分子生物学报》1999,15(2):269-273
谷胱甘肽S-转移酶(glutathioneS-transferases,GST)是一类具有多种生理功能的同功酶.从蜡螟幼虫(Galeriamelonela)的提取液中分离纯化谷胱甘肽S-转移酶的基本方法如下:首先将冷冻的蜡螟幼虫在磷酸缓冲液中匀桨,经10000g和100000g分级离心;取上清液通过QAE-SephadexA-25离子交换柱层析除去部分色素和杂蛋白;然后采用谷胱甘肽-琼脂糖凝胶亲和层析(GSH-QT4),四溴酚酞二磺酸盐-琼脂糖凝胶亲和层析(BSP-QT4),铜离子-琼脂糖凝胶螯合层析(Cu2+-QT4)及PBE94-Sepharose(PBE94)聚焦层析等层析技术进一步分离纯化.将上述方法获得的色谱峰以CDNB和DCNB为底物检测生物活性.具有生物活性部分的蛋白质,通过SDS-PAGE测定其分子量.实验结果表明,采用GSH-QT4亲和层析法获得的活性峰,在SDS-PAGE图谱上呈现出两条带,分子量为24kD,24.5kD左右;Cu2+-QT6螯合层析法分离的活性峰,呈现出一条带,分子量为24kD左右;PBE94-聚焦层析法分离获得三个活性峰:第一色谱峰,呈现出一条带,分子量为23kD左右 相似文献